Kriosferik Habitatlarda Biyobelirteçlerin Yerinde Ölçümleri için Yeni Non-Invaziv Araç Olarak Lazer Kaynaklı Floresan Emisyon (L.I.F.E.)

Kriyosfer deniz buzu, buzullar, yüksek dağ gölleri, kar alanları, göl buzu, eriyen su akıntıları ve donmuş buz barındırıyor. Bu alanlar dünya'nın kara kütlelerinin yaklaşık^'inikaplar 1^,2 ve bilinen bir kriyosferik ortam olarak atmosfer tarafından kapsamaktadır. Son çalışmalar kriyosferin büyük alanları hızla geri çekilme olduğunu göstermektedir^3,4. Antarktika^5,6, Alpler⁷, Arktik⁸, ve diğer bölgelerde negatif buz kütle dengeleri göstermektedir. Buzulların ve buzulların geri çekilmesi dünya üzerindeki en büyük tatlı su rezervuarımızın tükenmesine yol açar. Bazı bölgelerde, buzul geri çekilme durdurulamaz⁵.

Uzun bir süre, buz ekosistemleri steril ortamlar olarak kabul edildi. Ancak, sert koşullara rağmen, dünyanın kriyosferaktif yaşamın varlığı belirgindir^{9,10,11,12,13,14,15} . Eriyerek büyük buz kayıplarına doğru olan eğilim nedeniyle, kriyosfer biyolojik aktivitede bir değişim geçirerek komşu habitatları etkiliyor. Bu kısmen geri dönüşü olmayan değişiklikleri anlamak için, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip yerinde koşullarda buzdaki biyolojik aktiviteyi araştırmak için yöntemlere ihtiyacımız vardır.

Supraglacial ortamlarda, yaşam kriyokonit delikleri bulunabilir, kar kapakları, erimiş su, akarsu, ve çıplak buz yüzeyleri. Ancak, en belirgin supraglacial habitatlar kriyokonit delikleri vardır. Onlar küresel glaciated ortamlarda görünür ve ilk İsveçli kaşif Adolf Erik Nordenskjold tarafından Grönland bir sefer sırasında tarif edildi^16,17. Bu isim Yunanca "kryos" (soğuk) ve "konia" (toz) kelimelerinden gelmektedir. Aeolian kaynaklı koyu organik ve inorganik enkaz buz yüzeyine eklemek ve yerel albedo azaltmak. Güneş radyasyonu^derinbuz tabakaları halinde enkaz erime teşvik, alt 9 tortu (kriyokonit) ile silindirik havzalar oluşturan. Kriyokonit delikleri buzul ablasyon bölgelerinin %0.1-10'unu kapsamaktadır^11.

Kriyokonit toplulukları virüsler, mantarlar, bakteriler, siyanobakteriler, mikroalglar ve protozoalardan oluşur. Bölgeye bağlı olarak rotiferler, nematodlar, kopepodlar, tardinler ve böcek larvaları gibi metazoa organizmaları da bulunabilir. Edwards ve diğerleri¹⁸ kriyokonit delikleri "buz gibi sıcak noktalar" olarak tanımlar. Ayrıca N, Fe, S ve P bisikletinden sorumlu kriyokonit deliklerinde fonksiyonel genlerin izini sürdüler. Mini göl ekosistemleri çok daha sıcak ve daha fazla besin açısından zengin habitatlarda bulunan oranlarda respire ve fotosentez¹¹. Bu bulgular supraglacial ortamlarda mikrobiyal sekestrasyonun önemli rolünü vurgulamaktadır. Kriyokonit deliklerinde yaşayan toplulukların yanı sıra, çıplak buz yüzeyleri buz yosunları tarafından iskan edilir. Fizyolojileri iyi incelenmiştir¹⁹ ama mekansal dağılımları²⁰olarak değerlendirilmemiştir. Supraglacial ortamlarda onların varlığı albedo azalır ve bu nedenle bir besin outwash ve aşağı habitatlar içine besin girişine yol açan erime teşvik⁹. Artan sıcaklıklar ve dolayısıyla, sıvı su daha yüksek kullanılabilirliği, bu buzlu ekosistemlerde net ekosistem verimliliğini etkiler.

Supraglacial ortamlarda, fotosentetik olarak aktif organizmalar inorganik karbon ve azotu organik, mikrobiyal gıda ağı^21,22'yedönüştürür. Şimdiye kadar supraglacial karbon akıları tahmin birkaç çalışma vardır^11,20,23. Karbon akısı önerilen oranlarda tutarsızlık düşük mekansal ve zamansal veri çözünürlüğü sonuçları. Ayrıca, kriyokonit delikleri dışında supraglacial toplulukların mekansal dağılımı ancak değerlendirilir. Cook ve diğerleri²⁰ supraglacial alg toplulukları geniş yüzey kapsama nedeniyle çağdaş kriyokonit delikleri daha 11x daha fazla karbon düzeltmek kendi modellerinde tahmin. Numune bütünlüğünü güvence altına alan supraglacial alg topluluklarının tespiti, yerinde algılama ve niceleme için eksik araçlar nedeniyle hala engellenmiştir.

Lojistikteki zorluklara yanıt olarak, buz ekosistemleri ılıman bölgelerdeki habitatlara göre daha az incelenmiştir. Veri çözünürlüğü değerlendirilen örnek sayısına ve çalışma alanlarının erişilebilirliğine bağlıdır. Testere, korneç ve sonraki erime gibi standart örnekleme yöntemleri mikrobiyal topluluğun manipülasyonunu içerir. Örneğin, katı buz örneklerinde klorofil_a (chl_a)değerlendirmesi, önemli bir girişim olmaksızın standart yöntemlerle mümkün değildir. Bu nedenle, araştırılan mikrobiyal topluluklar içinde erime kaynaklı sıcaklık değişiklikleri kaçınılmazdır. Psychrophiles²²fotosistem II ve diğer hücresel yapıların termolizme yanıt olarak, erimiş buz örneklerinin laboratuvar analizleri her zaman yerinde koşullarda bir tahrifata yol açacaktır.

Yerinde olmayan ölçümler, güvenilir veri elde etmenin tek makul yoludur. Bu hedefe floresan tabanlı yöntemlerle ulaşılabilmektedir. Onların ışık hasat fonksiyonu nedeniyle, chl_a ve B-phycoerythrin (B-PE) supraglacial ortamlarda karbon döngüsüne katkıda bulunan organizmalarda mevcut, Anesio ve diğerleri tarafından kanıtlanmıştır¹¹. Bu nedenle, bu floresan moleküller buz ekosistemlerinde mikrobiyal aracılı karbon akılarının nicelleştirilmesi için uygun biyobelirteçlerdir.

Bu çalışmada, karasal ve buz ekosistemlerinde chl_a ve B-PE moleküllerinin yerinde nicelleştirilmesi için yeni bir non-invaziv aletin geliştirilmesini, kalibrasyonlarını ve uygulanabilirliğini sarıyoruz. Prototip cihaz lazer kaynaklı floresan salınımına dayanıyor, l.i.f.e. olarak da bilinir. Optik cihaz(Şekil 1),lazerle indüklenen floresan uyarma sonrası floresan biyomarker imzalarını yakalar. İşlem zararsızdır ve çalışma alanında veya laboratuvarda yapılabilir.

Şekil 1: L.I.F.E. prototipi. Sol: Koruyucu kapaksız aletin fotoğrafı. Sağ: Enstrümanın şematik illüstrasyonu. Toplam kütle = 5,4 kg (lazer ve optik = 4,025 kg, dizüstü bilgisayar = 1,37 kg). Alüminyum çerçeve = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. Optik boru: 18,4 cm x 4 cm (çap). CCD: bluefox mv220g sensörü; F: servo yönlendirilmiş uzun geçiş filtreleri (450 nm ve 550 nm); L: optik lensler; M1: aynalar; M2: dikroik ayna; MC: mikrodenetleyici; P: prizma; PBS: polarize ışın ayırıcı; S: ayarlanabilir jiletlerden yapılmış yarık diyafram. Ölçek çubuğu = 70 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Taşınabilir çift dalga boyu kiti 4,5 kg ağırlığında dır ve harici bir bilgisayarla birlikte bir tripod üzerinde kullanılır. Alan kurulumu hızlı ve kolaydır. Cihaz tripoda takılıdır ve lens tüpü usb kablosu ve kamera kablosu ile birlikte cihaza takılır. Harici bilgisayar bir USB kablosu kullanılarak cihaza bağlanır. Tripod ayakları, mercek tüpüne doğru yönlendirilen ve numuneyi kapsalsağlayacak şekilde ayarlanır. Daha sonra, 5 mW yeşil lazer spektrometrenin optik eksenine doğru polarize ışık yönlendirir bir polarize ışın ayırıcı geçtikten sonra örnek vurur. Örnek, Şekil 1'dekırmızı ile gösterilen floresan Bir ışık sergiler. Kollamalı ışığın yarısı polarize ışın ayırıcısını geçer ve lazer sinyallerini kaldıran servo yönlendirmeli uzun geçiş filtresinden odaklanır. Daha sonra, sinyal iki ayarlanabilir jilet oluşan bir diyafram yarık vurur. Bir prizma spekülatif sinyal sensör tarafından yakalanan önce yarık diyafram ışık ortogonal ince çizgi ayırır. İşlem mavi lazer ile tekrarlanır. Ham veriler, yazılım işlemi için de kullanılan taşınabilir bir bilgisayara otomatik olarak aktarılır.

Cihaz, CCD kamera ile fotoğraf çekme, lazerleri açma/kapatma ve uzun geçişli filtre tekerleğidöndürme ile görüntü çekme yi senkronize eden bir LabVIEW ortamı kullanılarak harici bir bilgisayar tarafından kontrol edilir. Grafik kullanıcı arabirimi (GUI) üç ana bölüme ayrılmıştır. Pozlama ayarı el ile yapılır. Pozlama süresi ile sinyal yoğunluğu arasındaki düzeltme doğrusal olmasına rağmen(Şekil 2B),maksimum pozlama süresi 10 s ile sınırlıdır, çünkü daha uzun entegrasyon süreleri sinyal-gürültü oranında önemli bir azalmaya yol açar. Açıklama alanı, örneğin tanımı için kullanılır (Şekil 2A). Sağ bölümde, ölçümler biter bitmez ham görüntüler görüntülenir. Bu özellik, alandaki acil veri değerlendirmesi için çok önemlidir(Şekil 2C–E). Kırmızı alanlar, pozlama süresini kısaltarak önlenebilecek aşırı pozlanmış pikselleri gösterir.

Sonraki ham veri azaltma işlemi görüntü edinme yordamından çıkarılır ve görüntü edinimi nden sonra herhangi bir zamanda yapılabilir.

Şekil 2: Veri toplama ve ham veri değerlendirmesi için L.I.F.E. grafik kullanıcı arabirimi. (A) Yazılım örnek açıklamalar için manuel metin girişi sağlar. (B) Pozlama süresi ölçümden önce ayarlanabilir. (C−E) Ham görüntüler arabirimin sağ tarafında görüntülenir. (E) Kırmızı renkler sensörün doygunluk gösterir. (F) RUN ÖLÇÜM düğmesinin aktivasyonu veri toplama işlemini tetikler. (G)dizisinde, veri toplama sırasında otomatik olarak çalıştırılan tüm komutlar görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ham görüntü örneği. Sol: L.I.F.E cihazı ile kaydedilen aseton çözeltisinde_standart chl ham verileri. Cihazın optik özellikleri nedeniyle, sinyal çarpık bir çizgi olarak görüntülenir. Sağ: Piksel başına ham görüntünün yorumlanması (px). Spektral eksen (5 nm/px çözünürlük) uzamsal eksen (30 μm/px çözünürlük) karşı çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

12-bit gri ölçekli ham görüntüler, tek boyutlu diyafram yarık ve CCD'nin önündeki prizmaya bağlı spektral bileşen nedeniyle uzamsal bir bileşen gösterir(Şekil 3). Optik kısıtlamalara yanıt olarak ham görüntüler deforme olur. Bu nedenle, bozulma derecesini tanıyan bir kod uygulanarak kırpılması ve yok edilmesi gerekir. Bu bir yazılım sihirbazı ile yapılır (Şekil 4). Daha sonra, dalga boyu kalibrasyonu 532 nm lazer ile yapılır. Yeşil ışık 1.064 nm kızılötesi lazer frekans iki katına tarafından üretilir. Her iki dalga boyu da CCD tarafından tespit edilebilir ve bu nedenle her pikselin spektral konumu otomatik olarak dewarped görüntülerde hesaplanabilir (Şekil 4).

Resim daha sonra belirli bir dalga boyu aralığına (yeşil lazer ölçümleri için 550-1.000 nm ve mavi lazer ölçümleri için 400-1.000) aşağı kırpılır. Seçili piksel satırındaki her pikselin gri değerleri sayılır ve özetlenir. Gri bir değer 0-255 arasında değişebilir. Bundan sonra, her piksel satırı bir sayı için hesaplar. Ekrandaki diğer yazılım yönergeleri, uzamsal koordinatlara göre çizilen her piksel satırındaki gri değer sayılarını gösteren bir çizim oluşturmasına yol açar. Bu, örnekte aynı anda chl_a ve B-PE'nin nicel mekansal ayrımcılığa izin verir. Ayrıca, bir örneğin spektral özellikleri seçilen piksel çizgilerinden otomatik olarak çizilebilir.

Şekil 4: Ham görüntüleri dewarping. Sol: Ham görüntü yeşil bir lazer ile yakalanan. Filtre kullanılmadı. Sinyaller 532 nm ve 1.064 nm'de görüntülenir. Pozlama süresi = 0.015 s. Merkez: Kırpılan 532 nm sinyali, bir dizi görüntüyü etkisiz hale getirmek için referans çizgisi olarak kullanılır. Sağ: Ham görüntü kaynağından dewarped görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Kalibrasyon ve doğrulama

NOT: Pigment kalibrasyonu için chl_a ve B-PE stok çözeltilerinden seyreltme satırları hazırlayın. Chl_bir stok çözeltisi aseton ile seyreltilir ve B-PE distile steril su ile seyreltilir. Daha sonra her seyreltme adımının 15 mL'si gerekecektir. Alüminyum folyo ile sararak pigmentleri ışıktan koruyun. Chl_a'yı dondurucuda ve B-PE'yi daha fazla kullanılana kadar buzdolabında saklayın. Seyreltme satırı için ayrıntılı bir protokol, chl_a için 1.1 ve B-PE için 1.2 bölümlerinde yer a'dır. Pigment algılama ve L.I.F.E. cihazı ile nicelleştirme için hem chl_a hem de B-PE laboratuvar kalibrasyonu aşağıda açıklanmıştır. Bir önceki kalibrasyon²⁴ bu çalışmada olduğu gibi aynı pigmentler ile yapıldı.

1. Klorofil_bir seyreltme sırası
   1. 50 mL numune tüpünde 1 mg_chl a (A. nidulans alglerden arındırılmış) aseton ile çözün ve bu chl'yi aseton lu_bir stok çözeltisini aşağıdaki son konsantrasyonlara seyreltin: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; ve 0,5 ng/mL.
   2. Her seyreltmenin 15 mL'sini 50 mL numune borularına aktarın ve ışık hassasiyeti nedeniyle alüminyum folyo ile kaplayın. Kalibrasyon ölçümleri yapılana kadar tüpleri -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
      NOT: Protokol burada kesilebilir.
   3. Trilyon bir çift ışın spektrofotometre her seyreltme her_seyreltme özellikleri ölçün ve bölüm 2.2.2 ayrıntılı olarak açıklanacaktır Lorenzen²⁵tarafından açıklandığı gibi chl_bir içerik hesaplamak.
2. PE seyreltme sırası
   1. 4 mg/mL B-PE stok çözeltisini steril filtrelenmiş suyla (pH = 7) aşağıdaki son konsantrasyonlara seyreltin: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; ve 5 ng/mL B-PE. 50 mL numune tüpünde her seyreltmenin 15 mL'sini aktarın ve üzerini alüminyum folyo ile kapatın. Daha fazla kullanım anına kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Protokol burada kesilebilir.
3. Kalibrasyon için kurulum
   1. Şekil 5'te gösterildiği gibi, her biri bir biri bir sonrakinden 1,5 cm daha yüksek olan üç ölçüm platformu oluşturmak için bir raf oluşturun.
      NOT: Raf ve sütun yüksekliği ölçümler için önemli bir rol oynar, çünkü sıvıların yüzeyi Şekil 5'tebelirtildiği gibi L.I.F.E. cihazının odak noktasında kalmalıdır.
   2. Bir polisscintillation plastik şişe en yüksek konsantre seyreltme 5 mL ekleyin ve rafın en yüksek noktasına koyun. Floresan yoğunluğunu ölçün.
   3. Şişeyi rafın orta yerine yerleştirin ve 5 mL (10 mL toplam hacim) daha ekleyin. Floresan yoğunluğunu ölçün. İşlemi raftaki en düşük pozisyonda 5 mL (15 mL toplam hacim; toplam 45 mm kolon yüksekliği) ile tekrarlayın.
      NOT: Dedektör doygunluğunu önlemek için her seyreltme adımı için pozlama süresini (12 bit görüntülerde 255'in üzerindeki gri değerler) ve zayıf floresan sinyallerinin yeterli sinyal-gürültü oranı için uyarla.
   4. 1.3.2 ve 1.3.3 adımlarını tüm seyreltmelerle (1.1.1 ve 1.2.1) chl_a ve B-PE'nin tekrarlayın.
   5. Oluşturulan veri dosyalarını, Y ekseni (uzamsal dağılım) boyunca her piksel satırındaki gri değerleri otomatik olarak saymak ve toplamabilmek için veri azaltma sihirbazına yükleyin.
      NOT: Değişen maruz kalma süreleri, floresan yoğunluğunu 1 s'lik bir entegrasyon süresine göre normalleştirerek otomatik olarak telafi edilir.
   6. Seyreltme serisinden bilinen konsantrasyonları ve hesaplanan normalleştirilmiş floresan yoğunluklarını kullanarak Poisson regresyon analizi ile pigment alan yoğunluğunu hesaplayın. Daha sonra floresan sayar üç farklı sütun yükseklikleri 1.5 cm (5 mL) bir faktör (faktör 1, 0.5 ve 0.33, 5 mL, 10 mL ve 15 mL konsantrasyon çözümleri için sırasıyla) sayıları çarparak.

Şekil 5: Laboratuvar koşullarında CHL_A ve B-PE ile L.I.F.E. kalibrasyonu nun ayarlayışı.
(A) Cihazın lens tüpü. (B) B-PE uyarma için yeşil lazer. (C) Chl_bir uyarma için mavi lazer. (D) Sintillasyon şişesi. (E) L.I.F.E. cihazının odak noktası. (F) B-PE/su veya 5 mL, 10 mL ve 15 mL ile_asetonçözeltisi/chl. (G) Her çözeltinin yüzeyini odak düzleminde üç farklı birim de tutan spacerler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Örnekleme ve numune işleme

1. Kar ve buz koleksiyonu
   1. Steril polietilen torbalar içine bir buzul kar ve supraglacial buz toplamak ve daha fazla işleme kadar dondurulmuş saklayın.
      NOT: Bu çalışma için numuneler, Svalbard'ın yüksek Arktik Takımadaları'ndaki Ny-Ålesund araştırma köyü yakınlarındaki politermal buzul midtre Lovenbreen'de (MLB) toplanmıştır (78°53' N, 12°03' E).
   2. Buzul ön sahasından steril polietilen torbalara örnek bakteriyel paspaslar ve daha fazla işleme için tüm numuneleri bir laboratuvara taşıyın.
   3. Donmuş malzemeyi karanlıkta 4 °C'de yavaşça eritin. GF/F filtrelerinde sıvı numuneleri (47 mm çapında) filtreleyin ve filtrelenmiş hacmine dikkat edin. Filtreleri daha fazla işleme ne kadar dondurdu.
2. Klorofil_bir ölçüm
   1. L.I.F.E. cihazını kullanarak filtreyi, her biri yeşil ve mavi lazer kullanarak üçe kölçülen dört rastgele alanda ölçün. Filtrelenen alan ve filtrelenmiş hacim ile alan yoğunluğunu çarparak genel pigment konsantrasyonu hesaplayın. Pigment konsantrasyonu (μg/L) 1 L hacmine normalleştirin.
   2. Lorenzen²⁵tarafından protokole göre gf/f filtrelerinin_içeriğini laboratuvar standardı ile değerlendirin. Bunun için filtrelerin her birini 13 mL aseton içeren bir şişeye koyun ve bir gecede 4 °C'de karanlıkta saklayın. Daha sonra, bir şişe almak ve sürekli modda% 50 güç 2 dakika sonication önce buz üzerine yerleştirin. Filtreyi sıkın ve şişeden çıkarın.
   3. Bir şırınga için tygon tüp takın ve şişe den chl_bir ekstraksiyon-aseton karışımı çıkarın. Tygon tüplerini GF-5 filtre tutucu ile değiştirin. Çözeltiyi kuvars cuvette aktarın.
   4. Aseton için emici spektrometreyi kalibre ettikten sonra, numuneyi cuvette'deki spektrometreye yerleştirin ve 400-750 nm arasındaki emici özellikleri ölçün. Daha sonra, spektrometreden cuvette'yi çıkarın ve numuneye 200 μL 2 M HCl ekleyin. Daha sonra, örnekteki faeofitin içeriğini ölçmek için emicilik ölçümlerini tekrarlayın.
3. Radyoetiketli belirteçler ile mikrobiyal aktivitenin ölçülmesi ve lazer yoğunluğu ve maruz kalma süresinin verimlilik oranlarına etkisi
   DİkKAT: Marker radyoaktivitesine (β-radyasyon) dikkat edin. Bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük kullanın ve lisanslı bir izotop laboratuvarında bir duman başlık altında çalışmak.
   1. Bakteriyel üretim için steril polietilen torbalar içine bakteriyel paspaslar beş aliquots aktarın. Formaldehit ile kontrolleri %4 nihai konsantrasyona kadar inaktive edin.
      NOT: ³H etiketli lösin alımı için üç aliquot kullanılır ve kontrol olarak iki aliquot kullanılır.
   2. Paspasları mavi lazer (405 nm, 5 mW) ve yeşil lazer (532 nm, 5 mW) ile 10 s ve 30'ar s'lik bir er itimatla teşrin. 50 mW lazerile işlemi tekrarlayın. Daha sonra formaldehit ile tedavi edilmeyen örnekleri çalıştırın.
      NOT: Sadece bir lazer maruziyeti için bir paspas kullanılır. Maruz olmayan mikrobiyal paspasları kontrol olarak kullanın.
   3. Lazer tedavisinden sonra, sırasıyla ³H-lösin ve NaH¹⁴CO_3'übirleştirerek bakteriyel ve primer üretimi tahmin edin. Bakteriyel üretim ölçümleri için, numune başına beş aliquot (20 mL) kullanın ve işaretleyicinin abiyotik birleşmesini kontrol eden paralellerden ikisine formaline (%4 nihai konsantrasyon) ekleyin. Çeşitli tedavilerin tüm örneklerine ³H-lösin (40 nM) ekleyin ve yerinde koşullarda (0,1 °C) 4 saat kuluçkaya yatırın. Kalan canlı örneklere formaline ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
   4. Bakteriyel paspasların bakteri üretimi için, etiketli örnekleri cryovials'a aktarın. Kirchman²⁶ ve Bell²⁷tarafından protokollere göre 5% trikloroasetik asit ve santrifüj ile ekstrakt hücreleri 10.000 x g 5 dk için . Scintillation sıvı ekleyin ve bir polisscintillation vial içine cryovial koyun. Numuneleri sıvı bir sintillasyon sayacı ile analiz edin ve alım oranlarını hesaplayın.
      NOT: ³H etiketli lösin alımı için üç aliquot kullanılır, kontrol olarak iki aliquot kullanılır.
   5. Birincil üretim için, çeşitli tedaviler (100 mL) beş kopyaları hazırlamak, karanlık örnekleri taklit etmek için alüminyum folyo içine iki sarın ve herkese NaH¹⁴CO₃ (1 μCi) ekleyin. Ortam ışığında 4 saat ve yerinde sıcaklıkta (0.1 °C) kuluçka. Kalan üç çoğaltmayı koyarak reaksiyonu sonlandırın ve numuneyi GF/F filtrelerine (25 mm çapında) filtreleyin.
   6. Filtrelere 100 μL 2 N HCl ekleyin ve tüm fazla karbonu çıkarın ve duman kaputunun altında havanın dışarı çıkmasına izin verin. Numuneleri 80 °C'de ısıtma plakası üzerinde kurutun ve numuneleri polissintillasyon şişelerine yerleştirin.
   7. Birincil ve bakteriyel üretimin tüm tedavilerinin dakika başına radyoaktif parçalanmalarını (dpm) ölçmek için cryovialleri polissintillasyon şişelerine yerleştirin ve 5 mL'lik Sintillasyon kokteyli ekleyin. DPM'yi sıvı bir sintillasyon sayacı ile ölçün ve alım oranlarını hesaplayın.

B-PE için laboratuvar kalibrasyonu
B-PE seyreltme sırasının tepki sinyalleri 20 °C'de karanlık bir odada l.i.f.e. cihazı ile ölçüldü (Şekil 6). Sayım oranı ölçülen numunenin hem konsantrasyonuna hem de kolon yüksekliğine bağlı. Düşük konsantrasyon ve düşük kolon yüksekliği B-PE numunesi aynı konsantrasyon ve daha yüksek kolon yüksekliğindeki numunelere göre daha güçlü floresanda.

Şekil 6: B-PE laboratuvar kalibrasyonu. B-PE içeriği ve kolon yoğunluğu kalibrasyonu gösterilir. Normalleştirilmiş sayım oranları 1,5 cm. İzni ile yeniden basım için hesaplanmıştır28. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Son kalibrasyon hattı uyumu için bir Poisson regresyonu kullanıldı. Alan yoğunlukları ile piksel grisi değer sayıları arasında doğrusal bir korelasyon vardı. Eğrinin işlevi y = 81.04x(Şekil 7)idi, yani 1 s maruz kalan numunede 8.104 gri değer sayma oranı 100 ng/cm2 B-PE alan yoğunluğuna eşittir. Chla kalibrasyonu analog bir şekilde ayarlanır. İşlev y = 8.94x idi.

Şekil 7: B-PE için son kalibrasyon eğrisi. Gri değer sayımları 1 s'lik bir pozlama süresine göre normalleştirildi ve alan yoğunluğuna göre çizildi. İzin28ile yeniden yazdırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Svalbard'dan kriyokonit örnekleri ve verilerin laboratuvar doğrulaması üzerine uygulama
L.I.F.E. ölçümlerinin ortalama değerleri ve aseton kullanılarak konvansiyonel ekstraksiyondan elde edilen aynı örneklerin tek ölçümleri ve spektrofotometre ile sonraki analizşekil 8'degösterilmiştir.

Şekil 8: Doğal örneklerle veri doğrulaması. Numuneler (MLB), laboratuvar spektrofotometre (tek değerler) sonuçlarına göre chla içeriğine göre sıralanır ve filtre başına dört rasgele alanda ölçülenbir floresan verisi ile karşılaştırılır. Hata çubukları L.I.F.E. ölçümlerinin standart sapması temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

48 μg/L-67 μg/L arasında değişenbir içerik küçümsendi ve 0.7 μg/L-7 μg/L arasında değişen düşük chliçeriği L.I.F.E. prototipi tarafından fazla tahmin edildi. L.I.F.E. ölçümlerinden standart sapmalar düşüktü.

Insitu ölçümlerinden elde edilen spektral verilerin laboratuvar standartları ile karşılaştırılması
Chla spectra kriyokonit örnekleri ve A. nidulans yosun saflaştırılmış olanlar arasında karşılaştırılabilir edildi. Tüm örneklerdeki floresan zirveleri 700 nm-710 nm idi. Bununla birlikte, kriyokonit örneklerinden elde edilen spektrumlar 400 nm-650 nm arasında ve 800 nm-1.000 nm arasında chla pigment standardının spektrumlarına göre daha yüksek gürültü sinyalleri göstermiştir(Şekil 9).

Şekil 9: Spektral veri yorumu. 405 nm lazerile uyarma sonrası dört kriyokonit granül (mavi) ve birchl standart pigment çözeltisi (kırmızı) ölçümleri. Spektrumlar numune koleksiyonundan 1 yıl sonra kaydedildi. Numuneler dondurulmuş olarak tutuldu ve ölçümden önce ışığa maruz kalınmadı. Dalga boyu kalibrasyon sorunlarına yanıt olarak floresan tepe noktası 680 nm yerine 700 nm-710 nm'de yer alır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Otomatik kriyokonit tahıl analizi
Kriyokonit deliğinin otomatik analizine örnek olarak(Şekil 10),piksel satırı50'de en yüksek pigment alanı yoğunlukları gözlenmiştir. 532 nm lazer ile uyarma sonrası örnek spektrum sensörün aşırı doygunluğu yanıt olarak 255 gri bir değerde bir kesik ile bir tepe gösterdi. Bu tepe yeşil lazer değil, floresan sinyal türetilmiştir.

Şekil 10: Çapı 1 mm olan tek bir kriyokonit granülün otomatik veri analizi. Örnek Vestre Brøggerbreen (VBB) toplandı ve Ny-Ålesund Arctic Station (GB) tesisinde karanlık bir laboratuvar odasında örnekleme sonra 4 saat içinde ölçüldü. Sol sütun B-PE ölçümlerini, sağ sütun da chlbir veriyi temsil eder. Ham görüntüler üstte görüntülenir. Lazere bağlı floresan yanıtları gri renkte görüntülenir. Kırmızı alanlar standart pigmentlerin tepkisini gösterir. Orta bölüm hedef pigmentlerin mekansal dağılımını göstermektedir. Floresan sinyalinin spektral özellikleri alt görüntülerde görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lazer uyarmasının bakteri paspaslarında üretkenliğe etkisi
Lazerin ve/veya maruz kalma süresinin gücünü artırırken ne primer ne de bakteriyel verimlilik etkilenmedi(Şekil 11). Güç artışı ile lazer tedavileri altında önemli bir fark saptamadı.

Şekil 11: Svalbard'dan alınan örneklerin verimlilik ölçümleri. Bakteriyel paspaslar değişen lazer yoğunlukları ve maruz kalma süreleri yeşil ve mavi lazerler ile maruz kaldı. Veriler lazer dalga boyu kaynağına (yeşil ve mavi) göre renklidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.