Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme

Özet

Bu yöntem, r26R-Konfeti (Konfeti) fare modelinin mineralize dokuları incelemek için kullanımını açıklar ve üreme stratejisinden görüntü edinimiiçin tüm adımları kapsamaktadır. Dahil tüm yumuşak dokulara uygulanabilir genel bir protokol ve mineralize dokulara uygulanabilir değiştirilmiş bir protokoldür.

Özet

Hangi hücre türlerine yol açabileceğini izlemek ve organizma üzerinden göçünü izlemek ya da uzun ömürlülüğünü belirlemek için vücuttaki tek bir hücreyi etiketlemek doku geliştirme ve bakım mekanizmalarını ortaya çıkarmak için güçlü bir yol olabilir. In vivo hücreleri izlemek için mevcut en önemli araçlardan biri Konfeti fare modelidir. Konfeti modeli, hücre tipine özgü çeşitli floresan proteinlere sahip canlı farelerdeki tek tek hücreleri genetik olarak etiketlemek ve onların kaderini ve zaman içinde nesillerinin kaderini klonal genetik izleme adı verilen bir süreçte izleyebilir veya klonal soy izleme. Bu model neredeyse on yıl önce oluşturuldu ve özellikle kök hücre biyolojisi, gelişimi ve yetişkin dokularının yenilenmesi ile ilgili birçok biyolojik sürecin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Ancak, görüntü toplama ve çeşitli floresan sinyalleri eşzamanlı yakalama kadar floresan sinyali korumak teknik olarak zor, mineralize doku için özellikle. Bu yayın, herhangi bir mineralize veya mineralize olmayan dokuya uygulanabilir büyüme plaka kıkırdağı analiz etmek için Konfeti modeli kullanmak için bir adım adım protokol açıklar.

Giriş

Hücre davranışını izlemek için geliştirilmiş yöntemler hayvan modelleri kullanırken deneysel verimliliği artırmak için arzu edilir. Vivo hücre davranışını izlemek için en bilgilendirici yaklaşımlardan biri çok renkli muhabir fare suşları ile klonal soy izleme¹, yaygın olarak kullanılan R26R-Konfeti dahil (Konfeti) fare². Genetik olarak floresan proteinler ile tek tek hücreleri etiketleme ve zaman içinde bu hücreleri takip ederek, birçok alanda araştırmacılar farklı biyolojik sistemlerin çok sayıda içine anlayışlar ortaya konfeti fare kullandık.

Konfeti fare, Cre bağımlı DNA rekombinasyon bir stokastik şekilde birkaç olası floresan proteinlerin kalıcı ifade neden olduğu bir loxP tabanlı muhabir^{sistemidir 2}. R26R-Konfeti alel her yerde ifade CAGG organizatörü içerir, hangi bir loxP-kanatlı Neo^R-kaset hemen upstream yatıyor², olan poliadenilasyon sırası transkripsiyon sona erer³, takip Brainbow 2.1 yapı⁴. Bu nedenle, Cre aracılı rekombinasyon aynı anda Neo^R-kaseti uyarır ve Brainbow 2.1 yapısının hangi kısımlarının eksiretlendiğine bağlı olarak bazı floresan proteinlerin üretimine yol açar. Bu özellik Konfeti fareyi son derece uyarlanabilir hale getirir, çünkü belirli bir Cre türünün kullanılabildiği bir faredeki herhangi bir hücresel popülasyonu hedeflemek için kullanılabilir. R26R-Konfeti suşu ile dokuya özgü cre suşunun geçişi etiketlemenin özgüllüğünü sağlar. Ancak, Cre suşu da indüklenebilir olmalıdır (örneğin, CreERT veya CreERT2, onları çekirdek girmek ve DNA rekombinasyon neden izin vermek için tamoksifen bağlanması gerektiren⁵⁾böylece etiketleme belirtilen zaman noktalarında elde edilebilir. Böylece, hücresel popülasyon, elde edilen CreERT-pozitif/Konfeti pozitif yavrulara istenilen zaman noktasında tamoksifen enjekte edilerek etiketlenebilir ve ilgi dokularının analiz için toplanabileceği belirli bir yaşa kadar izlenebilir. Doku işleme den sonra, floresan etiketli hücreler konfokal mikroskopi ile doğrudan görüntülenebilir, böylece başlangıçta etiketlenmiş her hücrenin soyundan ayrılabilmek için, kendi özel floresanlarına göre başka bir etiketli hücre tarafından oluşturulan dölden ayrılabilir. etiketler, böylece klonalitenin değerlendirilmesine izin verir (yani, klonal genetik izleme).

Konfeti modelinin esnekliği nedeniyle, sağlık ve hastalık^2,6,7,8,9birçok farklı dokuların geliştirilmesi ve bakımı çalışması için uygulanmıştır , ^10,11. Modeli kullanmanın yaygın bir yolu, belirli bir hücre popülasyonunu etiketlemek ve hangi dokulara (ve/veya soylarının) katkıda bulunduğunu belirlemektir. Bu yaklaşımı kullanarak böyle bir bulgu yetişkin diş glial kökenli hücrelerden oluşur oldu⁶. Modelin bir diğer uygulaması kök hücre homeostazçalışmasıdır. Örneğin, Konfeti modeli bazı kök hücre klonları kök^hücre2 arasındaki rekabet sırasında baskın olduğu için bağırsak mahzenlerinde kök hücre nişleri yavaş yavaş monoklonal hale ortaya koymuştur . Model aynı zamanda hücre çoğalmasını değerlendirmek için de kullanılabilir, hangi özellikle yavaş yavaş hücreleri bölen çalışma için yararlıdır. Örneğin, eklem kıkırdağı¹² klonal oluşumu değerlendirildi ve beş haftalık farelerde büyüme plaka kondrositler üzerinde bir kirpi antagonisti kısa vadeli etkileri¹³çalışıldı .

Konfeti modelinin göreceli basitliğine rağmen, floresan sinyal, özellikle mineralize dokuları analiz ederken, görüntü koleksiyonuna kadar korumak için teknik olarak zor olabilir. Burada protokol, konfeti fareyi doğum sonrası kemikle (6 aya kadar) kullanmak için optimize edilmiş bir modeli tanımlayarak floresan proteinlerin immünoalgılamaya gerek kalmadan konfokal mikroskopi ile doğrudan görüntülemesini sağlar. Bu basitleştirilmiş protokol mineralsiz dokulara uygulanabilir. Ayrıca, en az 3 yıl uzun bir süre için floresan sinyali korumak için örnekleri saklamak için nasıl bir açıklama dahildir. Protokolün anahatları Şekil 1'desunulmuştur.

Protokol

Tüm fare çalışmaları Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Stockholm Kuzey Komitesi/Norra Djurförsöksetiska Nämd) tarafından onaylanmış ve İsveç Hayvan İdaresi'nin Hayvan Deneyleri Hükümleri ve Yönergeleri uyarınca yürütülmüştür.

1. Fare ıslahı

1. Gerilimi oluşturmak için, Cre'nin ilgi alanıyla R26R-Konfeti faresini geçin. 21 günlükken yavruları wean.
   NOT: Fareler yaklaşık 8 haftalık tan itibaren veya yerel kurallara göre üremek için kullanılabilir. Genotipleme (burada tanımlanmamış) kesişmede toplanan biyopsilerden yapılabilir. Kesişme yaşı yerel kurallara göre ayarlanabilir.

2. Konfeti etiketleme

NOT: Bu etiketleme stratejisi tamoksifen indükleyici Cre suşları için uygundur.

1. Bir cam şişemısır yağı 2.5 mg / mL tamoksifen kadar bir çözüm hazırlayın. Bir fırında 37 °C'ye kadar ısıtılarak 60 dakika kadar eritin, toz eriyene kadar her 5 dakikada bir girdap kullanarak çalkalayın.
   NOT: Artan dozlarda tamoksifen için 20 mg/mL'ye kadar çözeltiler bu yöntemle hazırlanabilir.
2. Işıktan korunan 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
3. İlk doğum günü (P1) mısır yağı intraperitoneal olarak çözünmüş 2.5 mg/mL tamoksifen 50 μL uygulanarak rekombinasyon indüklemek.
   NOT: Prensip olarak, tamoksifen herhangi bir yaşta uygulanabilir, F1 nesil gibi erken. Tamoksifen dozu Cre ekspresyonu, fare yaşı ve deneysel uygulamaya göre çeşitlendirilmelidir. Daha fazla bilgiyi tartışma bölümünde bulabilirsiniz. Aynı şekilde tedavi cre negatif fareler Konfeti floresan sinyalleri için negatif kontrol olarak kullanılabilir.
   DİkKAT: Hayvan işleyicilerinin tamoksifen kullanımı konusunda uyarılmış olmasını sağlamak ve kafes malzemelerinin yerel çevre ve güvenlik kurallarına uygun olarak imha edilmesini sağlamak.

3. Doku toplama

1. Doğum sonrası 27 gün (P27) fareleri hacim olarak en az %80'e kadar karbondioksit içeren alanı yavaş yavaş doldurarak ve bu konsantrasyonu 3 dakika boyunca koruyarak ötenazi yapın. Diğer hayvanların diseksiyon sırasında buz üzerinde fareler tutun.
2. İlgi dokularını parçala. Aşağıda özetlenen proksimal tibial ve distal femoral büyüme plakaları ve diz eklem kıkırdağı toplamak için bir protokol, 6 aya kadar doğum sonrası fareler için uygundur.
   1. Keskin makas ve dişli forceps kullanarak, ayak kadar arka bacaklar etrafında deri çıkarın.
   2. Kabaca keskin makas ile bacaklardan kas ve yağ dokusu kırpın.
      NOT: Kemikleri mükemmel bir şekilde temizlemeyin, çünkü çevre dokular kesit ler bazı yapısal destek sağlar, ancak tüm cildin çıkarıldığından emin olun.
   3. Bir neşter kullanarak, femoral baş görünür olana kadar bacak üst vücut karşılayan yumuşak doku ile kesilmiş, sonra bacak kaldırmak için kalça eklemindeki ligamentler kesti.
      NOT: Alternatif olarak, femur başını bulmak mümkün değilse, güçlü makas ile kalça yakın femur ile kesilir.
   4. Neşter veya keskin bir makas kullanarak ayağı bacağın geri kalanından ayırın.

4. Doku fiksasyonu ve işlenmesi

NOT: İlgi dokusuna dayanarak, aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, aşağıda belirtilen iki protokolden birini uygulayın (yumuşak dokular için 4.1 veya yaklaşık 45 günlük mineralize fare dokuları için 4.2). Her iki yöntem için de, parçalara ayıran numuneleri kalan hayvanları parçalarken buz üzerinde %3,7 formaldehit/fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisinde saklayın.

1. Yumuşak dokular ve mineralize tibiae ve yaklaşık P45 yaşına kadar femora için, önceden soğutulmuş 3.7% formaldehit / PBS içinde doku düzeltmek 6 saat, 4 °C'de bir rotator üzerinde yavaşça haddeleme. Dokudan en az 10 kat daha büyük bir hacim kullanın. Doğrudan adım 4.3'e devam edin.
2. Yaklaşık P45 yaşın üzerindeki tibiae ve femora da dahil olmak üzere mineralize dokular için bir kireçlenme adımı gereklidir.
   1. Sodyum hidroksit kullanılarak pH 8,05'e ayarlanmış 1 L %10 EDTA/dH₂O çözeltisini hazırlayın. Daha sonra bu solüsyonu kullanarak formaldehiti %3.7'ye seyreltin. EDTA'nın çalışma konsantrasyonu %9 olacaktır.
   2. Bir gecede önceden soğutulmuş %3,7 formaldehit/PBS'ye yerleştirerek ve 4 °C'de bir rotator üzerinde hafifçe yuvarlanarak dokuyu düzeltin.
   3. Dokuyu önceden soğutulmuş %3,7 formaldehit/9% EDTA/dH₂O çözeltisine (pH 8,05) yerleştirin ve 4 °C'de dokudan en az 10 kat daha büyük bir hacimde yavaşça döndürün. Kemikleri taze, önceden soğutulmuş %3,7 formaldehit/%9 EDTA/dH₂O'ya sonraki 48 saat boyunca 3x olarak yerleştirerek bu adımı tekrarlayın.
      NOT: Bu kısa kireçlenme, 6 aylık farelerin femur ve tibia kemiklerinin kesilmesine olanak sağlamak için yeterlidir. Daha yoğun mineralize dokular için histolojiyi geliştirmek için daha fazla kireçlenme gerekebilir.
3. Dokuyu önceden soğutulmuş %30 sakaroz/dH₂O. Kabı ağzına kadar doldurduğunuzdan emin olun ve gece boyunca 4 °C'de hafifçe döndürün. Dokudan en az 10 kat daha büyük bir hacim kullanın. Doku genellikle ilk bu çözelti içine yerleştirildiğinde yüzer ve sabah şişenin altına lavabo.
4. Kalıntı sakaroz çözeltisini çıkarmak için, sakaroz çözeltisinden forsepsle çıkararak ve numuneyi yaklaşık 5 ml optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile tamamen kaplayarak birkaç saniye boyunca dokuyu kısa bir süre yıkayın.
5. Önceden etiketlenmiş bir kriyomold'u OCT ile doldurun ve dokuyu en alttaki konuma getirin. Numunelerin oda sıcaklığında çok uzun süre oturmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
   NOT: Örneği kesit adımı için uygun bir yönlendirmeye yerleştirmek önemlidir. Col2CreERT:Konfeti ile takip ettikten sonra tüm büyüme plakası sütunları boyunca kesit şansını artırmak için, bir kılavuz olarak femoral kafa kullanarak aşağı bakan medial tarafı yerleştirin ve mümkün olduğunca kalıbın altına düz olarak örnek konumlandırın.
6. Kalıbı kuru buzun üzerine yerleştirerek ve OCT'nin tamamen katılaşmasını bekleyerek numuneyi gömün. Kalıbın içinde dokunun hareketini/kaymasını önlemek için kriyokalıpları mümkün olduğunca düz yerleştirin. Tamamlandıktan sonra, hemen kullanılmazlarsa numuneleri -20 °C'de saklayın.
   NOT: 12 hafta içinde kullanın, çünkü yaşla birlikte blokların kesişmeleri daha zor hale gelir.

5. Kesitleme

NOT: Sert dokuya uygun tek kullanımlık bıçaklı bir kriyostat kullanarak kriyoditing yapın. Herhangi bir standart kriyostat uygundur.

1. Kalıptan bloğu çıkarın ve bloğun üst kısmı ile -20 °C'de -20 °C'de kıkırdak arasında OKT uygulayarak fırlatışa sabitlayın, böylece OCT tamamen katılaşmış olur.
2. Numune tutucuyu ve bıçak tutucuyu -20 °C'ye kadar önceden soğutun ve ardından numuneyi/chuck'ı fırlatma tutucuya ve bıçağı bıçak tutucuya yerleştirin ve birkaç dakika boyunca dengeleyin.
   NOT: Belirtilen sıcaklıklar kriyostat ve ilgi doku bağlı olarak birkaç derece ile değişebilir.
3. İlgi dokuda klonların görselleştirilmesi için izin vermek için blok ve uygun bir kalınlıkta doku kesitleri kesmek için kriyostat kullanın.
   1. Doğum sonrası büyüme plakaanalizi için 30−160 m'lik kesitler hazırlayın ve slaytlarda toplayın. Bazı kriyostat modelleri yalnızca kırpma ayarını kullanarak kalın bölümlerin toplanmasına izin verebilir.
4. Tamamen kuruyana kadar kaydırakları oda sıcaklığında hava kurutun.
   NOT: Bu adımın süresi doku özelliklerine ve kesit kalınlığına bağlı olarak değişebilir. Odanın sıcaklığı da bu adımın hızını etkileyecektir.
5. Slaytları -20 °C'de 36 aya kadar saklayın veya hemen işleniyorsa 6.2 adıma geçin.

6. Slayt hazırlama ve montaj

1. Slaytı dondurucudan çıkarın ve slayt tutucusunda yatay olarak oda sıcaklığına getirin. Herhangi bir yoğuşma buharlaşmasına izin verin.
2. Slaytüzerine oda sıcaklığında PBS'yi nazikçe uygulamak için Pasteur pipetini kullanarak OCT'yi çıkarın. Bölüm ne kadar kalınsa, o kadar uzun süre gerekir. 160 μm kalınlığındaki kesitler için iki durulama yapın: 15 dakika boyunca bir kez kuluçkaya yatve sıvıyı çıkarın ve sonra 5 dakika taze PBS uygulayın ve sıvıyı çıkarın.
   NOT: Bu adım OCT kaldırmak için ve doku özellikleri ve kesit kalınlığı, uygun olarak göre çeşitlendirilebilir. Odanın sıcaklığı bu adımın hızını etkileyecektir.
3. Slaytları oda sıcaklığında %75 oranında 2,2-thiodiethanol/dH_2Oçözeltiye 60 mm uzunluğunda kapak lı olarak monte edin.
   NOT: Slaytlar görüntülemeden hemen önce hazırlanabilir, ancak floresan sinyal 4 °C'de nemli bir odada ışıktan uzak tutulursa 1−2 hafta stabildir.

7. Konfokal mikroskopi ile görüntüleme

1. Mikroskobu hazırla.
   1. Mikroskobu açın ve yazılımı açın. Başlat Sistemi düğmesini tıklatın.
   2. İlk olarak Edinme sekmesi altında Smart Setup'ı tıklatarak ve ardından kırmızı floresan protein (RFP), sarı floresan protein (YFP) ve siyan floresan proteinine (CFP) karşılık gelen üç kanalı seçerek kanalları seçin. Boya başlığı. Lazerleri seçmek için En İyi sinyali tıklatın.
      NOT: Edinme sekmesinin içeriği Ek dosya 1A'dagösterilmiştir. Gerekli kanallar yoksa, Boya başlığının altındaki '+' düğmesini kullanarak bunları ekleyin. Lazer ile ilgili gerekli bilgiler, uyarma dalga boyları, ve kaydedilen emisyon dalga boyları aralığı Ek dosya 1B-Düç Konfeti floresan proteinler için gösterilir.
   3. Edinme Modu sekmesinde Hedef başlığı altında 20x objektif lensseçin.
2. Büyüme plakasını veya diğer ilgi dokusunu bulun.
   1. Farklı bir görünüm sağlamak için, önce Kanallar sekmesinde adını tıklayarak RFP kanalını seçin. Bu, RFP kanalının ayrıntılarının Işık Yolu sekmesinde görüntülenmesine neden olur. T-PMT'ninyanındaki onay kutusunu tıklatın.
      NOT: T-PMT kanalı, dokudaki floresan olmayan kısımları görselleştirmek için kullanılan yansımayan lazer ışığını gösterir.
   2. Slaytı slayt tutucuya yerleştirin ve büyüme plakasını veya diğer ilgi dokularını doğrudan ışık yolu ile objektif lens arasına yerleştirin.
   3. Dokuları yerelleştirmeyi kolaylaştırmak için, Kanallar sekmesinin İzler başlığı altındaki onay kutularını kullanarak YFP ve CFP kanallarını seçin.
   4. Parçalar başlığındaki adını tıklatarak T-PMT kanalını seçin. Kazan'ın Kazansekmesinde Canlı'yı tıklatın ve ekrandaki gri tonla gösterilen doku bölümünü görselleştirmek için T-PMT kanalının Kazanç (Master) artışını artırın.
   5. İlgi bölgesini bulmak için joystick'i kullanarak slaydın konumunu hareket ettirin ve ardından uygun mikroskop tonunu kullanarak odaklanın.
   6. Lazer pozlamasını kapatmak için Edinme sekmesinde Durdur'u tıklatın.
3. Görüntüleme parametrelerini tanımlayın.
   1. Kanallardan birini seçmek için Kanallar sekmesindeki onay kutularını kullanın ve bu kanalın görüntüsünü ekranda görüntülemek için Edinme sekmesinde Canlı'yı tıklatın. Daha sonra, fare üzerinde sol tıklama düğmesini kullanarak, toplanan yayılan floresan sinyal aralığını ayarlamak için slayt çubukları ayarlayın, lazer gücü (Lazerler başlığı altında kayan çubuk), Gain (Master) ve Dijital Ofset Ekrandaki Konfeti etiketli hücreleri görselleştirmek için kanallar sekmesi. Tüm bu parametrelerin kılavuz değerleri RFP, YFP ve CFP için Ek dosya 1B-D'de sağlanır. Her kanal için bu adımı tek tek tamamlayın.
      NOT: Görselleştirilmiş sinyalin otofloresan olmadığından emin olmak için, bu adımda Cre negatif bir hayvandan bir bölüm negatif kontrol olarak kullanılabilir. T-PMT RFP lazer (adım 7.2.1) rfp için lazer gücü ayarlama ile kombine edilmiştir T-PMT sinyali etkileyecektir.
   2. Gerekirse floresan algılamasını artırmak için İğne Deliği boyutunu ayarlayın.
      NOT: İğne deliği boyutu ne kadar yüksekse Z yönünde o kadar floresan sinyal algılanır. Bunun için bir kılavuz, 1 AU'nun görüntüleme kalitesi için en uygun olduğu Pinhole göstergesinin altında otomatik olarak belirtilen airy unit (AU) 'dir. AU'yu çok fazla artırmak daha sonra analizi bozar, çünkü Z yönünde tek tek hücreleri ayırt etmek daha zor hale gelir).
   3. Kaydedilen sinyallerin çakışmadığından emin olmak için kurulumu denetleyin.
      1. Üç kanalı da seçmek için Kanallar sekmesindeki onay kutularına tıklayın ve Edinme sekmesinde Tuttur düğmesine basın.
      2. Sonuç olarak, Boyutlar sekmesinde listelenen her kanalın üzerindeki mavi vurgulu kutuları tıklatarak görüntülenen kanallar arasında kaydırın. Sinyaller çakışıyorsa (örneğin, her kırmızı hücre de sarıysa), 7.3 adımının başına dönün ve üst üste binen kanalların parametrelerini birbirlerinden ayırt edilene kadar ayarlayın. Her etiket için (örneğin, RFP, YFP veya CFP) en az bir klon, etiketlerden yalnızca birini içeren görselleştirilebilmesini sağlayın.
4. Görüntü edinin.
   1. Kare Boyutu, Hızve Ortalama Sayı değerlerini kullanarak görüntü kalitesini belirtmek için Edinme Modu sekmesini seçin.
      NOT: Bu denemeler için tipik ayarlar Ek dosya 1Agösterilir. Edinme sekmesinde Taşkın lık alanı başlığı altında Yakınlaştırma'yı azaltmak, görüntü edinimi için gereken süreyi değiştirmeden görüş alanını artırabilir.
   2. Edinme sekmesinde, Boyutsal Edinme başlığı altında Z-Stack onay kutusunu tıklatın. Z yönünde görüntüler arasındaki aralığı 2,5 μm olarak ayarlamak için Z yığını sekmesini açın.
   3. Doğru konumları ayarlamak için Kanallar sekmesinde yalnızca RFP/T-PMT'yi seçin ve dokuda görünür bir anahatla kırmızı klonları görselleştirmek için Canlı'yı tıklatın. İlk ve son dilimi, mikroskop düğmesini kullanarak odağı ayarlayarak, ilgili dilimde Önce Ayarla ve Son Ayarla'yı tıklatarak ayarlayın.
   4. Edinme sekmesindeki Döşeme Taşı Tonu sekmesini tıklatın ve ilgili kutulardaki yatay ve dikey yönlerdeki toplam döşeme sayısını girin.
   5. Görüntü yakalama için Kanallar sekmesinde istenen tüm kanalları seçin, ardından tek bir görüntü toplamak için Tuttur düğmesini veya Z yığını/Döşemesi tonutoplamak için Denemeyi Başlat düğmesini tıklatın.
5. Görüntü alındıktan sonra Dosya'yı tıklatın ve daha sonra gözden geçirip yeniden kullanıma izin vermek için görüntüyü olabildiğince mikroskop ayarları hakkında koruyan bir dosya türüne kaydedin.
6. Görüntü analizi yazılımLarını kullanarak daha fazla analiz yapın.

Sonuçlar

Epifiz kıkırdağındaki kondrositleri etiketlemek ve P1'de tamoksifen uygulaması kullanılarak yaşla birlikte klonal genişlemelerini görselleştirmek için Col2CreERT:Konfeti fareler etiketlendi ve arka uzuvları P27'de toplandı. Merkezi bölüm çapraz bağ(Şekil 2A)görselleştirilerek belirlendi ve proksimal tibial büyüme plakasındaki klonlar görselleştirildi (Şekil 2B). Bu veriler, P1'de Col2-pozitif olan ve tamoksifen uygulandığında Konfeti floresan proteinleri ile etiketlenen tek tek hücrelerin klonal genişlemeden geçtiğini ve daha sonra P27'ye kadar büyüme plakasında kaldığını göstermektedir. Benzer bir gelişimsel zaman noktasından klonal genişlemedeki ilk değişiklikler Şekil 1'de görülebilir¹³.

Uzun süreli depolamadan sonra floresan sinyaline bir örnek vermek için (adım 5.5), toplanan bölüm hemen sonra saklandı (bkz. Şekil 2A,B)hazırlanmadan ve görüntülenmeden önce 3 yıldan uzun bir süre için (Şekil 2C, Video 1) .

Protokolle ilgili bazı yaygın sorunları göstermek için, kriyokesit adımı sırasında kırılan bir bölüm Şekil 3A'dagösterilmiştir. Şekil 3B'de genişletilen bölümün bölgesi (büyüme plakası ve eklem kıkırdağı arasında) tamoksifen inbu dozunun bu alanda klonal analizi engelleyecek kadar yüksek bir rekombinasyon seviyesine yol açtığını göstermektedir.

Şekil 1: Deneysel genel bakış. Yöntemin temel aşamalarını özetleyen akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Col2CreERT:Konfeti faresinden konfeti görüntüleri. (A) Col2CreERT:Konfeti fare örnekleri kireçlenme veya uzun süreli depolama adımı olmadan işlenmiştir. Merkezi bölüm bir marker olarak çapraz bağ kullanılarak yer oldu. Bu görüntü, T-PMT (Ölçek çubuğu = 300 μm) ile RFP algılandıktan sonra bir kiremit tonu kullanılarak görüntülendi. (B) Klonal kolonlar, 3D rekonstrüksiyondan sonra(A)içinde görülen büyüme plakasının proksimal tibiasında gösterilir. (C) 3 yıldan uzun süreli depolama da tutulan(A) ve (B)içinde gösterilen bitişik slayt görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyon için işlenmiştir. RFP, YFP ve CFP (B) ve (C) (Ölçek çubukları = 50 μm) olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yöntemi kullanırken zorluklar. (A) Beyaz kesik çizgiler Col2CreERT büyüme plakası ile bölümünde bir bölünme anahat:Konfeti fareler (Ölçek çubuğu = 50 μm). Beyaz kutunun içindeki alan (B) (Ölçek çubuğu = 25 μm) olarak gösterilir. RFP, YFP ve CFP her iki panelde de gösterilir ve dokugörselleştirmek için(A)yansıyan olmayan lazer ışığı (T-PMT) kanalı gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Col2CreERT bir büyüme plakaüç boyutlu rekonstrüksiyon: Konfeti fare. Col2CreERT: Konfeti fareden hazırlanan bir slayt, kesitten sonra 3 yıldan uzun süre uzun süreli depolama alanında tutuldu ve daha sonra görüntüleme için işlendi. Üç boyutlu yeniden yapılanma görüntü analiz yazılımı ile otomatik olarak gerçekleştirildi ve video olarak ihraç edildi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek dosya 1: Konfokal mikroskobun tipik kurulumu. (A) Kazanım sekmesinde bulunan ana kontroller. (B−D) Lazer parametreleri, uyarma dalga boyu ve kaydedilen emisyon dalga boylarının aralığı üç Konfeti floresan proteiniçin gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Konfeti modeli mineralize kıkırdak dokuları^12,13,14 ve optimize protokol tanımlamak için kapsamlı olarak kullanılmıştır. R26R-Konfeti alelinin bir veya iki kopyası na sahip konfeti fareler^2, üreme ve deneyler için kullanılabilir. Brainbow 2.1 yapısının bir aleline sahip farelerde rekombinasyon dört potansiyel etiket verecektir: kırmızı floresan protein (RFP, sitoplazmik), sarı floresan protein (YFP, sitoplazmik), siyan floresan protein (CFP, membran lokalize) ve yeşil floresan protein (GFP, çekirdek-lokalize), homozigot Konfeti farelerde rekombinasyon ise (yani, Brainbow 2.1 yapısının iki kopyasını içeren) 10 olası renk çıkışı verecektir (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+CFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+ GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). Ancak, DNA eksizyonu ve inversiyon olayları stochastic bir şekilde meydana çünkü, GFP üretmek için rekombinasyon hücrelerin sadece küçük bir kısmını oluşur, daha önce bildirilen², ve görünüşte hücre tipi veya Cre hattı ile değişir^{2, 12,13}. Bu nedenle, GFP ekspresyonuna yol açan rekombinasyon olaylarının düşük oluşumu göz önüne alındığında, altı renk çıkışları homozigot Konfeti farelerde en yaygın olanıdır.

Konfeti fare ile deneyler planlarken önemli bir husus uygun bir Cre zorlanma bulmaktır. Birincisi, Konfeti alel birkaç loxP siteleri olduğundan, bir rekombinasyon olay ikinci bir⁴engel değildir . Bu, bir hücre etiketlenir ve bir renk klonunu oluşturmak için bölünürse, kız hücrelerinden birinde ikinci bir yeniden birleşim olayı farklı bir renk oluşturarak gerçek klonal genişlemeyi maskeleyeceği anlamına gelir. Bu nedenle, ilgili organizatör aktif ise enzim her zaman aktif olduğu noninducible Cre suşları, tavsiye edilmez. İkinci olarak, bazı suşlarda Cre rekombinaz ın ekspresyonu genellikle endojen bir proteinpahasına gelir, böylelikle kendi fenotipini oluşturur (örneğin, farelerin iki Cre alel¹⁵barındırdığı Prg4-GFPCreERT2 knock-in fare suşuiçin), Bu yüzden Cre alel tek bir kopyası arzu edilir. Açıklanan deneylerin tümlerinde, Col2CreERT^16'nın tek bir kopyası,^13'teaçıklandığı gibi, Col2CreERT:Konfeti fareleri oluşturmak için erkek veya dişi ebeveyn tarafından taşınmıştır. Daha sonra, Cre satırının ilgi hücre türüne özgüllüğü önemli bir husustur. Örneğin, Col2CreERT kondrosit özgüdür, ancak erken doğum sonrası kıkırdak¹⁷kondrosit birkaç farklı popülasyonları etiketler. Son olarak, farklı Cre suşlarının aktivitesi hayvan yaşı ile önemli ölçüde değişebilir, cre ifade değişiklikleri için kullanılan organizatörün endojen aktivitesi olarak, aynı tip hücrelerde bile (örneğin, Prg4-GFPCreERT2, artan bir gerektirebilir fareler yaş¹⁵olarak yüzeysel bölge hücrelerini etiketlemek için tamoksifen dozlarının sayısı.

Etiketli hücrelerin sayısı verilen tamoksifen miktarı ile yansıtılacaktır, bu yüzden her zaman birbirinden klonlar ayırt zor olabilir, çünkü maksimum doz vermek için arzu edilmez. Cre ifade farklı organizatörlerin düzenlenmesi altında yanı sıra yaş ile değişir çünkü, tamoksifen doz etiketleme optimize etmek için ayarlanması gerekecektir. Rekombinasyon için zaman gerekli olduğundan ve ortaya çıkan floresan proteinlerin görüntüleme için yeterli birikmesi gerektiğinden, hücrelerin rekombinasyon tetikleme üzerine hemen floresan olmadığını belirtmek önemlidir. Cre hattı, hücre tipi ve hayvan yaşı etkilenmiş gibi görünen geniş bir saat aralığı (24−72 saat arasında) gereklidir. Tamoksifen^{18 uygulamadan} uzun süre sonra biyolojik olarak aktif olabileceğinden her modelde rekombinasyon verimliliğini iyice kontrol etmek tavsiye edilir.

Konfokal mikroskopi adımı sırasında Konfeti floresan proteinlerin uyarılması, lazer ışığı ile dokunun penetrasyonunu gerektirir. Farklı dokular farklı özelliklere sahip olduğundan, lazer ışığı tüm dokuların 160 μm kalınlığındaki bölümlerine nüfuz edemeyebilir. Ancak, şekil 2, Şekil 3'tekullanıldığı gibi, bu kalın kesitler büyüme plakakık kıkırdağı için kullanılabilir. Her mikroskopun farklı olduğunu ve açıklanan ayarların(Ek Dosya 1)küçük ayarlamalar olmadan mükemmel bir şekilde çalışmasının olası olmadığını unutmayın. En büyük zorluklardan biri, bir kanaldan diğerine kontaminasyon olmamasını sağlamak için farklı floresan proteinleri ayırt etmektir. Örneğin, GFP'den gelen floresan nedeniyle YFP kanalındaki sinyal YFP ve RFP kanalları arasında çakışıyor. YFP ve CFP kanalları da dikkatle kontrol edilmelidir. Bu çeşitli şekillerde yapılabilir. İlk olarak, her floresan protein için kaydedilen floresan ışık dalga boylarının emisyon aralığı daraltılabilir. İkinci olarak, lazer gücünü dijital kazançla birlikte ayarlamak sinyali optimize edebilir. Bu çalışmada bu adımlar yeterli, ancak güçlü bir floresan sinyali güveniyor. Bu teoride, verimsiz doku işleme floresan proteinlerin aktivitesini azaltabilir, ya da zayıf bir lazer ışık kaynağı kanal ayırma bozabilir anlamına gelir.

Konfeti farenin avantajlarından biri, belirli genlerin klonal dinamikler üzerindeki etkisinin 10^,11,12'yekadar kullanılabilen çok sayıda genetik mutant suşları ile kombine edilebilmeleridir. ^,13,14,19,20, bazı sınırlamalar olsa. Örneğin, Konfeti alellerinin rekombinasyonu ve ilgi geni Cre loxP tabanlı mutantlar klonal soy takibi ile birlikte yken ayrılamaz. Yine de, bu tür çakışan rekombinasyon olayları etkili olabilir^10,14,20. Örneğin, bu olasılık, büyüme^{plakası 21'de} TSC1'in doğum sonrası kondrosit spesifik ablasyonunu takiben farelerin dinlenme bölgesinde artan hücre sayısını araştırmak için kullanıldı ve zaman içinde bu hücreler arasındaki klonal ilişkiyi ortaya çıkardı. ¹³. Ayrıca, Konfeti fareler kullanarak dokuya özgü klonal analiz non-Cre loxP tabanlı mutant fareler ile kullanılabilir¹¹, ve farmakolojik ile bu yaklaşımları birleştirmek mümkündür^{8,9 ,13} ve/veya cerrahi modeller⁸ diğer fonksiyonel tedirginliklere klonal yanıtları görselleştirmek için. Konfeti etiketli bölümleri endojen proteinlerin immünofloresan ile immünosiyamı ile birleştirildiğinde daha fazla fırsat ortaya çıkar. Bu tür analizler, izlenen hücrelerin tanımlanmasını ve bilinen bir belirteç le birlikte kolokalizasyonlarını sağlar. Burada açıklanan fiksasyon yöntemi ile, immünfloresans yapmak ve hala Konfeti floresan proteinler12^,13floresan görselleştirmek mümkündür. Ancak, bahsedilen kağıtlarda, antijen alımı gerekli değildi. Sert antijen alma yöntemleri, sitrat tampon kaynama gibi, Konfeti floresan tam bir kaybına yol açar. Konfeti floresan proteinler daha sonra antikorlar kullanılarak tespit edilebilir rağmen²², klonal kimlik kaybı oluşabilir.

Özetle, konfeti modelini kullanarak hücreleri in vivo olarak etiketlemek, zaman içinde bu hücrelerin kaderini analiz etmek için bilgilendirici bir araçtır. Açıklanan yöntem, mineralize dokularda floresan protein ekspresyonunu doğrudan görselleştirmek için hızlı ve etkili bir yol sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2,2-tiyodietanol	Sigma	MKCF9328
60 mm uzunluğunda kapak kızakları	Mendel-Glä zer	220588
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Zeiss	LSM 710
Mısır yağı	Sigma	C8267
Cryomold (standart)	Sakura	4557
Kriyostat	Termo	Model: NX70
Tek kullanımlık kriyostat bıçakları	Histolab	207500014	Özellikle sert doku
EDTA	Scharlan	AC0960005P
Formaldehit konsantresi	Merck	8.18708.1000
Cam şişeler	Sigma	V7130	Tamoksifen seyreltmesi ve doku fiksasyonu ve işlenmesi için kullanılabilir
Imaris yazılımı	Oxford Instruments	N/A	3D rekonstrüksiyon için görüntü analiz yazılımı
Isofluran	Zoetis	11-8162
OCT	Sakura	102094-104
Pasteur pipeti	Sarstedt	86.1171
PBS	Gibco	14200075
Sodyum hidroksit	Merck	1.06498.1000
Sükroz	Sigma	S0389
Superfrost UltraPlus slaytları	Mendel-Glä zer	J3800AMNZ
Tamoxifen	Sigma	T5648
Zen2 yazılımı	Zeiss	N/A	Konfokal lazer tarama mikroskobu için Ücretsiz Yazılım