Yöntem makalesi

Biyolojik Olarak Aktif Mercan Matrisi Kullanılarak Ayrışmış Nöral Hücre Kültürlerinin Dayanıklılığının Arttırılması

DOI:

10.3791/60443

⸱

3 Haziran 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrışmış hipokampal hücre kültürü, nörobilimde çok önemli bir deneysel araçtır. Nöroprotektif ve nöromodülatif rolleri nedeniyle mercan iskeletleri matris olarak kullanıldığında kültürde nöral hücre sağkalımı ve fonksiyonu artar. Bu nedenle, mercan matrisinde yetiştirilen nöral hücreler daha yüksek dayanıklılık gösterir ve bu nedenle kültürleme için daha yeterlidir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrışmış hipokampal, nöronal ve glial hücrelerin kültürleri, yüksek hücre izolasyonu ve kontrollü bir ortam sağlayarak nöral büyümeyi ve fonksiyonu incelemek için değerli bir deneysel modeldir. Bununla birlikte, hipokampal hücrelerin in vitro olarak hayatta kalması tehlikeye girer: çoğu hücre kültürün ilk haftasında ölür. Bu nedenle, kültürdeki sinir hücrelerinin dayanıklılığını arttırmanın yollarını belirlemek büyük önem taşımaktadır.

Mercanların iskeletinden elde edilen kristalin aragonit formundaki kalsiyum karbonat, nöral kültürler için üstün, aktif bir matris olarak kullanılabilir. Glial hücreleri besleyerek, koruyarak ve aktive ederek, mercan iskeleti bu hücrelerin hayatta kalmasını ve büyümesini in vitro olarak diğer matrislerden daha iyi arttırır.

Bu protokol, bir mercan matrisi üzerinde hipokampal hücrelerin yetiştirilmesi için bir yöntem açıklar. Bu matris, mercan iskeletlerinin tanelerinin kültür yemeklerine, şişelere ve cam örtülere bağlanmasıyla üretilir. Tahıllar, hücrelerin ortamını, büyümek ve doku benzeri yapılar oluşturmak için ince bir üç boyutlu (3B) ortama sokarak iyileştirmeye yardımcı olur. Mercan iskeleti tarafından tanıtılan 3D ortam, glial hücrelerin aktivitesini etkilediği tespit edilen bir özellik olan taneciklerin büyüklüğü ve yoğunluğu (yani, matris pürüzlülüğü) üzerinde kontrol sağlayan öğütme yoluyla hücreler için optimize edilebilir. Dahası, tahıl kullanımı, özellikle ışık mikroskobu kullanıldığında, kültürlerin gözlemlenmesini ve analizini kolaylaştırır. Bu nedenle, protokol, in vitro sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmek için bir araç olarak mercan matrisinin oluşturulması ve optimizasyonu için prosedürler içerir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ayrışmış sinir hücrelerinin kültürleri, bu durumda hipokampal hücreler, yüksek hücre izolasyonu ve erişilebilirliği sağlayarak nöral büyümeyi ve işlevi incelemek için değerli bir deneysel modeldir 1,2,3. Bu tür bir kültür, büyüme ve canlılık oranları, nörotoksisite, nörit büyümesi ve ağ oluşturma, sinaptik bağlantı ve plastisite, morfolojik modifikasyonlar, nöritlerin organizasyonu ve kablolaması gibi toplanabilecek büyük miktarda bilgi nedeniyle nörobilim, ilaç geliştirme ve doku mühendisliğinde sıklıkla kullanılmaktadır.1,4,5,6,7.

Kültürlerin önemine rağmen, ekili hücreler genellikle iki boyutlu tek katmanlı cam örtüler üzerinde büyümeye zorlanır. Bu katı çevresel değişiklikler, sinir hücrelerinin zaman içinde hayatta kalma yeteneğini önemli ölçüde azaltır, çünkü cam örtüler, düşük yapışma mukavemetine sahip, hücre büyümesini desteklemek için daha düşük bir kapasite sergileyen, besleyici olmayan substratlardır 8,9,10,11.

Ekili sinir hücreleri zorlu koşullarda büyümeye zorlandığından, hayatta kalmalarını arttırmak için temel bir yaklaşım, doğal çevrelerini mümkün olduğunca taklit etmek olacaktır12,13. Bu, matris görevi görecek ve hücrelerin hücre dışı matrisini taklit edecek, doku benzeri bir yapı oluşturmalarını ve beslenmelerine yardımcı olmalarını sağlayacak biyomalzemeler kullanılarak başarılabilir14.

Biyomateryallerin kullanımı, hücre kültürlerinin iyileştirilmesinde umut verici bir yaklaşımdır, çünkü biyouyumlu iskeleler gibi davranırlar, mekanik stabilite sağlarlar ve yapışma, hayatta kalma, çoğalma, göç, morfogenez ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli hücre özelliklerini arttırırlar15,16,17. İn vitro hücrelerin koşullarını iyileştirmek için çeşitli biyomateryal türleri kullanılır. Bunlar arasında biyopolimerler veya genellikle hücrelerin hücre dışı matrisinin bir parçası olan biyolojik bileşenler bulunur. Bu biyomalzemeler çoğunlukla polimerize kaplama ajanlarının veya hidrojellerin bir formu olarak kullanılır18,19,20. Bir yandan, yukarıda bahsedilen matrisler, hücrelere büyümeleri için tanıdık bir 3D ortam sağlar, çanağa yapışmalarını teşvik eder ve onlara mekanik destek verir21,22. Öte yandan, polimerize formları ve hücrelerin hidrojeller içinde hapsedilmesi, hücrelerin büyüme ortamında bulunan besleyici bileşenlere erişimini bozar ve ayrıca hücrelerin mikroskobik yöntemlerle takibini zorlaştırır23.

Mercan dış iskeletleri biyolojik deniz kaynaklı matrislerdir. Kalsiyum karbonattan yapılmış, mekanik stabiliteye sahip ve biyolojik olarak parçalanabilirler. Mercan iskeletini kültürde büyüyen sinir hücreleri için bir matris olarak kullanan önceki çalışmalar, cam örtükaymalarına kıyasla çok daha fazla yapışma göstermiştir 24,25. Ek olarak, mercan iskeleti üzerinde yetiştirilen nöral hücreler, iskeletin oluştuğu kalsiyumu alma yeteneklerini göstermiştir, bu da sinir hücrelerini besin yoksunluğu koşullarında korur26. Dahası, mercan iskeleti, sinir hücrelerinin hayatta kalmasını artıran, sinir ağlarının oluşumunu teşvik eden, sinaptik bağlantı oranını yükselten ve doku benzeri yapıların oluşumunu sağlayan destekleyici ve besleyici bir matristir27,28. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, mercan iskelet matrisinin yüzey topografyasının glial hücrelerin dağılımında ve aktivasyonunda çok önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,29. Ayrıca, mercan iskeleti, osteositler30,31, hepatositler ve kültürdeki kardiyomiyositler gibi diğer hücre tiplerinin yetiştirilmesi için bir matris olarak etkilidir (yayınlanmamış veriler).

Bu nedenle, mercan iskeleti, in vitro hücrelerin yetiştirilmesi için umut verici bir matristir. Bu nedenle, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan protokol, mevcut yöntemlerle elde edilenlerden daha kararlı ve müreffeh sinir kültürleri üretmek için mercan iskeleti üzerindeki sinir hücrelerini yetiştirme tekniğini açıklamaktadır. Bu protokol ayrıca kardiyomiyositlerin, hepatositlerin ve diğer hücre tiplerinin yetiştirilmesi için de yararlı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde hayvanların kullanımı Ulusal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Kalsiyum karbonatlı mercan iskeletleri, aragonitin kristal formunda kullanılmalıdır. Nöral kültürler için şimdiye kadar test edilen mercan türleri Porites Lutea, Stylophora Pistillata ve Trachyphyllia Geoffroyi'dir. İskeletler tamamen veya öğütülmüş olarak satın alınabilir.

1. Mercan iskelet parçalarının temizlenmesi

DİKKAT: Aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında kimyasal bir davlumbazda gerçekleştirilmelidir, çünkü aşağıda açıklanan çözeltiler tehlikelidir ve yanıklara ve tahrişlere neden olabilir.

  1. Mercan iskeletini kırmak ve 0,5-2 cm'lik parçalara bölmek için bir çekiç kullanın. Organik ve organik olmayan kalıntıları çözmek için, mercan iskelet parçalarını 10 dakika boyunca% 10 sodyum hipoklorit çözeltisine batırın, ardından bir kez çift damıtılmış su (DDW) ile yıkayın.
  2. Kalan organik kalıntıları gidermek için, parçaları 5 dakika boyunca 1M NaOH çözeltisine batırın, ardından DDW ile bir kez yıkayın. Parçaları 10 dakika boyunca% 30H2O2 çözeltisine batırarak organik birikintilerin uzaklaştırılmasına devam edin, ardından parçaları DDW ile 3x yıkayın.
  3. Mümkün olduğunca fazla DDW'yi çıkarın ve mercan parçalarını davlumbazda kurumaya bırakın (1-8 saat).

2. Cam kapakların temizlenmesi

  1. Cam kapakları 100 mm'lik bir cam Petri kabına aktarın. 15 dakika boyunca 10 mL% 95 etanol ekleyin.
  2. Etanol çıkarın ve DDW 3x ile yıkayın, her yıkama arasında 10 dakika bekleyin. Çanağı, DDW buharlaşana kadar 80 ° C önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin. Birbirlerine yapışmalarını önlemek için kururken plaka içindeki kapakları birkaç kez hafifçe karıştırın.
  3. Kapak fişlerini otoklavlayın.

3. Mercan iskelet tanelerinin hazırlanması

  1. Mercan iskelet parçalarını bir harç ve havan (manuel taşlama) kullanarak tamamen parçalanana kadar öğütün. Sonuç, 20 μm-200 μm arasında değişen boyutlara sahip tanelerin bir karışımıdır.
  2. Alternatif olarak, mercan iskelet parçalarını elektrikli bir taşlama makinesi kullanarak 30 s boyunca 1.000 rpm hızında öğütün (bıçak uzunluğu = 6 cm; genişlik = 0,5 cm-1,0 cm). Elde edilen tane boyutu, manuel taşlama ile üretilen boyut aralığına benzer.

4. Belirli bir boyut aralığındaki tanelerin saflaştırılması

NOT: Bir matristeki taneciklerin boyutu üzerinde kontrol isteniyorsa, aşağıdaki filtreleme tabanlı tane saflaştırma prosedürünü kullanın.

  1. Taneleri manuel veya elektrikli 40 μm filtre örgü süzgecine aktarın.
  2. Taneleri süzgeçten geçirerek taneleri iki spesifik aralığa bölün (elektrikli süzgeç kullanılıyorsa, aşağıdaki koşullar önerilir: sallama = 600 genlik / dak, sıçrama = 6 / s). Bu prosedür, biri <40 μm ve ikincisi >40 μm olmak üzere iki grup tane boyutu üretir.
    NOT: İki boyut, farklı kafeslere sahip süzgeçler kullanılarak belirlenebilir. Daha kısıtlı bir aralık isteniyorsa, adım 4.2'den itibaren her grubu farklı kafeslere sahip süzgeçler aracılığıyla yeniden eleyin.
  3. Taneleri otoklavlayın.

5. Mercan tanesi kaplı tabakların veya örtülerin hazırlanması

  1. Şişeleri, tabakları veya Petri tabaklarını kaplamak için
    NOT: Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
    1. Mercan iskelet tanelerini, Hanks çözeltisinde çözünmüş 20 μg / mL poli-D-lizin (PDL) çözeltisine ekleyin. Önerilen konsantrasyon, 1 mL PDL çözeltisi başına 5 mg / 10 mg tahıldır.
    2. Çözeltiyi şişelere ve tabaklara (yaklaşık 2 mL / 25cm2) dökün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Taneler batar ve dibe yapışır.
    3. Ertesi gün, şişeleri ve bulaşıkları steril DDW ile bir kez yıkayın. Şişelerin ve bulaşıkların davlumbazda kurumasını bekleyin.
      NOT: Taze kaplanmış şişe ve tabakların kullanılması tercih edilir. Kaplanan şişeler ve tabaklar, 4 °C'de muhafaza edilirse kaplamadan sonra bir haftaya kadar kullanılabilir. Bununla birlikte, matrisin etkinliği tehlikeye girebilir.
  2. Kaplama cam kapakları (12 mm çap, 0,17 mm kalınlık)
    1. İstenilen herhangi bir konsantrasyonda DDW'ye mercan iskelet taneleri ekleyin. Nöral hücreler için kullanılan yaygın yoğunluklar 5 mg / mL ve 10 mg / mL'dir. Tane çözeltisinin 40 μL'sini kapak kaymasının ortasına dökün (Şekil 4).
    2. Kapak fişlerini 80 ° C'ye önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin ve tam buharlaşmayı bekleyin (genellikle 15 dakika). Bu koşullar altında, taneler kapak kaymasına yapışır. Kaplanmış kapak fişlerini otoklavlayın. Steril koşullarda saklayın.
    3. Kültürden bir gün önce, kapakları steril bir 24 kuyucuk plakasının kapağına yerleştirin. Her bir kapak fişine 100 μL 20 μg/mL PDL çözeltisi ekleyin. Sıvının tüm tane bölgesini ve kapak kayma yüzeyinin geri kalanını kapladığından emin olmak için ucu kullanın.
    4. Kapağı plakanın alt kısmıyla örtün. Plakaların kenarlarını parafin film ile sarın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. Ertesi gün, DDW ile bir kez yıkayın ve davlumbazda kurutun.
      NOT: Taze kaplamalı kapakların kullanılması tercih edilir.

6. Mercan iskeleti tahıl kaplı cam örtüler üzerinde hipokampal ayrışmış hücrelerin yetiştirilmesi

NOT: Hipokampal ayrışmış hücre kültürü için yöntem daha önce yayınlanmış prosedürlerden24,27 olarak değiştirilmiştir. Kültürün hazırlanması dört sıçan yavrusu için tarif edilmiştir. Her hipokampustan beklenen verim 1–1.5 x 106 hücredir.

  1. Kurulum
    1. Boş bir 60 mm Petri kabı hazırlayın. 60 mm'lik bir Petri kabına 2 mL minimal esansiyel ortam (MEM) dökün ve buz üzerine koyun.
    2. 35 mm'lik bir kaba 2 mL MEM dökün ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de bir inkübatöre koyun. 15 mL'lik bir tüpe 2 mL MEM dökün ve 4 ° C'de tutun.
    3. 15 mL'lik bir tüpe 1 mL İlk Gün Ortamı dökün ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de bir inkübatöre koyun.
      NOT: İlk Gün Ortamının bileşimi Malzemeler Tablosunda açıklanmıştır.
    4. 200 μL'lik %2.5'lik tripsin çözeltisini çözün ve 37 °C'de inkübe edin.
    5. Alev kullanarak 0,5 mm, 0,75 mm ve 1,0 mm çapında kafalara sahip üç cam Pasteur pipet hazırlayın.
    6. Yeterli cerrahi aletler hazırlayın: bir büyük makas, iki küçük makas, bir büyük cımbız, dört küçük cımbız ve bir neşter.
    7. Kaputta bir stereomikroskop hazırlayın.
  2. Büyük bir makas kullanarak, 0-3 günlük Sprague Dawley sıçan yavrularını kafalarını vücutlarından ayırarak boş bir 60 mm Petri kabına kurban edin (adım 6.1.1). Cesetleri atın.
  3. Kafayı büyük bir cımbızla ağızdan tutarak alın. Kafatasını kaplayan cildi küçük bir makasla kesin.
  4. Temiz bir makasla kafatasının altına (beyincik tarafında) girin ve çıkarılmasını sağlamak için kafatasını sağa ve sola kesin. Küçük bir cımbız kullanarak, kafatasını beyinden çıkarın.
  5. Temiz bir cımbız ile, beyni kafadan ayırın ve 2 mL soğuk MEM içeren 60 mm'lik bir Petri kabına koyun (bkz. adım 6.1.2).
  6. İki küçük cımbız kullanarak, hipokampiyi stereomikroskop altında parçalayın. Hipokampi, MEM içeren hazırlanmış 35 mm'lik kaba (adım 6.1.2'den itibaren) aktarın.
    NOT: Her yavru için 6.3-6.6 arası adımlar tekrarlanmalıdır.
  7. Neşteri kullanarak hipokampiyi yaklaşık 1 mm'lik dilimlere kesin. 200 μL tripsin çözeltisi ekleyin (% 0.25'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilir). Yavaşça karıştırın ve 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Kuluçkadan sonra, tripsini devre dışı bırakmak için yemeğe 2 mL soğuk MEM (adım 6.1.2) ekleyin. Tripsinize edilmiş dokuyu, en büyük çapa sahip cam Pasteur pipeti (adım 6.1.5) kullanarak 37 °C'ye (adım 6.1.3) önceden ısıtılmış 1 mL İlk Gün Ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    NOT: Dokunun daha fazla işlenmesi için en iyi orta-doku (v:v) oranı 1 mL/8 hipokampidir. Ortamı mümkün olduğunca doku ile transfer etmekten kaçının.
  9. Dokuyu en büyük çaplı cam pipetten 10-15 kez geçirerek tritüre edin. Ardından, orta çaplı cam pipeti kullanarak bu işlemi tekrarlayın. En küçük çaplı pipetle tritürasyona devam edin. Hücre ölümünü azaltmak için köpürmekten kaçının.
  10. Kalan doku parçalarının 2-5 dakika batmasına izin verin, ardından süpernatantı başka bir 15 mL tüpe aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Tercih edilen hücre yoğunluğu 200.000-400.000 hücre/mL'dir. Hücreleri konsantre etmek için 470 x g'de seyreltmek veya santrifüjlemek için İlk Gün Ortamını kullanın.
  11. Her cam kapak üzerine 100 μL hücre tohumlayın. Tohumlama sırasında, tüm kapak kaymasını hücrelerle kapladığınızdan emin olun. 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de inkübe edin.
  12. Ertesi gün, kuyucuklara 500 μL Nöronal Büyüme Ortamı ekleyin.
    NOT: Nöronal Büyüme Ortamının bileşimi Malzeme Tablosunda açıklanmıştır.
  13. Her bir kapak fişini cımbız kullanarak nazikçe uygun kuyucuğuna aktarın ve kapak kapağını eğerek İlk Gün Ortamını çıkarın. Kalan ortamı kapaktan emin.
  14. 37 ° C'de,% 5-10 CO2'de inkübe edin. Kuluçka boyunca ortamı değiştirmekten kaçının. Kültürler bu koşullar altında 1 aya kadar muhafaza edilebilir. En büyük endişe nemdir. Bu nedenle, inkübatörün maksimum nemli tutulduğundan emin olun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mercan iskelet matrisini hazırlamak için, tüm mercan iskeleti (Şekil 1A) bir çekiç kullanılarak 0,5-2 cm'lik parçalara ayrıldı (Şekil 1B) ve% 10 hipoklorit çözeltisi, 1M NaOH çözeltisi ve% 30H2O2çözeltisi (Şekil 1C) kullanılarak üç adımda (protokolde adım 1) organik artıklardan iyice temizlendi. İskelet rengi kahverengiden (Şekil 1D) beyaza (Şekil 1E) ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan teknik, kültürdeki sinir hücrelerinin bakımını ve işlevselliğini geliştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu, hücreleri, hücreleri besleyen ve büyümelerini ve aktivitelerini teşvik eden mercan iskelet tanelerinden yapılmış bir matrise yapıştırarak elde edilir. Bu tekniği kullanmak, nöral kültür modelinin beyindeki hücrelerin ortamını taklit etme kapasitesini arttırır.

Matrisin bir kültür substratı olarak tanıtılması, klasik nöral hücre kültürü yöntemlerinde kullanılan diğer subs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma İsrail Ticaret ve Çalışma Bakanlığı'nın KAMIN programı ve Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, ABD tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 oyuklu plakalarGreiner# 60-662160
B-27Gibco# 17504-044
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma#A4503
D & ndashglikoz Sigma#G8769
Dulbecco'nun Minimal Esansiyel Kartalı (DMEM)Sigma#D5796
Elektrikli elekAri Levy#3700
Fetal Sığır Serun (FBS)Biyolojik Endüstriler#04-007-1A
Orta%85.1 Minimum Temel Kartal' s orta (MEM),% 11.5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu,% 1.2 L-Glutamin ve% 2.2 D-Glikoz.
ŞişelerGreiner# 60-69016025cm ^ 2, Doku kültürü ile tedavi edilmiş
Floro-deoksi-üridinSigma#F0503
Cam LamellerMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2< / sub>O2< / sub>Romical# 007130-72-19Tehlikeli
Jambon F-12 Besin KarışımıSigma#N4888
HANK'S solutionSigma#H6648
Kinürenik asitSigma#K3375
L - glutaminSigma#G7513
; m)VWR# 10199-654
Minimun Esansiyel Kartal (MEM)Sigma#M2279
Havan ve havaneliDe-Groot4-P090
NaClO (Sodyum Hipoklorit)Sigma# 425044Tehlikeli
NaOHSigma#S8045Tehlikeli
Nöronal Büyüme Ortamı%45 MEM, %40 Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM), %10 Besin karışımı F-12 Jambon, %0.25 (a/h) sığır serum albümini (BSA), %0.75 D-glikoz, %0.25 L-Glutamin, %0.5 B-27 takviyesi, %0.1 kinürenik asit, %0.01 %70 üridin ve %30 floro-deoksi-üridin.
Petri kabıGreiner# 60-628160, # 60-62716060mm, 35mm, sırasıyla.
Poli D – LizinSigma#P7280
Akıllı Dentin ÖğütücüKometaBio#GR101
TripsinGibco# 15-090-046
ÜridinSigma#U3750
İlk Gün Manuel süzgeç (40 & mikro

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005(2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Coral Skeleton MatrixHippocampal Cell CultureNeural Cell DurabilityGrain Size OptimizationSterile Coating ProcedureTrypsin Dissociation MethodHemocytometer Cell CountingPhase Contrast MicroscopyGlial Fibrillary Acidic ProteinMicrotubule Associated Protein Two

İlgili makaleler