Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Özet

Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.

Özet

Hücreler ilaçlara verdikleri yanıtlarda doğal olarak heterojen olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, tek hücreli heterojenitenin ilaç keşif çalışmalarında hesaba katEdilmesi esastır. Bu doğru tek hücre düzeyinde bir hücre ve ilaç arasındaki hücresel etkileşimlerin bolluk ölçme ile elde edilebilir (yani, ilaç alımı, metabolizma, ve etkisi). Bu makalede, ilaçlara yanıt olarak hücrelerin metabolik değişikliklerini izlemek için tek hücreli Raman spektroskopisi ve kütle spektrometresi (MS) platformu açıklanmaktadır. Bu platformu kullanarak, ilaca yanıt metabolik değişiklikler Raman spektroskopisi ile ölçülebilir, ilaç ve metaboliti aynı hücrede kütle spektrometresi kullanılarak ölçülebilir. Sonuçlar, tek hücreli düzeyde ilaç alımı, metabolizma ve yanıt hakkında bilgilere erişimin mümkün olduğunu göstermektedir.

Giriş

Hücreler mikro ortamlarındaki değişimlere tek hücredüzeyinde farklı tepki verirler, bu fenomen hücresel heterojenlik¹olarak adlandırılır. Buna rağmen, mevcut uyuşturucu keşif çalışmaları hücre popülasyonlarının ortalama ölçümleri dayanmaktadır, hangi potansiyel alt popülasyonlar hakkında bilgi gizlemek yanı sıra tek hücrevaryasyonları². Bu eksik bilgiler bazı hücrelerin ilaçlara neden daha duyarlı olduğunu açıklayabilirken, diğerleri dirençlidir. İlginçtir, ilaç yanıtı hakkında tek hücreli bilgi eksikliği ilaçların faz II klinik çalışmaların başarısızlığı için olası bir nedenidir³. Bu nedenle, bu sorunu gidermek için, ilaç ile hücresel etkileşimleri (yani, alım, metabolizma, ve yanıt) tek hücre düzeyinde ölçülmelidir.

Bunu başarmak için, içinde yaşayan tek hücrelerin etiketsiz Raman spektroskopisi kullanılarak tarandır benzersiz bir sistem tasarladık sonra daha fazla kütle spektrometresi kullanılarak karakterize⁴. Raman spektroskopisi hücresel devletin moleküler parmak izi sağlar, hücre içinde birçok molekülün katkıları sonucu karmaşık bir spektrum. Bu karmaşıklığa rağmen, Raman parmak izleri bütün bir hücrenin yapısı ve metabolizma 5 yansıttığı düşünülebilir^5,6. Raman spektroskopisi, hücresel durumları noninvaziv ve nispeten yüksek bir şekilde ölçmede öne çıkmaktadır, bu da ilaç yanıtınıtek hücreli düzeyde taranması ve değerlendirilmesi için yararlıdır.

Buna karşılık, MS tek hücredüzeyinde ilaç alımını ölçmek için gerekli duyarlılık ve seçicilik sağlar. MS yıkıcı olduğundan (örnek [hücre] genellikle analiz sırasında tüketilir), zararsız, etiketsiz Raman spektroskopisi ile entegre yüksek iş ve hassas bir sistem sağlayabilir. Bu kombine platform ilaç alımı hakkında daha fazla bilgi sağlama yeteneğine sahiptir, metabolizma, ve etkileri tek hücredüzeyinde.

Bu el yazması entegre raman-MS platformu kullanarak in vitro kültürleri kullanarak tek hücre düzeyinde ilaçlarile hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılan bir protokol açıklanır. Bunun için hepatosellüler karsinom hücreleri (HepG2) ve tamoksifen model olarak kullanılmaktadır. HepG2 hücreleri tamoksifen almak ve ilaç metabolize çünkü seçildi, ve aynı anda hepatotoksik etkileri nedeniyle etkilenir. Bu el yazmasında iki durum kullanılmaktadır: uyuşturucu ile tedavi edilen hücreler vs. tedavi edilmeyen hücreler (kontrol).

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Uygun bir kültür medyailgi Kültür hücreleri. Kontaminasyonu önlemek için penisilin-streptomisin eklenebilir. HepG2 hücrelerinde, Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içeren bir kültür medya kültür hücreleri% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmektedir (FBS) ve 0.1% penisilin-streptomisin. Raman spektroskopisi ölçümlerini kolaylaştırmak için hücreler %0,1 jelatin kaplı cam alt çanak veya kuvars slaytlarda yetiştirilebilir.
2. 37 °C'de 2 gün, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO_2'de kuluçkaya yatırın.
3. Hücre kültürlerini senkronize edin ve %70'lik bir araya ulaşın.
4. 35 mm'lik cam dipızgara çanağına veya aynı ortayı kullanarak 0,7 x 10^6'lıkbir tohumlama yoğunluğuna giren kuvars slaytlarına alt kültür hücreleri, daha sonra 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kültür yemekleri veya slaytlar, ölçüm sırasında hayatta kalmalarını sağlayarak, 5 ug/cm² kültür yüzeyi oranı ile kollajen veya jelatin kaplama çözeltisi ile önceden kaplanabilir.

2. İlaç tedavisi

1. Hücre kültürlerini kuvözden çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS tamponu (37 °C) ile 2 kat yıkayın.
   NOT: İlaç tedavisi için hücreleri %50-60 arasında bir kesişme ile çıkarmak en uygun uyrmaktadır.
2. Hücreleri 35 mm kültür yemeklerinde ilaçla tedavi edilen ve tedavi edilmeyen alt gruplara ayırın.
3. Seçtiğiniz ilacı kültür medyasıyla karıştırın. Örneğin, dimethyl sulfoxide (DMSO) tamoksifen çözünve kültür medya ile karıştırın 2 mL ve 10 μM tamoksifen konsantrasyonu son bir hacim elde etmek için. Bu uyuşturucu tedavisi gören grup olacak.
4. DMSO'nun etkilerini incelemek için ilgili hacimde (DMSO) bir kontrol olarak ortama karıştırın. Bu kontrol grubu olacak.
5. 2.3-2.4 adımlarında hazırlanan sivri uçlu ortamın 2 mL'sinde her iki grubu da 24 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonrası beklenen kesişme %70-80 olmalıdır.

3. Raman spektral görüntüleme ve spektral işleme

NOT: Raman spektroskopi sistemleri ticari olarak mevcut olmasına rağmen, burada kullanılan Raman spektroskopi sistemi daha önce^7,8açıklanan bir ev yapımı hat tarama confokal mikroskop olduğunu. Kısaca, bu sistem 532 nm diyot pompalı katı hal lazer ile donatılmıştır. Lazer ışığı, tek bir pozlamada 400 spektrumölçümü sağlayan silindirik bir lens kullanılarak düzleme dönüşür. Raman spektrumları, parmak izi bölgesinin spektral çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak için 1.200 oluk/mm ızgara kullanan bir polikromatörün üzerine monte edilmiş soğutulmuş ccd kamera kullanılarak kaydedildi (500-1.800 cm^-1). Bu spektral alan Raman saçılımı üreten moleküllere özgü frekansların yüksek yoğunluklu içerir. Su daldırma objektifi (NA = 0.95) de kullanılır. Bu sistemin mekansal çözünürlüğü ~300 nm ve spektral çözünürlük 1 cm^-1'dir. Deney sırasında hücre hayatta kalmasını sağlamak için motorlu mikroskop aşamasına sabitlenmiş bir mikrohazettir.

1. Spektral ölçümlerden önce, optiklerin hizalanmasını doğrulayın. İğne deliği ve lazer pozisyonunun tam olarak eşleşip eşleşmediğini doğrulamak için 50 μm'lik bir iğne deliği kullanılabilir. Mümkün olduğunca daraltıldığında spektrofotometre yarık girin.
2. Her deneyden önce spektrofotometreyi kalibre etmek için etanol kullanın. Bunu yapmak için, bir cam alt çanak EtOH yerleştirin, belirli bir lazer yoğunluğunda spektrum ölçmek (örnek olarak ölçülen) için 1 s, ve bilinen dalga boyları için tepe ilişkilendirmek⁷.
3. Örneklerdeki lazer yoğunluğunu ~2,4 mW/μm^2'ye indirin, böylece hücreler lazer maruziyetinden sağ çıkabilsin.
4. Mikro hazneyi %5 CO₂ ve 37 °C'de ayarlayın.
5. Mikroskop sistemi hazır olduğunda, hücreleri kuvözden çıkarın ve hücreleri ısıtılmış PBS (37 °C) tamponla 2 kat durulayın, ardından hücreleri askıya almak için 2 mL ısıtılmış PBS (37 °C) veya DMEM ekleyin.
   NOTLAR: Hem PBS hem de FloroBritd DMEM tabanlı ortam raman spektroskopi ölçümleri için yeterli seçeneklerdir çünkü en az arka plan sinyali üretirler.
6. Su daldırma objektif in üzerine 10 μL su ekleyin ve cam alt hücre çanamasını mikroskop aşamasına hassas bir şekilde yerleştirin.
7. Lazer çizgisini odaklayarak her hücreyi ölçün. Hücre başına 15 s maruz kalma süresi burada net raman sinyali olan bir hücrenin kesitini elde etmek için yeterlidir. Bir galvano ayna birkaç düzine dakika içinde bir hücre veya hücre grubu tarama sağlar.
   NOTLAR: Hücrelerin tam spektral görüntüleme yüksek çözünürlük daha fazla zaman gerektirir ve fotohasara yol açabilir. Burada, hücreler her hücrenin bir kesitelde etmek için tek satırlık pozlama kullanılarak ölçüldü. Bu yaklaşım, iş bünyesini artırmak ve hücreleri ayırt etmek için yeterli bilgi elde etmek için iyi bir denge dir. Ayrıca fotohasarı sınırlayarak hücre canlılığını da sağlar.

4. Spektral verilerin ön işlenmesi ve çok değişkenli analizler

NOT: Ön işleme, spektral verilerdeki istenmeyen teknik varyasyonları kaldırmak için ek analizden önce gerekli bir adımdır. Yöntem ve yazılım çeşitliliği nedeniyle, ayrıntılı bir liste sağlanamaz ve literatürde bulunan birçok yararlı değerlendirmeleri vardır^7,8. Bu bölümde, yaşayan tek hücrelerden elde edilen spektral Raman verilerini analiz etmek ve yorumlamak için kullanılan yaklaşımı kısaca açıklıyoruz.

1. Olası kozmik ışın parazitini ortadan kaldırmak için Raman görüntülerini ayıklayın ve önceden işlemeyapın.
   NOT: Farklı gün/hafta/aylarda elde edilen spektrumların spektral ekseni, etanol kullanılarak kalibrasyon sırasında ki küçük teknik varyasyonlar nedeniyle bazı varyasyonlar içerebilir. Bu, sonraki çok değişkenli analizleri ve istatistiksel karşılaştırmaları güçlü bir şekilde etkileyecektir. Deneylerin farklı haftalar/aylarda yapılması durumunda, küçük optik varyasyonlar beklenmektedir. Bu durumda, verilerin deneyler arasında nihai spektral kaymaları için düzeltmek için veriler enterpolasyonlu olmalıdır. Burada kübik spline kullanarak enterpolasyon kullanılır. Bu adımdan sonra, tüm spektrum ekseni hizalanmalıdır. Sonraki analizler için 500-1.800 cm^-1 aralığı dikkate alınr.
2. Ev yapımı bir algoritma kullanarak her görüntüden hücrelerin ve arka planın (hücrelerin yokluğu) spektral verilerini ayıklayın. Hücrenin sinyalinden arka plan sinyalini çıkarın. Daha sonra, tek bir hücreye karşılık gelecek kalan piksellerin spektrumlarının ortalamasını alamalısınız. Aşağıdaki adımlar hücrelerin 2B spektrumları kullanılarak gerçekleştirilir.
3. ModPoly^9'u veya yeterince sığacağını tahmin ettiği başka bir algoritmayı kullanarak temel düzeltme gerçekleştirin. Parmak izi bölgesini seçmek ve kötü polinom takılması nedeniyle spektrumüzerinde istenmeyen kenar efektleri olmadığından emin olmak için spektral aralığı 600-1.700 cm^-1'e belirleyin.
4. Diğer normalleştirmeler düşünülebilir rağmen, spektral yoğunluğu¹⁰normalleştirmek için vektör normalleştirme (her dalga numarasındaki yoğunluk küresel l2 norm veya bir spektrumun maksimum tekil değeri ile bölünür) gibi bir normalleştirme adımı gerçekleştirin.
5. Her sınıf/koşul için uygun etikete sahip bir veri kümesi hazırlayın.
   NOT: Karşılaştırmalı spektral analizler hücre sınıfı/koşulları arasındaki olası farklılıkların doğasını araştırmak için perfored edilebilir (örneğin, kontrol grubunun ortalama spektrumunu diğer gruplara çıkararak ilgi bölgelerini (potansiyel biyobelirteçler gibi) belirleyebilir). ANOVA ve Fisher puanları hesaplamaları da¹⁰yapılabilir.
6. Spektral özelliklere göre tedavi edilen ve işlenmemiş hücreleri belirlemek için çok değişkenli analizler uygulanabilir. Normalleştirilmiş spektral veriler bir eğitim veri kümesi olarak kullanılmalı ve mümkünse çoğaltma deneyinden bilinmeyen bir veri kümesi (etiketsiz) test verisi olarak kullanılmalıdır.
   NOT: Bir temel bileşen analizinin bazı vektörü (PCA-DA^10),gizli skorlar üzerinde projeksiyon ve ardından ayrımcı analiz (PLS-DA) ve destek vektör makineleri (SVM)^11'in bazı vektörleri üzerinde yapılan ayrımcı analiz, genellikle alanında kullanılan modellerdir ve her biri farklı istatistiksel hususlar sunar. Sonuç olarak verilerin ön işlenmesi yapılmalıdır.
7. Deneysel hedeflere uygun makine öğrenimi kullanın. Burada, gizli yapı (PLS) modeli üzerinde bir projeksiyon Raman spektrum (600-1.710 cm^-1)^11,12spektral parmak izi bölgesi kullanılarak inşa edilmiştir. Verileri gerektiği gibi ortala. Modelin çapraz geçerliliği için farklı teknikler uygulanabilir.
   NOT: Burada 10 bölmeli venedik kör çapraz doğrulama uygulanmaktadır. Model karmaşıklığı (bileşen sayısı veya gizli değişken) en iyi modelkök ortalama hata (RMSE) değerini en aza indirir, böylece sınanmalıdır. Bu üç gizli vektörler (LVs) bizim veri seti ile en iyi ayrımcılık sağlanan bulundu.
8. Raman spektral zirvelerinin hücrelerin ayrımcılığa katkısı olduğunu belirleyin (örneğin, her Raman dalga sayısı veya regresyon katsayısının büyüklüğü için projeksiyonda [VIP] değişken öneme sahip puanı çizerek).
   NOTLAR: Bir değişkenin VIP skoru, PLS-DA bileşenleri ile özgün değişken arasındaki kareli korelasyonların ağırlıklı toplamı olarak hesaplanır. PLS ve VIP puanları algoritması ile ilgili ayrıntılar literatürde bulunabilir^11,12.

5. Tek hücreli örnekleme kurulumu ve prosedürleri

1. Hücre örnekleme sistemini Şekil 1'degösterildiği gibi Raman mikroskobuna sabitle. Negatif basınç uygulayarak numune emme için boş bir şırınga bağlı cam kılcal tutucu 3D micromanipulator bağlayın (Şekil 1).
2. Mikroskobu, cam kılcal damarın ucunu gözlemlemek ve kırılmadığından emin olmak için yüksek bir büyütme alanına (40x) ayarlayın. Mikromanipülatör (x-, y-, z-eksenleri) kullanarak cam kılcal damarın konumunu kontrol edin. Kılcal uç görüş alanında ortalanmış olduğundan emin olun, sonra daha sonra kültür çanak için açıklık vermek için z ekseni üzerinde kılcal yukarı taşıyın.
   NOT: Hücrelerin mikro örneklemesi, çapları 10-15 m arasında olan hücreler için cam kılcal damar ile yapılır. ~5 μm delik boyutunda bir kılcal damar önerilir. Delik boyutu çok küçükse, kılcal uç hücre tarafından takılır ve çok büyükse, daha sonraki MS ölçümlerinin hassasiyeti tehlikeye girer.
3. Örnek plakayı/kabı nı mikroskop un sahnesine yerleştirin, büyütme ve odaklamayı ayarlayın, ızgara çanağı üzerindeki hedef hücreyi seçin ve görüş merkezine taşıyın. Daha sonra, ucu odak haline gelene kadar mikromanipülatör (z-ekseni) kullanarak cam kılcal aşağı dikkatle aşağı indirin.
   NOT: Kılcal damar odak noktası olana kadar x ve y eksenlerinde kılcal damarı hareket ettirmemeye dikkat edin.
4. Mikroskobik gözlem altında, kılcal ucu ile hedef tek hücredokunun, sonra kılcal ucu içinde hücre tuzak şırınga kullanarak negatif basınç uygulamaya başlar. Gerekirse hücrenin zamanlamasını ve emilmiş konumunu tam olarak kontrol etmek için bir fotoğraf veya video çekerek bu yordamı kaydedin.
5. Kılcal damarı z ekseninde yukarı doğru hareket ettirin. Daha sonra, MS analizine hazırlık olarak forseps kullanarak kılcal damar tutucudan kılcal damarı ayırın.

6. Kütle spektrometresi ölçümleri

1. MS cihazının kütle doğruluğunu üreticinin tavsiyelerine göre kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, kütle hatasının dakikada 3 ppm'den büyük olmadığından emin olun.
2. MS cihazını ilgi analizi için en uygun parametrelere optimize edin.
   NOT: Tamoksifen ve 4-OHT analizi nde alet parametreleri aşağıdaki lere ayarlanır: giriş kılcal damar sıcaklığı: 400 °C, püskürtme gerilimi: 1500 V, otomatik kazanç kontrol hedefi (AGC): 5.00E+06, S-lens RF seviyesi: %90, SIM aralığı: 347-397 m/z, SIM maksimum enjeksiyon süresi: 200 ms, SIM çözünürlük: 140.000 FWHM, MS/MS aralığı: 50-400 m/z, MS/MS AGC hedefi: 2.00E+05, MS/MS maksimum enjeksiyon süresi: 100 ms, MS/MS çözünürlüğü: 17.500 FWHM, MS/MS izolasyon penceresi: 1 m/z, MS/MS normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE5).
3. Göreceli nicelik elde etmek için SIM modu için 5 dk süreli otomatik bir kazanım yöntemi ve ilacın ve metabolitinin pozitif tanımlanması için başka bir MS/MS yöntemi ayarlayın. Edinme yönteminin parametreleri adım 6.2'de belirtilen en iyi duruma getirilmiş değerlere ayarlanmalıdır.
4. Bir duman başlık altında iyonizasyon çözücü hazırlayın. Çözücü bileşimi ilgi analizine bağlıdır. Burada kullanılan organik çözücü %80 MeOH, %10 DMSO ve %0.1 formik asitten oluşmaktadır.
5. Ölçümlerden önce uygun bir iç standardı organik çözücüile karıştırın. Bu deneyde, 5.31 nM d5-tamoksifen iç standart olarak kullanılır.
6. Yanlış pozitifleri önlemek için, herhangi bir hücresel parça örnekleme önlemek için sürekli mikroskobik gözlem ile 1 μm delik boyutunda kılcal kullanarak ilaç ile tedavi hücreleri çevreleyen medya aspire.
7. Yükleyici uçlarına bağlı bir pipet kullanarak ortam içeren kılcal damarın geniş ucuna 2 μL iyonizasyon çözücüekleyin. Daha sonra, MS tarafından örneklenmiş ortam analiz, ilgi analyt varlığını kontrol edin (normalde, tespit edilmemelidir).
8. Hücreyi içeren kılcal damara 2 μL iyonizasyon çözücüsi ekleyin, kapilleri uygun bir kütle spektrometresine bağlı bir nanoelektrosprey adaptörüne (nano-ESI) sabitlayın ve otomatik satın alma yöntemini başlatın.

7. Kütle spektrometresi veri işleme ve analizi

NOT: Veri analizi yapmak için uygun herhangi bir yazılım kullanılabilir. Ancak, araştırmacılar MS satıcısı tarafından sağlanmayan bir yazılım kullanarak veri analizi yapmak istiyorlarsa, ham veriler özel satıcı biçiminden açık bir biçime veya önce bir metin dosyası olarak dönüştürülmelidir (burada yapıldı).

1. İlgi analyt(ler)'in en yüksek alanını aynı MS tetkisinden iç standardına bölerek verileri normalleştirin. Ardından, çarpıklığı azaltmak için tepe oranlarını dönüştüren günlük defteri.
2. Tek hücreler arasındaki dağılımı görselleştirmek için ilacın veya metabolitinin normalleştirilmiş yoğunluğunu bir kutu çizimi veya yoğunluk eğrisi olarak çizin. Burada, R istatistik yazılımı ggplot2 paketi ile birlikte kullanılır.
3. Metabolize edilen ilacı, her hücredeki metabolize edilmemiş ana molekülün (yani 4-OHT ve tamoksifen) ile bölünerek, ilaç metaboliti nin bolluğunu metabolize edilmemiş ilaç oranına göre hesaplayın.
   NOT: Belirli Raman ilgi zirvelerinin varyasyonları ile ilacın MS zirveleri veya metabolitleri arasındaki ilişki incelenebilir. Bu tek hücrelerde ilacın kendisi ve metaboliti arasındaki olası korelasyon bir ektir. Bu iki kuyruklu test kullanılarak Pearson korelasyon katsayısı hesaplanarak yapılabilir. Daha gelişmiş bütünleştirici yaklaşımlar da göz önünde bulundurulmalıdır.

Sonuçlar

İlaç etkileşimlerinin tek hücreli analizi (alım, metabolizma ve etkileri) herhangi bir gizli veya ilaca dirençli alt popülasyonun ortaya çıkarılmasında ve hücresel heterojenliğin etkilerini anlamada esastır. Bu protokolde, tek hücrelerde yukarıda bahsedilen etkileşimleri ölçmek için iki tamamlayıcı teknik kullanılmıştır: Raman spektroskopisi ve MS. Raman spektrometrisi ilaç yanıtının spektral biyobelirteçlerine dayalı ilaçlardan etkilenen hücreleri hızla tanımlatır. MS seçici ve yarı kantitatif bir şekilde ilacın alımını ve metabolizmasını izlemek için kullanılır. Hücreler önce Raman spektroskopisi ile tarandı, sonra ms tarafından analiz için ayrı ayrı örneklendi.

Her durumun (ilaç tedavisi olan ve olmayan) ortalama spektrumunun karşılaştırmalı analizi Şekil 2'degösterilmiştir. İki koşulun ortalama spektrumu, daha önce tanımlanmış ve moleküler bileşikler^2'yeatanmış çeşitli zirvelerde açıkça farklılık göstermektedir. Özellikle, 1000 cm zirveleri^- (fenilalanin ve tirozin gibi aromatik bileşikler atanan) güçlü farklılıklar göstermektedir. İstatistiksel farkın önemi daha fazla çok değişkenli analizlerle değerlendirilmelidir.

Veri seti daha sonra bir PLS modeli (adımlar 4.5-4.8) iki hücre tedavileri ayırt etmek amacıyla (ilaç ile: n = 290, ilaç olmadan: n = 115) eğitmek için kullanılmıştır. Tamoksifen varlığında kültürlenen hücreleri sınıflandırmak için tahminyeteneği% 100 duyarlılık ve test verilerinde% 72 özgüllük ulaştı (çapraz doğrulanmış eğitimli modelden bilinmeyen). Duyarlılık, model tarafından doğru bir şekilde tanımlanan gerçek pozitiflerin bir ölçüsüdür, özgüllük ise model tarafından tanımlanan gerçek negatiflerin bir ölçüsüdür. Bu çalışmada kapsamlı bir karşılaştırma yapılmamış olsa da, SVM'ler, LdA'lar ve sinir ağları gibi alternatif modeller benzer veya daha iyi sonuçlar sağlayabilir.

PLS modeline göre, deneysel koşulların ayırt inde dalga boylarının (Raman kaymaları) önemini temsil eden VIP puanları hesaplanmıştır(Şekil 3). Daha da önemlisi, VIP profillerinin en yüksek zirveleri raman zirvelerine karşılık gelirken, iki tedavi arasında güçlü farklılıklar görüldü. Bu tedavi ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki özel moleküler farklılıkları doğruladı. Sonuç olarak, araştırmacılar ilaç tedavisine tek hücrelerin yanıtını yansıtan olası spektral biyobelirteçleri belirleyebilirler. Bu biyobelirteçler, biyolojik alaka larını ve çeşitli koşullar ve hücre hatları arasında genellemelerini doğrulamak için daha fazla test edilebilir.

Canlı tek hücreli kütle spektrometresi (LSC-MS) sistemi, daha önce Raman spektroskopisi ile ölçülen tek, ilaç tedavi görmüş HepG2 hücrelerinde hem ilacı hem de metabolitlerini tespit etmeyi başardı. Buna ek olarak, tandem MS her iki molekülün yapısını doğrulamak için kullanılabilir. Pozitif tanımlamadan sonra, ilacın ve metabolitlerinin göreceli bolluğu her hücrede ölçüldü ve tedavi edilmeyen hücrelerdeki arka plan zirvelerine göre karşılaştırıldı. Tamoksifen bolluğunda güçlü bir varyasyon gözlendi ve bu fenomen metaboliti 4-OHT durumunda daha da belirgindi (Şekil 4). Tamoksifen bolluğu ile metabolitleri arasındaki ilişki de incelenmiş ve ikisi arasında anlamlı pozitif korelasyon saptakilmiştir (r = 0.54, p = 0.0001, n = 31).

Şekil 1: Hücre toplama sistemi mikroskop aşamasına monte edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İlaçla tedavi edilen hücrelerin ortalama spektrumu (tamoksifen ile: n = 295) ve işlenmemiş hücreler (tamoksifen olmadan: n = 115). Raman zirveleri literatürden tanımlanabilir. Güçlü spektral farklılıkların çoğu istatistiksel olarak anlamlıdır (ANOVA, p ≤ 0.5) daha önce açıklandığı gibi⁴. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir^4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tahmine dayalı PLS modelinden çıkarılan VIP puanları. VIP puanları, modeldeki iki sınıf arasında ayrım yapmaya katkıda bulunan dalga boylarını yansıtır. Zirvelerin çoğu, ilaç tedavisi gören hücreler üzerindeki ilaç etkilerinin spektral biyobelirteçleri olarak gözlenen spesifik moleküllere karşılık gelmektedir. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir^4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tamoksifen bolluğunun ve metabolitinin dağılımı. Tamoksifen bolluğu ve metaboliti dağılımı, 4-OHT (tek hücre düzeyinde ölçülen) tedavi edilmeyen hücrelerde endojen zirveleri ile karşılaştırıldığında (kontrol). Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir^4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu yazıda, HepG2 hücrelerinin tamoksifene maruz kaldığı (ya da maruz kalmadığı) basit bir olgu seçilmiştir. Raman spektroskopisi ve kütle spektrometresi sisteminin yeteneği tamoksifenin hücreler üzerindeki etkilerini izlemek için gösterilmiştir. Raman spektroskopisi, tek hücrenin uyuşturucuya maruz kalma genel yanıtını yansıtan potansiyel biyobelirteçlerin tanımlanmasına olanak sağladı. Tek hücreler arasında bazı heterojenlik gözlenmiştir, bu da bazı hücrelerin uyuşturucuya maruz kalma larına yanıt vermediğini düşündürmektedir. Öte yandan, LSC-MS tek hücre düzeyinde ilaç ve metaboliti hedefli bir analiz yapma yeteneğine sahip oldu, hangi heterojenite yüksek derecede ilaç ve metabolit bolluğu gözlendi. Bu heterojenlik bazı hücrelerin ilaç tan etkilendiğini açıklamaya yardımcı olurken, diğerleri görünüşte değil, sözde tek tip popülasyondan kaynaklanan hücrelere rağmen¹².

Bu tekniğin dikkat gerektiren belirli yönleri arasında, verilerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için mikroskop kurulumu ve sinyal işleme kalitesinin değerlendirilmesi önemlidir. Spektrumun ön işlemesi dikkatle yapılırsa, sinyal varyasyonları her tepenin yerel maksimum unda en üst düzeye çıkarılmalıdır. Buna karşılık, spektrumun taban çizgisi ve kenarı test edilen hücre koşulları arasında çakışmalıdır. Bir diğer önemli yönü tedaviler arasındaki farklılıkları araştırmak için kullanılan çok değişkenli modeldir. Bir dikkatle modelleri ve model parametreleri hassas ve doğru bir analiz sağlamak için değerlendirmek gerekir. PLS modelinin bir avantajı, sinir ağları aksine, her dalga boyu ile ilişkili ağırlıkları erişim sağlar (Raman vardiya) en iyi modeli tarafından test koşulları ayırt.

Raman spektroskopisi başarıyla ilaç yanıtı ayrımcılık rağmen, bu tekniğin biyolojik yorumu sağlamak için kullanımı sınırlı olduğu vurgulanmalıdır. Bunun başlıca nedeni binlerce molekülün karışımını kapsayan spektral sinyalin karmaşıklığıdır. Bu nedenle, Raman spektral yoğunlukları ve ilaç konsantrasyonları arasındaki sistematik varyasyonları değerlendirmek için daha fazla araştırma gereklidir. Ayrıca, diğer hücre hatları benzer çalışmalar tamoksifen ile ilişkili spektral biyobelirteçlerin genellemesi değerlendirmek için gereklidir.

Ayrıca, farmakodinamik değerlendirmek ve ilaçların her hücre içinde nüfuz ve akışı nasıl çalışma canlı doku ölçümleri yapmak ilgi olabilir. Ayrıca, LSC-MS'deki örnekleme adımının operatörün becerisine son derece bağlı olduğu unutulmamalıdır. Uzamsal çözünürlük, örnekleme den sonra kılcal damar içindeki hücre konumu ve iş gücü gibi parametreler tamamen işleç bağlıdır ve bu da LSC-MS'in büyük ölçekli benimsenmesini sınırlar. Ancak, otomatik örnekleme sistemleri bu sorunu hafifletmek olabilir. Ayrıca, LSC-MS kendi yerel durumlarında yapışık veya yüzen hücreleri örneklemede öne çıkan, doku bölümlerine gömülü örnekleme hücrelerinde daha kötü performans gösterir. Bunun nedeni, numune yoğunluğu yüksekse, numune kılcal ucunun kırılma eğilimidir. Bu nedenle, tek sonda gibi başka bir yaklaşım gibi bu gibi durumlarda daha uygun olabilir^14,15.

Burada kullanılan hücreler en az örneklem hazırlığı ile ortam koşullarında örneklendirilebildiği için, LSC-MS bu protokolde Raman ile entegrasyonu ile gösterildiği gibi, diğer teknolojilerle kolayca entegre edilebilir. 3D holografi ile benzer bir entegrasyon hücre altı düzey¹⁶hücresel metabolitlerin mutlak nicelik elde etmek için izin verdi. Ayrıca, akış sitometri ile entegrasyon nöroblastom kanser hastalarının tek dolaşan tümör hücrelerinde metabolik biyobelirteçlerin ortaya çıkarılması için izin verdi^17,18.

Gelecekte, görüntüleme yöntemleri¹⁹veri kümeleri birleştirerek son artan ilgi nedeniyle, aynı zamanda raman sinyalleri ve kütle spektrometresi sonuçları arasındaki sistematik varyasyonları incelemek için ilgi olabilir (yanı sıra diğer omics yöntemleri) entegre hesaplamalı yaklaşımlar kullanarak. İlginçtir, biz zaten VIP puanları ve tamoksifen veya ms⁴tarafından tanımlanan tek hücreli düzeyde metabolitbolü ile tanımlanan Raman zirvelerinin yoğunlukları arasında birkaç zayıf ama önemli doğrusal korelasyon bulduk . Bu veriler, MS profilleri ile Raman spektrumları arasında metabolik bir ilişki ve bu değerleri tahmin etme olasılığı önerebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.1 penisilin-streptomisin	Nacalai Tesque	09367-34
35mm cam alt ızgara çanak	Matsunami
4-Hidroksi Tamoksifen standardı	Sigma-Aldrich	94873
532 nm diyot pompalı katı hal lazer	Ventus, Lazer Quantum
BIOS-L101T-S motorlu mikroskop aşaması	OptoSigma
CT-2 selülozik kaplı örnekleme kılcal damarları	HUMANIX
d5-Tamoksifen standardı	Cambridge İzotop Laboratuvarları
Dimetil sülfoksit LC-MS sınıfı	Nacalai Tesque	D8418
Dulbecco'nun Modifiye Kartal'ın orta	Sigma-Aldrich	D5796
Eppendorf GELoader ipuçları	Eppendorf
FloroBrite DMEM	Thermo Fisher Bilimsel
Formik asit LC-MS sınıfı	Sigma-Aldrich	33015
HepG2 hücre hattı (RCB1886)	RIKEN hücre bankası merkezi	RCB1886
sığır serumu	Hiklon	SH3006603
MC0-19A1C İnkübatör	Sanyo Electric Co.	MC0-19A1C
Metanol LC-MS sınıfı	Sigma-Aldrich	1060352500
MMO-203 3-D Mikromanipülatör	Narshige	MMO-203
NA:0.95, UPL40 suya daldırmalı Olympus objektif lensi	Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptörü	Thermo Fisher Scientific	ES071
Sahnede inkübatör	ibidi
Pierce LTQ Velos ESI kalibrasyon çözeltisi	Thermo Fisher Scientific	88323
PIXIS BR400 soğutmalı CCD kamera	Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap	Thermo Fisher Scientific
Sıçan kuyruğu kollajen kaplama çözeltisi	Cell Applications Inc.
Tamoksifen standardı	Sigma-Aldrich	85256