Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Summary

Mercanlar hem insanlar hem de deniz canlıları için önemli olan biyoçeşitlilik ekosistemleri oluştururlar. Ancak, hala tam potansiyel ve birçok mercan hücrelerinin fonksiyonu anlamıyorum. Burada, taşlı mercan hücre popülasyonlarının izolasyonu, etiketlemi ve ayrılması için geliştirilmiş bir protokol salıyoruz.

Abstract

Mercan resifleri antropojenik stres nedeniyle tehdit altındadır. Bu streslere mercan biyolojik tepki hücresel düzeyde oluşabilir, ancak mekanizmaları iyi anlaşılamamıştır. Mercanların strese karşı tepkisini araştırmak için hücresel tepkileri analiz etmek için araçlara ihtiyacımız var. Özellikle, hücre popülasyonlarının strese nasıl tepki verdiğini daha iyi anlamak için fonksiyonel tahlillerin uygulanmasını kolaylaştıran araçlara ihtiyacımız vardır. Mevcut çalışmada, taşlı mercanlarda farklı hücre popülasyonlarını izole etmek ve ayırmak için floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Bu protokol şunları içerir: (1) mercan dokularının iskeletten ayrılması, (2) tek bir hücre süspansiyonunun oluşturulması, (3) mercan hücrelerinin akış sitometrisi için çeşitli belirteçler kullanarak etiketleme sitometrisi ve (4) gating ve hücre sıralama stratejileri. Bu yöntem, araştırmacıların farklı hücre popülasyonlarının analizi, fonksiyonel tahlilleri ve gen ekspresyonu çalışmaları için hücresel düzeyde mercanlar üzerinde çalışmalarına olanak sağlayacaktır.

Introduction

Mercan resifleri dünya üzerindeki en önemli ekosistemlerden biridir. Onlar balık ve omurgasızlar için kritik habitatlar sağlayarak biyolojik çeşitliliği kolaylaştırmak ve^turizm1 ile gıda ve ekonomik geçim sağlayarak antropojenik toplulukların sürdürülmesi için çok önemlidir. Mercan resifleri anahtar oluşturucu olarak, mercan hayvan (Phylum: Cnidaria) da dalga ve fırtına hasarı azaltmak büyük kalsiyum karbonat çerçeveleri oluşturarak kıyı toplulukları yardımcı olur².

Yetişkinler gibi Mercanlar virüsler, arkeler, bakteriler, protistler, mantarlar ve en önemlisi, algal dinoflagellate aile Symbiodiniaceae³üyeleri de dahil olmak üzere endosimbiyotik ortakları, geniş bir yelpazede ev sahipliği sessile hayvanlardır. Çevredeki değişiklikler bu toplumda dengesizliklere neden olabilir, genellikle hastalık salgınları ve simbiyotik Simbiyodiniaceae mercan kolonisinden atılır mercan ağartma yol açan, böylece mercan için beslenme önemli kaynağı ortadan kaldırarak. Bu senaryoların her ikisi de genellikle mercan konak^4,5,6ölüme neden olur. Antropojenik kaynaklı stres etkileri, hızlı iklim değişikliği gibi, mercan resifleri küresel bir düşüşe yol açan, kitle mercan ölüm olayları hızlandırıyor⁷.

Son zamanlarda, birçok farklı yöntemler mercan resifi kaybını azaltmak için geliştirilmiştir. Bu yöntemler mevcut resifleri mercan outplanting dahil, termal toleranslı genotipler kullanarak genetik geçiş, ve mikrobiyal ve simbiyotik toplulukların hücresel manipülasyon mercan içinde barındırılan^8,9. Bu çabalara rağmen, çok mercan hücre çeşitliliği ve hücre fonksiyonu^10,11,,12,13hakkında bilinmemektedir . Mercan hücre tipi çeşitliliği ve hücre fonksiyonu nun tam olarak anlaşılması, mercan organizmasının normatif ve stresli koşullar altında nasıl çalıştığını anlamak için gereklidir. Restorasyon ve koruma verimliliğini en üst düzeye çıkarma çabaları, hücre çeşitliliği ve gen fonksiyonunun nasıl birleştiğinin daha iyi anlaşılmasından yararlanacaktır.

Hücre çeşitliliği ve fonksiyonu üzerinde önceki çalışma öncelikle histolojik çalışmalar ve tam doku RNA örnekleme^{14, 15,15,16,17}odaklanmıştır. Mercanlarda belirli hücre tipi fonksiyonu hakkında daha fazla ayrıntı elde etmek için, canlı mercan hücrelerinin belirli popülasyonlarının izolasyonu için yöntemler olması gerekir. Bu floresan-aktive hücre sıralama (FACS) akış sitometri teknolojisi¹⁸ile klasik olmayan model organizmalarda başarıyla yapılmıştır. FACS, göreli hücre boyutu, hücre tanecikliliği ve otofloresans gibi tek hücre düzeyinde farklı endojen hücresel özellikleri ölçmek için değişen dalga boylarına ayarlanmış lazerlerin bir kombinasyonunu kullanır. Ayrıca, hücreler belirli ölçmek için floresan etiketli bileşikler ile işaretlenmiş olabilir, istenen özellikleri^18,19.

Şimdiye kadar, mercan hücrelerine akış sitometri uygulaması esas olarak güçlü, doğal otofloresan^20,,^21,22kullanarak simbiyotik Simbiyodiniaceae ve diğer bakteri popülasyonlarının analizi için olmuştur. FACS ayrıca referans model organizma hücreleri^23,24karşılaştırıldığında floresan DNA marker sinyali kullanarak mercan genom boyutunu tahmin etmek için kullanılmıştır. FACS'ın etkin uygulaması hücre biyolojisi çalışmaları için yararlı olan üç farklı araç sağlar: 1) tek hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel tanımı; 2) kimlik, ayırma ve downstream çalışmalar için belirli hücre popülasyonlarının izolasyon; ve 3) tek hücre düzeyinde fonksiyonel tahlillerin analizi.

Mercan hücrelerinin incelenmesi için çeşitli eksojen floresan belirteçlerin geliştirilmesi ve uygulanması neredeyse keşfedilmemiş kalır. Bu tür belirteçler etiketli proteinler, enzimler için etiketli substratlar veya diğer bileşiklere floresan yanıtları içerebilir. Bu işaretler, belirli bir hücresel bölmesi özelliğinin farklı miktarlarda üretilmesi gibi benzersiz özelliklere sahip hücre türlerini tanımlamak için kullanılabilir. Buna ek bir örnek, fagositöz için yetkin hücreleri işlevsel olarak tanımlamak için floresan etiketli boncukların kullanılması veya hedeflenen bir patojenin yutulması^{dır 25.} Bağışıklık yanıtlarında aktif olan hücre popülasyonları, bu eksojen olarak uygulanan boncukların yutulmasından sonra FACS tarafından kolayca tespit edilebilir. Geleneksel histolojik yöntemler korunmuş doku ve boncuk yutma için pozitif hücrelerin yüzdesini yaklaşık saatlerce gerektirirken, patojen yutma için facs tabanlı fonksiyonel test izole canlı hücreler üzerinde nispeten hızlı bir şekilde yapılabilir. Strese karşı hücreye özgü tepkileri incelemenin yanı sıra, bu teknoloji genlere özgü ifadeyi açıklığa kavuşturma ve kalikoblastlar ve cnidositler gibi cnidarianlara tamamen özgü hücre tiplerinin evrimsel ve gelişimsel tarihini aydınlatma potansiyeline sahiptir.

Son zamanlarda, mercan hücrelerini etiketleme yeteneğine sahip 24 tanımlanması ile sonuçlanan 30'dan fazla hücresel belirteçleri yoğun bir tarama yapıldı, 16 tanesi benzersiz popülasyonları ayırt etmek için yararlıdır¹⁸, onları farklılaşma kümeleri yapma (CD). Burada, Pocillopora damicornis'teki mercan hücre izolasyonunun kalsiyum karbonat iskeletinden hücrelerin çıkarılmasından belirli hücre popülasyonlarının FACS ile tanımlanması ve izole edilmesine kadar olan süreci açıklıyoruz (Şekil 1).

Protocol

1. Hava fırçası ve kompresör ile mercan iskeletinden dokuların dissosiyatasyonu

NOT: Buz üzerinde adımlar atın ve eldivenile ellerinizi koruyun.

1. Hava kompresörü, hortum ve airbrush(Şekil 2)bağlayarak airbrush kiti monte edin. Basınç ölçeri 276−483 kPa arasında ayarlayın.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan önerilen kompresör ve hava hortumu maksimum 393 kPa basınca önceden ayarlanmıştı. Bu 276-483 kPa aralığının dışında kullanılması ya iskeletten yetersiz hücre çıkarılmasına veya hücre zarlarının yırtılmasına neden olabilir. Bu aralık her tür için farklılık gösterebilir ve bir canlılık testi gerektirebilir. Basit bir hemositometre ve 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) boya dışlama testi ile hücre bulamacının bir alt kümesi ile canlılık testi yapılabilir, bileşik mikroskop üzerinde görselleştirilmiş.
2. 100 mL hücre boyama ortamını otoklavda hazırlayın, 3.3x son konsantrasyonuna 10x fosfat tamponlu salin (PBS; kalsiyum ve magnezyum olmadan) 33 mL, fetal buzağı serumunun 2 mL 'si (FCS; 30 dk için 56 °C'de inaktive ısı) ilave edilerek toplam hacmin %2'sine ve 2 mL 1 MHEPES tamponunun 20 mM'lik son konsantrasyona ilave edilerek steril cam konteyner. Daha sonra steril su ile 100 mL'de üzerini kapatın.
   NOT: Rosental ve ark.^18'degösterildiği gibi, 3.3x PBS konsantrasyonu deniz suyunun tuzluluk unu taklit etmek için seçilmiştir. Bu konsantrasyon, tuzluluklarını taklit etmek için diğer ortamlarda bulunan türler için ayarlanmalıdır.
3. 10 mL hücre boyama ortamını bir airbrush şişesine (Şekil 2'de"F" olarak etiketlenmiş) aktarın ve airbrush konektörü için adaptör kapağını takın.
   NOT: Daha kalın doku tabakalarına sahip daha büyük parçalar ve türler yeterli doku alınması için daha fazla ortam gerektirebilir.
4. Burada gösterilen dallanma mercan türleri için, yaklaşık 3−5 cm uzunluğunda veya 4 cm² alanda bir mercan parçasını kesmek veya kesmek için bir kemik kesici kullanın.
   NOT: Parça makroalgve diğer çok hücreli organizmalardan arındırılmalıdır, çünkü bunlar örnekten aşağı doğru çıkarılmayabilir ve FACS analizi ve sıralama işlemleri sırasında numuneyi kirletecektir. P. damicornis bir 1 cm parçası filtreleme, boyama ve yıkama sonra yaklaşık 2−10 x 10⁶ hücreleri verir.
5. Mercan parçasını plastik bir toplama torbasının içine yerleştirin ve hücre boyama ortamını mercanın üzerine püskürtmek için hava fırçasını kullanın(Şekil 2). İskeletin çoğu açığa çıkana kadar bu işleme devam edin. Kalan iskeleti toplama çantasından çıkarın.

2. Mercan dokusundan hücrelerin dissociation

NOT: Buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirin ve eldiven ile ellerinizi koruyun.

1. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre bulamacını 40 m'lik naylon hücresüzden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne filtreleyin.
   NOT: Farklı hücresüz kafes boyutları farklı türler için daha uygun olabilir. Ancak, büyük boyutlarda yetersiz doku dissosyasyonu enkaz ve hücre kümelerinin geçişi nedeniyle neden olabilir.
   1. Kalın mukus tabakalarına sahip numuneler için, 1 mL plastik şırınganın sterilize edilmiş pistonlu kısmını kullanın ve kümeleri kırmak ve hücrelerin süzgeçten geçmesine yardımcı olmak için filtreye hafifçe eziyet edin. Süzgeve pistonu hücre boyama ortamıyla santrifüj tüpüne durulayın.
2. 4 °C'de 4 °C'de 450 x g'de 5 dk.

3. Hücre boyama

NOT: Buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirin ve eldiven ile ellerinizi koruyun. Bu protokolde yer alan lekeler temsil amaçlıdır. Alternatif lekeler farklı konsantrasyonlar ve kuluçka süreleri gerektirir.

1. 500 μL'lik yeniden askıda kalmış hücreleri 5 mL'lik yuvarlak alt tüpe aktarın ve kontrol numunesi olarak bir kenara koyun. Bu aliquot leke eklemeyin.
2. Kalan hücre süspansiyonuna 0,42 μL 12 mM DAPI canlılık boyası(Malzeme Tablosu),1 μL 5 μM reaktif oksijen türleri (ROS) lekesi(Malzeme Tablosu)ve 0,1 μL 0,2 μL lizozom leke(Malzeme Tablosu)ekleyin. Pipet iyi karıştırmak ve fotobeyazrlama önlemek için karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
   NOT: DAPI bu örnekte, FACS makinesindeki ölü hücrelerin diferansiyel gating için DNA lekesi ve canlılık boyası olarak çalışmak için kullanılır. Bu DAPI membran bütünlüğü nedeniyle ölmekte olan hücrelere nüfuz varsayar. ROS lekesi 520 nm aralığında (yeşil) ışık yayarken, lisozomal marker yaklaşık 668 nm (kırmızı) ışık yayar.
3. 4 °C'de 4 °C'de 5 dk. g Yeni bir 5 mL yuvarlak alt tüp ve buz üzerinde depolamak aktarın.

4. FACS başlangıç

NOT: Adımlar lazerler ve kanallardaki farklılıklara bağlı olarak sitometrenin matvesaline göre değişiklik gösterebilir. Bu protokol için 405, 488, 535 ve 640 nm dalga boyuna lazeriçeren bir sitometre kullanıldı. Bu protokolde yer alan filtreler temsil amaçlıdır. Alternatif hücre lekeleri filtre ve lazerler farklı bir dizi gerektirebilir.

1. Sıralayıcı yazılımında yeni bir proje şablonu oluşturmaya başlayın ve lazer panelini seçin. Lekeler ve doğal floresan kombinasyonu için dört lazeri (405, 488, 535 ve 640 nm) seçin.
2. Denemede temsil edilen beklenen her renk için uygun filtreleri seçin.
   1. Canlı ve ölü hücrelerin ayrılmasında DAPI emisyonve yardımını saptamak için, DAPI, Hoeschst veya Pasifik Mavisi filtre gibi 450/50 (425−475 nm aralığında) bandpass (BP) içeren bir filtre kullanın.
   2. Yeşil ROS sinyali tarafından yayılan ışığın tespiti için, floresan izotoyokiyanat (FITC) veya yeşil floresan protein (GFP) filtresi gibi 530/30 (dalga boyu aralığı 515-545 nm) bp'li bir filtre kullanın. Bu filtre her hücredeki ROS konsantrasyonu ölçecektir.
   3. Lysozomal leke emisyonunun saptanması için allofikomisin (APC) filtresi gibi 670/30 (655−685 nm aralığında) BP'li ek bir filtre ekleyin.
      NOT: APC kanalı fagositik aktivitenin ölçülmesine olanak sağlayacaktır. Bu kanal aynı zamanda simbiyodiniaceae ailesinden mercan simbiyotik algler tarafından oluşturulan otofloresans tespit edecektir. Ancak bu sinyal, APC filtresinden daha uzun dalga boyuna sahip ek bir kanal kullanılarak ayrılabilir.
   4. 780/60 (750-810 nm aralığı) bp olan bir filtre dahil, en yaygın olarak kullanılan phycoerythrin gibi, siyanür filtresi (APC-Cy7), Symbiodiniaceae uzak kırmızı otofloresan semisyonu algılar ve apooardisyal hücrelerin izolasyonyardımcıolur.

5. FACS gating kurulumu

NOT: Adımlar sitometrenin ve satın alma programının sitometreile birleştiğinde yapılan ve modele göre değişiklik gösterebilir.

1. Sitometri yazılımının proje deneysel ekranında, bir dağılım çizimi oluşturun ve Y ekseni için X ekseni ve yan dağılım (SSC) için metrik olarak ileri dağılım (FCS) seçin.
   NOT: FCS hücrenin boyutu ile ilişkilidir ve SSC parçalılık ile ilişkilidir. Bu en enkaz kaldırılması için izin verecektir, çoğu bozulmamış hücrelere göre boyutu daha küçük olacak gibi.
2. Hücre boyutları ve taneciklilik, özellikle mercanlarda çeşitli büyüklük sıralarınagöreAdeğişebileceğinden eksenleri logaritmik veya biüstential ölçeklere ayarlayın.

6. FACS analizi ve hücre izolasyonu

NOT: Adımlar sitometrenin ve birleştirilmiş satın alma programının molası ve modeline göre değişiklik gösterebilir.

1. Denetimi (örneğin, lekelenmemiş hücre alt kümesi) sitometrenin örnek odasına yerleştirin ve okuma işlemini başlatın. Bilgisayar her hücreden veya olaydan veri almaya başladığında, dağılım çiziminde noktalar görünmeye başlar. Önceki deneylerden sitometre odalarında kalan enkazı temizlemek için, analize başlamadan önce yaklaşık 30 s geçmesine izin verin.
2. Dağılım çiziminde, noktaları ortalamak için fotoçarpan tüpü (PMT) gerilimini ayarlayın.
   NOT: PMT gerilimi ölçülen fotonların sinyal mukavemetini yükseltmek için kullanılır; PMT gerilimi çok zayıfsa, daha az hücre okunur ve PMT gerilimi çok güçlüyse, hücreler maksimum değere yakın ölçülür ve farklı hücre türleri birbirinden ayırt edilemez olur. Yeterli bir PMT gerilimi, bağımsız olarak ayırt edilebilir olayların dağılım çizimini doldurmasını sağlar. Olay ayrımı, Logaritmik veya biexponential ölçekleri FSC ve SSC dağılım çizimlerine yansıtarak görselleştirmek daha kolaydır.
3. Olayları kaydetmeye başlayın. Örneği korumak için, yaklaşık 15.000 olay okunduktan sonra veri toplamayı duraklatın. Çoğu durumda, bu genel hücre popülasyon uyplarını görselleştirmek için yeterli olacaktır. Küçük, özel hücre popülasyonlarını analiz edip yalıtıyorsanız daha fazla olay kaydedin.
4. FSC ve SSC'nin ilk grafiğinde, FSC X ekseninde 10² işareti ve üzeri hücrelerin bir seçim veya kapı oluşturun. Bu eşiğin altındaki her şey muhtemelen hücresel enkaz. Akış sitometri yazılım programlarında düzenli bir seçenek olan ve açık, farklı hücre popülasyonları için iyi dikdörtgen kapılar çizin. Dağılım çizimlerinde daha düzensiz bir şekil alan hücre popülasyonları için çokgen bir gating seçeneği kullanın.
   NOT: En küçük mercan hücreleri için ön dağılımda en az 10² kesit seçilmelidir, ancak enkazın kirlenmesine izin verebilir. Bunu değiştirmek için, daha muhafazakar olmak için gating alt sınırını artırmak.
5. X ekseninde DAPI filtresini ve Y ekseninde APC-Cy7 filtresini ifade eden yeni bir dağılım çizimi oluşturun. Bunu yapmak için, adım 6.4'te oluşturulan bozulmamış hücreler için geçidi seçin, sağ tıklatın ve yeni bir dağılım çizimi oluşturma seçeneğini seçin. Eksenleri logaritmik veya biüstel ölçeklere ayarlayın.
   NOT: Yeni bir çizim oluşturmak için gereken adımlar farklı yazılım programlarına göre değişebilir.
6. Şimdi sitometre odasından kontrol örneğini çıkarın ve lekeli hücrelerle değiştirin. Analize başlamadan ve verileri kaydetmeden önce 30'ların geçmesine izin verin. Duraklamadan önce yaklaşık 15.000 hücre kaydedin.
   NOT: APC-Cy7 ölçeğinin üst ucundaki belirgin popülasyon(lar), Symbiodiniaceae'den gelen yüksek kırmızı otofloresansa sahip olanlardır. Bu popülasyon kırıklarını görselleştirmek için leke ye gerek yoktur ve bunlar kontrol numunesi kaydında da görülebilir (Şekil 3C). Daha fazla farklılaşma için yalnızca mercan popülasyonları olan Y ekseninde daha düşük popülasyonlar için seçin.
7. Yine logaritmik veya bikonential ölçekler kullanarak, ROS konsantrasyonları (FITC filtresi) ve lizozom (APC filtresi) pozitif hücreleri görselleştirmek için aposimotik hücrelerin yeni bir dağılım arsa oluşturun.
   NOT: Aposimbiyotik birden fazla hücre popülasyonu varsa, her biri kendi dağılım çiziminde daha da ayırt edilebilir (Şekil 3C,D).
8. Lekeli örnek grubunu, kontrol örneğinin ilk kaydını kullanarak veya kontrol grubunu yeniden ekleyerek ve yeniden çalıştırarak, lekesiz alt kümeyle karşılaştırın. Lekeli örnek grubuna özgü olayları kapıla.

7. FACS sıralama ve toplama

NOT: Adımlar sitometrenin ve satın alma programının sitometreile birleştiğinde yapılan ve modele göre değişiklik gösterebilir.

1. Toplamak için seçilen hücre seçimi yle, mikrosantrifüj tüpleri (toplanan hücre sayısına ve depolama yöntemine göre 250−500 μL hücre kültürü ortamı veya lysis tamponu içeren) sitometre toplama odasına yerleştirin.
   NOT: Temsil edilen akış sitometresi aynı anda dört farklı popülasyonu sıralama yeteneğine sahiptir ve makine çeşitli santrifüj tüpleri ve 96 kuyu plakası da dahil olmak üzere çeşitli toplama aygıtlarını tutacak şekilde yapılandırılabilir.
2. Sitometre numuneyi okumaya başladığında ve enkazları temizlemek için uygun bir süre geçtikten sonra, istenilen popülasyonları sıralamaya başlayın ve 20.000 hücreden birkaç milyona kadar her yerde toplayın.
   1. 500.000'den fazla hücre için hücre kültürü ortamının veya lysis arabelleği hacmini ve toplama aygıtının hacmini ayarlayın.
   2. In vitro çalışmalar için, bir kuvöz veya sterilbir ortama yerleştirilenkadar buz üzerinde hücreleri depolar.
   3. Moleküler çalışmalar için, ya hemen DNA/RNA/protein izolasyon işlemine başlayın ya da flaş dondurma ve ekstraksiyona kadar -80 °C'de saklayın.
3. Her yeni leke, tür veya ayıklayıcı kullanıldığında, en az 20.000 ilgi hücresini 500 μL boyama ortamına ayırarak, daha sonra sıralanmış hücreleri yeniden analiz ederek ve hücrelerin başlangıçta sıralamak için kullanılan kapı içinde okunduğunu doğrulayarak, ilgi popülasyonu üzerinde saflık kontrolü gerçekleştirin (Şekil 4).

Results

Genel olarak, bu protokol, fonksiyonel analizler için kullanılabilecek canlı mercan hücresi popülasyonlarının tanımlanmasını ve toplanmasını kolaylaştırdığı için yararlıdır. İş akışı, mercan dokularının altta yatan kalsiyum karbonat iskeletinden mekanik olarak ayrılması ile başlamıştır (Şekil 1). Bu en önemli ilk adımlardan biridir, çünkü yanlış teknik yüksek hücre mortalitesi ile sonuçlanır ve büyük miktarda enkaz oluşturabilir. Enzimatik ayırma tavsiye edil...

Discussion

Bu protokol Rosental ve ark.^18'den uyarlanmış ve P. damicornis hücrelerinin tanımlanması ve izole edilmesi için geliştirilmiştir. Metodoloji enkaz kaldırmak için örnekleri filtreleme sürecine odaklanır, cansız hücreler, ve Simbiyodiniaceae barındırılan hücreleri hücre içsel faktörlerin incelenmesi yoluyla, göreceli hücre büyüklüğü de dahil olmak üzere, göreceli hücre granüleritliği, hücre otofloresans, ve bozulmamış hücre zarlarının varlığı. Bu teknikler diğer mercan türlerine uygulanabil...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airbrush Kiti & Kompresör	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Serisi Master TC-20 Kompresörlü Tek Etkili Sifon Beslemeli Airbrush Kiti & Hava Hortumu
BD FACSAria II	BD	644832
Kemik Kesiciler	Okyanuslar	205357	Harikalar Mercan Taşlı Kemik Kesici
Hücre Süzgeci	Corning	352340	40 um; BD Şahin; ayrı ayrı sarılmış; steril; naylon
CellRox Yeşil	Yaşam Teknolojileri	C10444	DMSO'da 2.5 mM; Uyarma / Emisyon: 485/520 nm
Toplama çantası	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6 "L x 4" W Fermuarlı Contalı Standart Tekrar Kapatılabilir Poli Çanta, Şeffaf; H2O'da 2 mil Kalınlık
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg; Uyarma / Emisyon: 358/461 nm
Fetal Buzağı Serumu	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	57 ° C'de Isı ile İnaktive Edilmiş; 30 dakika boyunca C
Hemasitometre	Sigma-Aldrich	, Z359629	Parlak Çizgili Hemasitometre
HEPES Tamponu	, Sigma-Aldrich,	H0887
LysoTracker, Deep Red	, Life Technologies	L12492	DMSO'da 1mM; Absorpsiyon / Emisyon: 647/668 nm
Mikrosantrifüj tüpleri	VWR	87003-294	1.7 mL
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7.4; 10X
Yuvarlak tabanlı tüpler	VWR	352063	5 mL Polipropilen Yuvarlak Tabanlı
Tüp Şırınga	BD	309628	1 mL BD Luer-Lok Şırınga steril, tek kullanımlık polikarbonat