Yöntem makalesi

Biyolojik Olarak Aktif Mercan Matrisi Kullanılarak Ayrışmış Nöral Hücre Kültürlerinin Dayanıklılığının Arttırılması

DOI:

10.3791/60443

⸱

3 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrışmış hipokampal hücre kültürü, nörobilimde çok önemli bir deneysel araçtır. Nöroprotektif ve nöromodülatif rolleri nedeniyle mercan iskeletleri matris olarak kullanıldığında kültürde nöral hücre sağkalımı ve fonksiyonu artar. Bu nedenle, mercan matrisinde yetiştirilen nöral hücreler daha yüksek dayanıklılık gösterir ve bu nedenle kültürleme için daha yeterlidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrışmış hipokampal, nöronal ve glial hücrelerin kültürleri, yüksek hücre izolasyonu ve kontrollü bir ortam sağlayarak nöral büyümeyi ve fonksiyonu incelemek için değerli bir deneysel modeldir. Bununla birlikte, hipokampal hücrelerin in vitro olarak hayatta kalması tehlikeye girer: çoğu hücre kültürün ilk haftasında ölür. Bu nedenle, kültürdeki sinir hücrelerinin dayanıklılığını arttırmanın yollarını belirlemek büyük önem taşımaktadır.

Mercanların iskeletinden elde edilen kristalin aragonit formundaki kalsiyum karbonat, nöral kültürler için üstün, aktif bir matris olarak kullanılabilir. Glial hücreleri besleyerek, koruyarak ve aktive ederek, mercan iskeleti bu hücrelerin hayatta kalmasını ve büyümesini in vitro olarak diğer matrislerden daha iyi arttırır.

Bu protokol, bir mercan matrisi üzerinde hipokampal hücrelerin yetiştirilmesi için bir yöntem açıklar. Bu matris, mercan iskeletlerinin tanelerinin kültür yemeklerine, şişelere ve cam örtülere bağlanmasıyla üretilir. Tahıllar, hücrelerin ortamını, büyümek ve doku benzeri yapılar oluşturmak için ince bir üç boyutlu (3B) ortama sokarak iyileştirmeye yardımcı olur. Mercan iskeleti tarafından tanıtılan 3D ortam, glial hücrelerin aktivitesini etkilediği tespit edilen bir özellik olan taneciklerin büyüklüğü ve yoğunluğu (yani, matris pürüzlülüğü) üzerinde kontrol sağlayan öğütme yoluyla hücreler için optimize edilebilir. Dahası, tahıl kullanımı, özellikle ışık mikroskobu kullanıldığında, kültürlerin gözlemlenmesini ve analizini kolaylaştırır. Bu nedenle, protokol, in vitro sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmek için bir araç olarak mercan matrisinin oluşturulması ve optimizasyonu için prosedürler içerir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrışmış sinir hücrelerinin kültürleri, bu durumda hipokampal hücreler, yüksek hücre izolasyonu ve erişilebilirliği sağlayarak nöral büyümeyi ve işlevi incelemek için değerli bir deneysel modeldir 1,2,3. Bu tür bir kültür, büyüme ve canlılık oranları, nörotoksisite, nörit büyümesi ve ağ oluşturma, sinaptik bağlantı ve plastisite, morfolojik modifikasyonlar, nöritlerin organizasyonu ve kablolaması gibi toplanabilecek büyük miktarda bilgi nedeniyle nörobilim, ilaç geliştirme ve doku mühendisliğinde sıklıkla kullanılmaktadır.1,4,5,6,7.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde hayvanların kullanımı Ulusal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Kalsiyum karbonatlı mercan iskeletleri, aragonitin kristal formunda kullanılmalıdır. Nöral kültürler için şimdiye kadar test edilen mercan türleri Porites Lutea, Stylophora Pistillata ve Trachyphyllia Geoffroyi'dir. İskeletler tamamen veya öğütülmüş olarak satın alınabilir.

1. Mercan iskelet parçalarının temizlenmesi

DİKKAT: Aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında kimyasal bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir, çünkü aşağıda açıklanan çözeltiler tehlikelidir ve yanıkla....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mercan iskelet matrisini hazırlamak için, tüm mercan iskeleti (Şekil 1A) bir çekiç kullanılarak 0,5-2 cm'lik parçalara ayrıldı (Şekil 1B) ve% 10 hipoklorit çözeltisi, 1M NaOH çözeltisi ve% 30H2O2çözeltisi (Şekil 1C) kullanılarak üç adımda (protokolde adım 1) organik artıklardan iyice temizlendi. İskelet rengi kahverengiden (Şekil 1D) beyaza (Şekil 1E) .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan teknik, kültürdeki sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu, hücreleri, hücreleri besleyen ve büyümelerini ve aktivitelerini teşvik eden mercan iskelet tanelerinden yapılmış bir matrise yapıştırarak elde edilir. Bu tekniği kullanmak, nöral kültür modelinin beyindeki hücrelerin ortamını taklit etme kapasitesini arttırır.

Matrisin bir kültür substratı olarak tanıtılması, klasik nöral hücre kültürü yöntemlerinde kullanılan diğer subs.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma İsrail Ticaret ve Çalışma Bakanlığı'nın KAMIN programı ve Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, ABD tarafından finanse edilmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 oyuklu plakalarGreiner# 60-662160
B-27Gibco# 17504-044
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma#A4503
D & ndashglikoz Sigma#G8769
Dulbecco'nun Minimal Esansiyel Kartalı (DMEM)Sigma#D5796
Elektrikli elekAri Levy#3700
Fetal Sığır Serun (FBS)Biyolojik Endüstriler#04-007-1A
Orta%85.1 Minimum Temel Kartal' s orta (MEM),% 11.5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu,% 1.2 L-Glutamin ve% 2.2 D-Glikoz.
ŞişelerGreiner# 60-69016025cm ^ 2, Doku kültürü ile tedavi edilmiş
Floro-deoksi-üridinSigma#F0503
Cam LamellerMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2< / sub>O2< / sub>Romical# 007130-72-19Tehlikeli
Jambon F-12 Besin KarışımıSigma#N4888
HANK'S solutionSigma#H6648
Kinürenik asitSigma#K3375
L - glutaminSigma#G7513
; m)VWR# 10199-654
Minimun Esansiyel Kartal (MEM)Sigma#M2279
Havan ve havaneliDe-Groot4-P090
NaClO (Sodyum Hipoklorit)Sigma# 425044Tehlikeli
NaOHSigma#S8045Tehlikeli
Nöronal Büyüme Ortamı%45 MEM, %40 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM), %10 Besin karışımı F-12 Jambon, %0.25 (a/h) sığır serum albümini (BSA), %0.75 D-glikoz, %0.25 L-Glutamin, %0.5 B-27 takviyesi, %0.1 kinürenik asit, %0.01 %70 üridin ve %30 floro-deoksi-üridin.
Petri kabıGreiner# 60-628160, # 60-62716060mm, 35mm, sırasıyla.
Poli D – LizinSigma#P7280
Akıllı Dentin ÖğütücüKometaBio#GR101
TripsinGibco# 15-090-046
ÜridinSigma#U3750
İlk Gün Manuel süzgeç (40 & mikro

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Coral Skeleton MatrixHippocampal Cell CultureNeural Cell DurabilityGrain Size OptimizationSterile Coating ProcedureTrypsin Dissociation MethodHemocytometer Cell CountingPhase Contrast MicroscopyGlial Fibrillary Acidic ProteinMicrotubule Associated Protein Two

İlgili makaleler