Method Article

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

DOI:

10.3791/60484

⸱

November 26th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, üç boyutlu aktif sıvıların akış hızlarını kontrol etmek için sıcaklığı kullanmaktır. Bu yöntemin avantajı sadece yerinde akış hızlarının düzenlenmesine izin vermez, aynı zamanda akış hızlarını yukarı ve aşağı ayarla gibi dinamik kontrol sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kinesin tahrikli, mikrotübül tabanlı üç boyutlu (3D) aktif sıvıların akış hızlarını ayarlamak için sıcaklık kullanmak için bir yöntem salıyoruz. Bu yöntem, farklı istenilen hızlara ulaşmak için yeni numuneler üretmek gerek kalmadan yerinde hızları tuning sağlar. Ayrıca, bu yöntem hızın dinamik kontrolünü sağlar. Sıcaklık bisiklet hızlı ve yavaş, periyodik olarak akış sıvıları yol açar. Bu kontrol edilebilirlik, kinesin-mikrotübül reaksiyonunun Arrhenius karakteristik özelliğine dayanarak 4-8 m/s kontrollü bir ortalama akış hızı aralığını gösterir. Sunulan yöntem, kanaldaki akış hızlarının bir vanaya gerek kalmadan yerel olarak ölçülebilir olduğu mikroakışkan cihazların tasarımına kapı açacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktif madde, kimyasal enerjiyi mekanik işe dönüştürme yeteneği nedeniyle geleneksel pasif maddeden ayrılır. Bu yeteneğe sahip bir malzeme bakteriler, böcekler, kolloidler, tahıllar ve sitosiskelet selamanları1,2,3,4,5,6,7,8,9,10gibi canlı veya cansız varlıklardan oluşabilir. Bu maddi varlıklar komşuları ile etkileşim. Daha büyük bir ölçekte, onlar kendi kendine türbülans gibi girdaplar (aktif türbülans) veya malzeme akar11,12,13,14,15,16,17,18,19,20içine organize . Aktif maddenin kendi kendine örgütlenmeanlayışı moleküler mekiklerde, optik cihazlarda ve paralel hesaplamada çeşitli uygulamalara yol açmıştır21,22,23. Uygulamaları bir sonraki seviyeye taşımak için öz-organizasyon ötesinde denetim gerektirir. Örneğin, Palacci ve ark. sadece elle kontrol edilen mavi ışığa maruz kaldığında kendinden tahrikli bir hematit kapsüllü kolloid geliştirdi, bu da yaşayan kristallerin ortaya çıkmasına yol açtı24. Morin ve ark. bir yarış pisti gibi kanal25kolloidal akın sonuçlanan, bir tasmalı dış elektrik alanı kullanarak haddeleme Quincke kolloidlerin kontrolü kurdu. Bu önceki çalışmalar, uygulamalarda yerel kontrolün rolünü göstermekte ve aktif maddenin bilgi tabanını ilerletiyor.

Bu makalede, kinesin güdümlü, mikrotübül (MT) tabanlı 3D aktif sıvıların kontrol edilebilirliğine odaklanıyoruz. Sıvılar üç ana bileşenden oluşur: MTs, kinesin moleküler motorlar, ve depletantlar. Depletantlar, daha sonra motor kümeleri tarafından köprülenir MTs, bohça için bir tükenme kuvveti neden. Bu motorlar artı sonuna doğru MTs boyunca yürümek. Bir çift köprülü MTsis antiparallel, karşılık gelen motorlar zıt yönlere yürümek. Ancak, motorlar bir kümeye bağlanır ve birbirinden ayrılamaz, bu nedenle birlikte mt çiftlerini (interfilament sürgülü, Şekil 1A)ayırırlar. Bu sürgülü dinamikler birikir, MTsto demetleri kendi bükme istikrarsızlık noktasına ulaşana kadar uzatmak ve kırmak neden (ektensilen demetleri, Şekil 1B)26. Kırık demetler, daha sonra tekrar uzayan tükenme kuvveti tarafından annealed edilir ve dinamikleri tekrar. Yinelenen dinamiğin işlemi sırasında, demet hareketleri mikron ölçekli izleyicilerle doping yaparak görüntülenebilen yakındaki sıvıyı karıştırır(Şekil 1C). Sanchez ve ark. ve Henkin ve ark. adenozin trifosfat (ATP), depletants, motor kümeleri ve MTs19,27konsantrasyonları değiştirerek hızları yetersiz olduğunu bularak, izleyicilerin ortalama hızları karakterize var . Ancak, bu tür bir alabilme sadece aktif sıvı sentezinden önce mevcut. Sentezden sonra, ayarı kaybedildi ve sıvılar kendi yollarında kendi kendine organize edildi. Sentezden sonra aktif sıvı aktivitesini kontrol etmek için, Ross.et al. motor proteinlerin ışık-aktive dimerization kullanarak bir yöntem bildirdi, sıvı aktivitesi ışık kullanılarak ayarlanması ve kapalı izin28. Işık kontrolü sıvıların yerel olarak aktive olması açısından kullanışlı olsa da, yöntem motor proteinlerinin yapılarının yeniden tasarlanması ve optik yolların mikroskopiçinde değiştirilmesini gerektirir. Burada, motor yapısını sağlam tutarken mikroskop modifikasyonu olmadan sıvı akışlarını yerel olarak kontrol etmek için kullanımı kolay bir yöntem salıyoruz.

Kinesin-MT reaksiyonu sıcaklık29,30,31,32ile arttığı bildirilmiştir çünkü lokal olarak tuning aktif sıvı akışı yöntemimiz Arrhenius yasasına dayanmaktadır. Önceki çalışmalarımız, aktif bir sıvı akışının ortalama hızının sıcaklık bağımlılığının Arrhenius denklemini takip ettiğini gösterdi: v = A exp(-Ea/RT), A'nın üstel bir faktör olduğu, R gaz sabiti, Ea aktivasyon enerjisi ve T sistem sıcaklığı33' tür. Bu nedenle, sıvı aktivitesi sıcaklık ortamına duyarlıdır ve sistem sıcaklığının motor performansını dengelemek için tutarlı olması gerekir ve sonuç olarak, akışkan akış hızı34. Bu makalede, sistem sıcaklığını ayarlayarak aktif sıvıların akış hızlarını sürekli olarak ayarlamak için motorun sıcaklık bağımlılığının kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca aktif bir sıvı numunesinin hazırlanmasını ve ardından numunenin bilgisayar yazılımı ile kontrol edilen bir mikroskop aşamasına monte edilerek kanıtlıyoruz. Sıcaklığın 16 °C'den 36 °C'ye yükseltilen hızları 4'ten 8 μm/s'ye çıkar. Ayrıca, ayarlanabilirlik geri döndürülebilir: sıcaklığın art arda artması ve azalması akışı hızlandırır ve yavaşlar. Gösterilen yöntem, ana reaksiyonların Arrhenius yasalarına uyduğunun geniş bir yelpazede uygulanabilir, örneğin MT süzülen tetkik29,30,31,32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MTs hazırlanması

DİkKAT: Bu adımda büyükbaş beyin dokusundan tubulinleri arındırıyoruz. Sığır beyin varyant Creutzfeldt-Jakob hastalığı neden olabilir (vCJD)35. Bu nedenle, beyin atıkları ve ilgili çözümler, şişeler ve pipet uçları bir biyoatık torbasında toplanmalı ve kurum kurallarına göre biyolojik atık olarak bertaraf edilmelidir.

  1. Büyükbaş beyinden tubulinleri arındırın (Castoldi ve ark.36'dandeğiştirilmiştir).
    1. Yerel bir mezbahadan üniversite nin soğuk odasına yaklaşık 1,5 kg taze sığır beyni taşıyın. Taşıma sırasında beyni fosfat tamponunda (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2) buz üzerinde saklayın.
      NOT: Tubulin nihai verimi maksimize etmek için, taze beyin dokusunda fonksiyonel tubulin ilk miktarı anahtarıdır. Taze beyinler daha işlevsel tübulin içerir. Mezbahadan en taze beyinleri elde etmek için kasaptan en son kesilen beyinlerini sağlamasını istemenizi öneririz. Beyinler prosedürü başlatırken 3 saatten daha eski olmamalıdır, çünkü kesim ve işlem başlangıcı arasındaki süreyi azaltmak daha iyi verim üretecektir.
    2. Beyinleri homojenize edin ve netleştirin.
      1. Daha küçük parçalar halinde kan damarları ve bağ dokusu kesmek ve elle beyinden kaldırmak için neşter kullanarak beyin temizleyin.
        NOT: Temizlenmiş beyinler pembe olmalıdır.
      2. Temizlenmiş beyin dokusunu beynin kilogramı başına 1 L depolimerizasyon tamponuna (DB: 50 mM 2-(N-morfolino) etanesülfonik asit, 1 mM CaCl2, pH 6.6) daldırın.
      3. Bir mutfak blender ile beyin homojenize.
      4. Homojenize beyin çözeltisini 10.000 x g ve 4 °C'de 150 dk santrifüj edin.
    3. Polimerize MTs (ilk polimerizasyon).
      1. 37 °C'de aşağıdaki çözeltilerin eşit hacimlerde süpernatantını toplayın ve karıştırın: gliserol, yüksek muvazaalı BORULAR tampon (HMPB: 1 M BORULAR, 10 mM MgCl2, 20 mM etilen glikol-bis(β-aminoehyl eter)-N,N,N',N'-tetraasetik asit [EGTA], pH 6.9)
      2. Karışıma 1,5 mM ATP ve 0,5 mM guanozin trifosfat (GTP) ekleyin.
      3. Karışımı 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    4. MT'leri depolimerize edin (ilk MT depolimerizasyonu).
      1. Pelet MT 151.000 x g ve 37 °C 30 dk santrifüj tarafından.
      2. Supernatant atın ve 4 ° C DB 10 mL her MT pelet resuspend.
      3. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
      4. MT sedimantasyon önlemek için bir pipet ucu ile karışımı her 5 dakikada bir çalkalayın.
        NOT: Karışım MT depolimerizasyonunun tamamlaşdığını gösteren 30 dk içinde netlenmelidir.
    5. Polimerize MTs (ikinci MT polimerizasyon).
      1. 70.000 x g ve 4 °C'de 30 dk santrifüj ederek çözeltiyi netleştirin.
      2. 37 °C gliserol ve HMPB eşit hacimlerde supernatant toplamak ve karıştırın.
      3. Karışıma 1,5 mM ATP ve 0,5 mM GTP ekleyin.
      4. Karışımı 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
    6. HMPB'yi Brinkley yeniden montaj tamponu (BRB) ile değiştirerek 1.1.4 tekrarlayın, ardından30 dk için 79.000 x g ve 4 °C'de santrifüj ile temizlenen karışımı netleştirin.
    7. Supernatant toplamak. Bir spektrometre ile 280 nm emiciliği ölçün. Bira-Lambert yasasını kullanarak tubulin konsantrasyonunun belirlenmesi (tübülin in tükenme katsayısı: 1,15 (mg/mL)-1cm-1)37,38.
    8. Proteini -80 °C'de saklayın.
  2. Geri dönüşüm tubulins (Castoldi ve ark.36değiştirilmiş).
    NOT: Tubulin saflığını artırmak için saflaştırılmış tubulin polimerize edilir ve tekrar depolimerize edilir.
    1. Saflaştırılmış tubulin (adım 1.1.7) 500 μM dithiothreitol (DTT) ve 20 μM GTP ile karıştırarak MT'leri polimerize edin ve ardından 37 °C'de 30 dk kuluçka yada.
    2. MT'leri pelet.
      1. Yük 1 mL gliserol yastığı (80 mM BORULAR, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v / v gliserol, pH 6.8) bir santrifüj tüp altında.
      2. Polimerize MT'leri yastığın üzerine töyorum.
      3. 37 °C'de 90 dk için 172.000 x g santrifüj.
    3. MT'leri depolimerize edin.
      1. Supernatant ve yastık çıkarın.
      2. Her MT peletini 150 μL 4 °C MT tampon (M2B: 80 mM BORULAR, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8) olarak yeniden askıya alın.
      3. Karışımı 30 dk buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
      4. Her 5 dakikada bir pipet ucu ile karışımı karıştırın. Karışım berrak olmalı.
    4. Karışımı 172.000 x g ve 4 °C'de 30 dk santrifüj ederek netleştirin.
    5. Supernatant toplamak. Protein konsantrasyonu ölçün. -80 °C'de saklayın.
  3. Floresan boya ile etiket tubulin39.
    1. MT'leri polimerize edin. Saflaştırılmış tubulin (adım 1.1.7) ile 500 μM DTT ve 16.7 μM GTP karışımı karıştırın ve karışımı 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    2. MT'leri pelet.
      1. 37 °C yüksek pH yastığının 1 mL'sini (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, %60 v/v gliserol, pH 8,6) bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
      2. Polimerize MT'leri minderin üzerine serin.
      3. 37 °C'de 50 dk için 327.000 x g santrifüj.
    3. Etiket tubulin.
      1. 37 °C etiket tamponu (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, %40 v/v gliserol, pH 8,6) ile her MT peleti yeniden askıya alın.
      2. Süspansiyonu 10-20 azı lı fazla lık uzak kırmızı floresan boya ile karıştırın.
      3. 37 °C'de 30 dakika karanlıkta karışımı kuluçkaya yatırArak MT'lerin floresan boyanın esteriyle reaksiyona girmesine izin verin.
      4. 50 mM K-glutamat ile askıya boyanın esterini doytarak etiketleme reaksiyonunu durdurun, 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Pelet etiketli MTs: Tekrar adım 1.3.2, düşük pH minderi ile yüksek pH yastık yerine (80 mM borular, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v / v gliserol, pH 6.8).
    5. MT'leri depolimerize edin.
      1. Supernatant ve yastık atın.
      2. 4 °C M2B'nin 700 μL'lik peletini yeniden askıya alın.
      3. Süspansiyonu buzda kuluçkaya yatırın.
      4. Çözelti netolana kadar her 5 dakikada bir pipet ucu yla çalkalayın.
    6. 184.000 x g ve 4 °C'de 35 dakika santrifüj ederek temizlenmiş çözeltiyi netleştirin.
    7. Etiketli tubulin çözeltisinin saflığını 1.2.1-1.2.4 adımlarını tekrarlayarak artırın.
    8. Protein ve floresan boya konsantrasyonu ölçün. Floresan boya konsantrasyonlarının tubulin'e oranı olarak tanımlanan tubulin konsantrasyonu ve etiketli tübulin kesirlerini belirlemek için bu ölçümleri kullanın.
    9. Etiketli tubulin çözeltisini -80 °C'de saklayın.
  4. MTs polimerize (Sanchez ve ark19kabul):
    1. Geri dönüştürülmüş tubulin (adım 1.2.5) etiketli tubulin (adım 1.3.9) ile % 3 etiketli tubulin fraksiyonu veren bir oranda karıştırın.
    2. 8 mg/mL tubulin karışımını 1 mM DTT ve 0.6 mM guanozin-5'[[(α,β)-metileno]trifosfat (GMPCPP) ile karıştırın ve ardından 37 °C'de 30 dk kuluçka yapın.
    3. Kuluçkadan sonra, 6 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında MTs anneal.
    4. Aliquot ve -80 °C'de saklayın.

2. Sentez kinesin kümeleri

NOT: Bakteriler her yerde bulunur ve medyada büyüyebilir ve hazırlık sürecini kontamine edebilirler. Kontaminasyonu önlemek için, hücre kültürleri ile temas içeren eylemler (örneğin, pipetleme) bir alev yakınında yapılmalıdır. Şişeler, pipetler, pipet uçları, ortam ve plakalar gibi araçlar kullanılmadan önce otomatik olarak yapılmalıdır.

  1. Escherichia coli40ekspres kinesin motorlar .
    1. Hücreleri dönüştürün.
      1. K401-BCCP-H6 plazmidinin pipet 1 μL'si 10 μL'lik yetkin hücrelere dönüşür.
      2. 5 dakika buz üzerinde kuluçka.
      3. 45 s için 42.5 °C'de ısı şoku.
      4. Kurtarma sağlamak için 2 dakika buz üzerindeki hücreleri kuluçkaya yatırın.
      5. Hücreleri 300 μL antibiyotiksiz 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L maya ekstresi, 16 g/L tripton) ile karıştırın.
      6. Hücreleri 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
        NOT: Belirtilmediği sürece kuluçka sırasında hücre büyümesinin izlenmesi gerekmez.
    2. Plaka ortamını aşılama.
      1. Hücre kültürünü 2XYT plaka (10 g/L NaCl, 5 g/L maya ekstresi, 10 g/L tripton, 15 g/L agar, 100 μg/mL ampisilin, 25 g/mL kloramhenikol) üzerine yayın.
      2. Bir gecede plakayı baş aşağı 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. Sıvı ortam aşılama.
      1. Gece plakaitibaren, bir pipet ucu ile izole koloni hasat.
      2. Ucu 50 mL 2XYT içeren bir şişeye at.
      3. 12-16 saat boyunca 37 °C ve 200 rpm'de kuluçka ve kültür ortamını salla.
    4. Hücreleri genişletin.
      1. 2XYT'nin 500 mL'sinde hücre kültürünün 2,5 mL'sini karıştırın.
      2. 37 °C'de 500 mL kültürünü ve 250 rpm'yi 3-6 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve sallayın.
    5. Protein ekspresyonunu indükler.
      1. Kuluçka sırasında, referans olarak 2XYT kullanarak, 600 nm'de absorbansı ölçerek hücre büyümesini izleyin. OD600 = 0,3'e ulaşana kadar emiciliği her 60 dakikada bir ölçün. Sonra 0.5-0.6 ulaşana kadar her 30 dakikada bir absorbansı ölçün.
      2. Absorbans OD600 = 0.5-0.6 ulaşana kadar hücrelerin büyümesine izin verin
      3. Hücre kültürüne 24 μg/mL biotin ve 1 mM izopropil β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) ekleyin.
        NOT: IPTG, biyotin karboksil taşıyıcı protein (BCCP) ve altı histidin (H6) ile etiketlenen kinesin motorlarının protein ekspresyonunu indüklemek için kullanılır. H6 etiketi arıtma işleminde (adım 2.2) kullanılırken, BCCP ifade edilen kinesin motorlarını biyotinyilebağlamak için eklenen biyotin moleküllerine bağlanır.
      4. 12-20 saat boyunca 20 °C ve 250 rpm'de hücre kültürünü kuluçkaya yatırın ve sallayın.
    6. Hücreleri 5.000 x g ve 4 °C'de 10 dk. Hücre peletlerini -80 °C'de saklayın.
  2. Kinesin motor proteinini arındırmak (Spriestersbach ve ark.41'denmodifiye):
    1. Eşit hacimli hücre peletini (adım 2.1.6) eşit miktarda (50 mM BORULAR) askıya alın, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 10 mM 2-mercaptoetanol (βME), 20 mM imidazol, pH 7.2), proteaz inhibitörü bir tablet ekleyerek takip, feniltil sülfonil florür 2 mg (PMSF), ve 2 mg lysozyme.
    2. Hücreleri sıvı nitrojen (LN) 3x'te flaş dondurarak ve hücre karışımını eriterek inceltin.
      NOT: Lysing sonra, karışım viskoz hale gelmelidir.
    3. 230.000 x g ve 4 °C'de 30 dk santrifüj ederek lysed hücre karışımını netleştirin.
    4. Supernatant toplamak ve bir yerçekimi sütunu ile akış, lysis tampon 10 mL ile sütun yıkama takip.
      NOT: Kinesin K401-BCCP-H6 gibi H6 etiketi ne olan proteinler sütunda kalmalıdır.
    5. Etiketli proteini 5 mL elüsyon tamponu (50 mM BORULAR, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 500 mM imidazol, pH 7.2) ile elüat. Akışı 1 mL kesirlerde sırayla toplayın. Protein içeren fraksiyonları belirlemek için, her fraksiyonun 3 μL'sini 100 μL triphenylmethane boya ile karıştırın. Protein içeren kesirler maviye dönmelidir. Bu kesirleri birleştirin ve 5x ile lysis tampon ile seyreltin.
    6. Protein çözeltisini yoğunlaştırın.
      1. Çözeltiyi bir santrifüj filtre tüpüne yükleyin.
      2. 4 °C'de 10 dk için 3.000 x g santrifüj.
      3. Çözelti hacmi <3 mL olana kadar tüpü hafifçe sallayın ve tekrar santrifüj edin.
    7. Protein konsantrasyonu bir spektrometre (yok olma katsayısı: 0,549 (mg/mL)-1cm-1)42,43ile ölçün. % 35 w / v sakaroz eklerken 1 mg / mL protein seyreltin.
    8. -80 °C'de saklayın.
  3. Bir elektroforez jeli ile kinesin konsantrasyonlarını ölçün (Taylor ve ark.44modifiye).
    NOT: Bir elektroforez jeli ile kinesin konsantrasyonunu ölçmek için, tubulin bir spektrometre ile yüksek saflık ve ölçülebilir konsantrasyonu nedeniyle ideal bir konsantrasyon merdivenidir (Şekil 2A)36.
    1. 0.25, 0.5, 0.75, 1.00 ve 1.25 mg/mL konsantrasyonları ile tübulin örnekleri hazırlayın. Her tubulin numunesinin ve kinesin numunesinin 15 μL'sini (adım 2.2.8) ayrı ayrı 5 μL numune tamponu (200 mM Tris-HCl, %8 sodyum dodecyl sülfat (SDS), 400 mM DTT, %0.2 bromofenol mavisi, %40 gliserol, pH 6.8) ve tüplü tüplü 90 °Cin 3 min için ayrı ayrı karıştırın.
    2. Elektroforezi hazırlayın.
      1. Bir elektroforez jelini jel kutusuna kilitleyin.
      2. Kutuyu çalışan tamponla doldurun (50 mM MOPS, 50 mM Tris baz, %0.1 SDS, 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), pH 7.7).
        NOT: Arabellek seviyesinin jelin üst açma alanının üzerinde olduğundan emin olun.
    3. 10 μL protein standart merdiven, tubulin örnekleri ve kinesin örneğini ayrı kuyulara yükleyin ve jel boyunca 45 dakika boyunca 200 V uygulayın.
    4. Jel boyama.
      1. Kaynamış (yaklaşık 95 °C) leke çözeltisi A (%0.5 g/L trihenylmethane boya, %10 v/v asetik asit, %25 izopropanol) 5 dakika boyunca inkütün ve kaya, sonra jeli deiyonize (DI) suyla durulayın.
      2. Leke çözeltileri B (0.05 g/L trihenylmethane boya, %10 v/v asetik asit, %10 izopropanol), C (0.02 g/L trihenylmethane boya, %10 v/v asetik asit) ve D (%10 v/v asetik asit) ile sırayla tekrarlayın. Incubate ve DI suda bir gecede jel kaya.
    5. Jeli taz.'yı taz.'la. Jel görüntüsünü gri tonlama görüntüsüne dönüştürün, ardından siyah arka plandaki parlak protein bantlarını ortaya çıkarmak için siyah beyaz ters çevirme ve kontrast geliştirmesi.
    6. Piksel değerlerini özetleyerek her bandın parlaklığını ölçün. Doğrusal uyum C = aB + buygulayın, B bir tubulin bandının parlaklığı, C karşılık gelen konsantrasyon ve a ve b uygun parametrelerdir. Doğrusal denklemi hesaplamak için kinesin ck'nın parlaklığını kullanarak kinesin Ck konsantrasyonunun belirlenmesi: Ck = aBk + b.
  4. Kinesin motorlarını kümele.
    1. 120 μM DTT ve 120 nM streptavidin ile 1,5 μM kinesin (adım 2.2.8) karıştırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
    2. -80 °C'de saklayın.

3. Polyakrilamid kaplı cam slaytlar ve kapaklar hazırlamak (Lau ve ark.45modifiye )

  1. İlgili kaplara yeni cam kaydıraklar ve cam kapaklar yükleyin. Slaytları ve kapakları %1 v/v deterjana batırın ve suyu mikrodalgafırında kaynatın.
  2. 5 dakika boyunca slaytlar ve kapakları sonicate ve daha sonra deterjan kaldırmak için DI su ile durulayın.
  3. 5 dakika. DI su ile durulayın için etanol slaytlar ve kapakları batırın ve sonicate.
  4. 100 mM potasyum hidroksit (KOH) içinde 5 dakika boyunca slaytları ve kapakları di su ile durulayın ve sonicate.
  5. Slaytları ve kapakları bir silançözeltide (%1 asetik asit ve %0,5 3-(trimethoxysilyl)etanollü propil metakrilat) 15 dakika boyunca inkübedin ve ardından DI suyuyla durulayın.
  6. Akrilamid çözeltisi içinde slaytlar ve kapaklar kuluçka (2% w / w akrilamid, 0.7 mg / mL amonyum persülfat, ve 0.0035% v / v tetrametiletilenediamin DI suda) için ≥3 saat.
  7. Slaytları ve kapakları akrilamid çözeltisinde saklayın.

4. Kinesin güdümlü, MT bazlı aktif sıvılar hazırlayın

  1. Aktif sıvılar hazırlayın (Sanchez ve ark.19'danmodifiye edilmiştir).
    NOT: Aşağıdaki adımlar, örnek stoklar kullanarak aktif bir sıvının 100 μL'lik hazırlama işlemini göstermektedir. Son hacim ölçeklenebilir ve her bileşenin son konsantrasyonu korununce örnek stokların konsantrasyonları ayarlanabilir.
    1. 16.7 μL 8 mg/mL MTs (adım 1.4.4) ile 6.7 μL 1.8 μM kinesin motor kümelerini (adım 2.4.2) ve 1.1 μL 500 mM DTT yüksek tuzlu M2B (M2B + 3.9 mM MgCl2)ile karıştırın.
    2. %7 w/w polietilen glikol (PEG) 11,4 μL ekleyerek MT'leri paketleyin.
    3. 2,8 μL 50 mM ATP ekleyerek kinesin motorlarını etkinleştirin.
    4. 2.8 μL stok pirüuvat kinaz/laktat dehidrogenaz (PK/LDH) ve 13.3 μL 200 mM fosfenol piruvat (PEP) ekleyerek ATP konsantrasyonlarını koruyun.
    5. 10 μL 20 mM Trolox, 1.1 μL 3.5 mg/mL katalaz, 1.1 μL 20 mg/mL glukoz oksidaz ve 1.1 μL 300 mg/mL glukoz ekleyerek fotobeyazrlama etkisini azaltın.
    6. 1,6 μL %0,025 v/v tracer parçacıkları ekleyerek sıvının hareketini izleyin.
    7. Toplam 100 μL hacim elde etmek için yüksek tuzLu M2B ekleyin.
      NOT: 4.1.1-4.1.6 adımlarında karıştırma emirleri değiştirilebilir. Ancak, atp, MTs ve motorlar karıştırılır kez, motorlar MTs boyunca adım atp tüketmeye başlar. Numune sınırlı yakıtlar (ATP ve PEP) nedeniyle sınırlı bir ömür ile aktive edilir, bu nedenle deneme derhal başlatılmalıdır. Son aktif sıvı 1.3 mg/mL MT, 120 nM kinesin motor kümeleri, 5,5 mM DTT, %0.8 w/w PEG, 1.4 mM ATP, %2.8 v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0.038 mg/mL katalaz, 0.22 mg/mL glukoz oksidaz, 3.3 mg/mL glukoz ve yüksek tuzlu M2B'de %0.0004 v/v kolkoioid.
  2. Bir akış kanalında örnek hazırlayın (Chandrakar ve ark.46'dandeğiştirilmiştir):
    1. Bir poliakrilamid kaplı cam slayt ve coverslip (adım 3.7) DI su ile durulayın. Basınçlı hava ile gözlük kuru. Temiz, düz bir yüzeye yerleştirin.
    2. 3 mm genişlikte ve cam kapak lı (20 mm) ile aynı uzunlukta iki balmumu film şeridi kesin. Kanal boşlukları olarak slayt ve coverslip arasında şeritler ekleyin.
    3. Cam-balmumu kompleksini 80 °C'lik bir sıcak tabağa yerleştirerek camı balmumu filmine yapıştırın. Erime sırasında, balmumu filmini cam yüzeylere düzgün bir şekilde yapıştırmak için bir pipet ucuyla kapağı hafifçe bastırın. Yapışmadan sonra cam kompleksini oda sıcaklığına kadar soğutun.
    4. Aktif sıvıları (adım 4.1) akış kanalına yükleyin. Kanalı UV tutkalla kapatın.

5. Kontrol numune sıcaklığı

  1. Bir sıcaklık kontrol kurulumu oluşturun (Lowensohn ve ark. ve Wu ve ark.47,48,49tasarımları modifiye).
    1. Alüminyum soğutma bloğu hazırlayın.
      1. Yaklaşık 30 mm × 30 mm × 5 mm boyutlarında bir alüminyum plaka değirmen.
      2. Plaka(Şekil 3A)üzerinden bir iç kanal delin ve kanal uçlarına hortum bağlantı parçaları tökerim.
      3. Her bir tesisi bir su tüpüne bağlayın.
      4. Bir tüpü su deposundaki bir akvaryum pompasına bağlarken diğer tüpü de rezervuara uzatın.
        NOT: Pompa yaklaşık oda sıcaklığında blok sıcaklığını korumak için alüminyum iç kanallar aracılığıyla rezervuar suyu sirküle edecek.
    2. Bir termoelektrik soğutucu (TEC) ve bir termosensör ile sıcaklık kontrol cihazını bağlayın. Denetleyiciyi USB bağlantı noktası kullanarak bilgisayara bağlayın (Şekil 3B).
    3. Sıcaklık kontrol cihazını doğru akım (DC) güç kaynağına bağlayın. Güç kaynağını elektrik prizine takarak kumandayı açın.
    4. Denetleyici üreticisinin kılavuzunu izleyerek TEC'in ilk kurulumını gerçekleştirin. TEC çıktısını test edin. Sıcaklık denetleyicisinin üretici tarafından sağlanan yazılım la kontrol edilmesi, termosensör veri kaydının ve sıcaklık denetleyicisinin daha kolay manipülasyonuna olanak sağlanması önerilir.
    5. TEC'in ısıtma ve soğutma kenarlarını belirleyin.
    6. Tec'in soğutma tarafını termal macun kullanarak soğutma bloğuna (adım 5.1.1) takın.
    7. Termal macun kullanarak TEC'in ısıtma tarafına bir safir disk takın.
    8. Kurulum tamamlandı. Safir yüzey ve termosensör, numuneyi sıcaklığına ve hedef sıcaklığına göre soğutmak ve ısıtmak için numuneyle bağlantı kurabilir.
      NOT: TEC ve soğutma bloğunun parlak alan mikroskobu kullanılarak örneklerin görüntülenmesi için hizalanmış bir merkezi deliğe sahip olması önerilir(Şekil 3C).
  2. Numune sıcaklığını kontrol etmek için sıcaklık kontrol kurulumuna göre33'ün kullanın.
    1. Örneği kuruluma monte edin.
      1. Aktif sıvı örneğini (adım 4.2.4) safir yüzeye yerleştirin ve slayt tarafı yüzeye temas eder.
      2. Cam kaydırağı kağıt bantla sabitleyin.
      3. Termosensörü bakır bant kullanarak kapak yüzeyine takın.
    2. Kurulumu, hedeflere bakan kapaklı tarafı yla mikroskop aşamasına monte edin. Örneğin, ters bir mikroskopta, kapaklı taraf aşağı dönük olmalıdır. Varsa kağıt bant ve mikroskop aşaması iğne kelepçeleri ile kurulumu sabitleyin.
      NOT: Sunulan sıcaklık aşaması ters veya dik ortak mikroskoplar ile çalışmalıdır. Deney sırasında sıcaklık aşamasının taşınmadığından emin olmak için, sıcaklık aşamasını bantla mikroskop aşamasına sabitlemek en iyisidir.
    3. Numune sıcaklığını kontrol edin.
      1. Sıcaklık kontrol cihazını ve akvaryum pompasını açın.
      2. Hedef sıcaklığı ayarlamak ve sıcaklık kontrolünü etkinleştirmek için üreticinin kılavuzunu izleyin. Denetleyici, Termosensör tarafından değerlendirildiği gibi, Hedef sıcaklık ve numune sıcaklığına göre ısıtma veya soğutma gücünü ayarlar.
    4. Örnek sıcaklıkları kaydedin.
      1. Deneme sırasında termosensör sıcaklık verilerini kaydetmek için üreticinin kılavuzunu izleyin.
        NOT: Örnek sıcaklığı artık denetleyici tarafından kontrol edilmeli ve bilgisayar tarafından kaydedilmelidir (Şekil 3D).

6. Aktif sıvı aktivitesini karakterize edin (Henkin ve ark. ve Wu ve ark.20,27tarafından metotlardan modifiye edilmiştir)

NOT: Önceki bölümler aktif sıvı örnekleri (bölüm 1-4) hazırlamak ve sıcaklıklarını kontrol etmek için kullanılır (bölüm 5). Aktif sıvı aktivitesini kontrol etmek için sıcaklık kullanımını göstermek için, sıvı davranışlarını gözlemlemek, faaliyetlerini analiz etmek ve ısıya tepkilerini karakterize etmek.

  1. İzleyicileri izleyin.
    1. İzleyici parçacıkların hareketini yakalamak için yeşil floresan protein (GFP) floresansını kullanarak δt sabit bir aralıkla numuneyi görüntüleyin.
      NOT: İzleyici hareketinin izlenmesi için Δt seçilmelidir. 100 s gibi büyük Δt değerleri, izleme yörüngelerini kaybetmeye neden, 0,1 s gibi kısa Δt değerleri ise izleme algoritmasının çerçeveler arasındaki izleme hareketini algılamasını engeller. Çalışan Δt, çerçeveler arasındaki izleyici deplasmanına ~9 piksel içinde izin vermelidir. 4x hedefi kullanarak 10 μm/s'de hareket eden görüntüleme izleyicileri için Δt'nin 1-5 s olması önerilir.
    2. Resimleri TIFF dosyaları olarak kaydedin, dosyaları çerçeve numarasına göre adlandırın ve ayrı bir klasörde saklayın. Bu işlemler, edinilen görüntülerin sağlanan MATLAB komut dosyasıyla doğru şekilde analiz edilmesini sağlamak için gereklidir (adım 6.2.2).
  2. Ouellette ve ark.50,51tarafından geliştirilen izleme yazılımını benimseyen izleme cileri izleyin:
    1. İzleme yazılımını Stanford Üniversitesi Çevre Karmaşıklığı Laboratuvarı'ndan (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml) indirin. Her MATLAB dosyasının aynı klasörde olduğundan emin olun.
    2. Özel bir MATLAB komut dosyası kullanarak izleme leri izleme: particle_tracking.m. Komut dosyası tracer görüntüleri okur (adım 6.1) ve Ouellette ve ark50,51yazılımı kullanarak tracer hareketi izler. Bu iki dosya çıkar: 1) background.tif, görüntü arka planı temsil eden ve 2) Tracking.mat, her karede parçacık yörüngeleri ve hızları içeren(Şekil 4A).
  3. Özel bir MATLAB komut dosyası kullanarak izleyici ortalama hızlarını analiz edin: analysis.m. Komut dosyası izleme dosyasını okur (Tracking.mat) ve izleme ve zaman adedinin ortalama hızını, belirtilen ortalama pencerelerle birlikte ortalama hızı ile birlikte çıkar (Şekil 4B)33.
  4. Zaman ortalaması ortalama hızı kaydedin.
  5. Deneyi (4, 5,2 ve 6,1-6,4 adım) 10-40 °C'de tekrarlayarak ortalama süreyi ölçün. Ortalama hızı ve sıcaklığı nı çizmek için kaydedilen ortalama hızları kullanın (Şekil 4C)33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinesin güdümlü, MT bazlı aktif sıvıların hazırlanması hem kinesin hem de MT gerektirir. MT'ler sığır beyinlerinden saflaştırılan etiketli tubulinlerden (basamak 1.3 ve 1.4) polimerize edildi (basamak 1.1, Şekil 2A),saflığı artırmak için geri dönüşüm takip edildi (adım 1.2, Şekil 2B). Kinesin motor proteinleri E. coli (basamak 2.1 ve 2.2, Şekil 2B)41...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yerinde aktifmadde kontrol aktif madde4,5,24,28,54yönlendirilmiş öz-organizasyon için kapıyı açar. Bu makalede,sisteminArrhenius karakteristik dayalı, yerinde kinesin tahrikli, MT tabanlı aktif sıvıları kontrol etmek için sıcaklık kullanmak için bir protokol sokulmak,30,31<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmid K401-BCCP-H6 Dr Zvonimir Dogic bir hediye oldu. Bu araştırma Dr Kun-Ta Wu'nun Worcester Politeknik Enstitüsü'ndeki başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir. Dr. Zvonimir Dogic'e tubulin'i arındırmak ve etiketlemek ve aktif sıvısentezlemek için protokoller için teşekkür ederiz. Dr. Marc Ridilla'ya protein ekspresyonu ve arınma konusundaki uzmanlığı ndan dolayı minnettarız. Dr. William Benjamin Roger'a sıcaklık kontrollü sahneyi inşa etmemizde bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biyolojik Malzeme Tesisi'nin (BMF) kullanımı için Brandeis MRSEC'i (NSF-MRSEC-1420382) kabul ediyoruz. Biz Soft Matter33üzerinde Bate ve ark rakamları adapte için Royal Society of Chemistry kabul ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asitSigma-Aldrich238813Trolox
2-MerkaptoetanolSigma-AldrichM6250
3- (Trimetoksisilil) propil metakrilat, %98, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2mm ID Tygon Boru R-3603HACH2074038Su tüpleri
31,75 mm çapında kaplamasız, safir pencereEdmund Optics43-637Safir disk
3M 1181 Bakır Bant - 1/2 IN Genişlik x 18 YD Uzunluk - 2.6 MIL Toplam Kalınlık - 27551R.S. HUGHES054007-27551Bakır bant
Asetik AsitSigma-AldrichA6283
Akrilamid Çözeltisi (%40/Elektroforez), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adenozin 5'-trifosfat dipotasyum tuzu hidratSigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)Thermo Fisher ScientificA20006Uzak kırmızı floresan boya. Alexa 647, mikrotübüllerle (1.3.3.2.) karıştırılmadan önce dimetilsülfoksit (DMSO) içinde önceden süspanse edilebilir.
Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre ÜnitesiSigma-AldrichUFC801024Santrifüj filtre tüpü. Kesme molekül ağırlığı: 10 kDa
Amonyum Persülfat, 100g, MP BiyomedikalFisher ScientificICN802829APS
Ampisilin Sodyum Tuzu (Kristal Toz), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760Ampisilin Titreşim
Önleyici TabloNikon63-7590S
Avanti JE SantrifüjBeckman Coulter369001
Bacto Agar Satış Maddesi, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
Kova-plastik beyaz - 2 galonBon84-715Su kovası
Kalsiyum KlorürSigma-Aldrich746495CaCl2
sığır karaciğerinden katalazSigma-AldrichC40
CFI Planı Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x hava objektifi
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero KaydırmaNikon96372GFP filtre küpü
CH-109-1.4-1.5TE TeknolojisiCH-109-1.4-1.5Termoelektrik Soğutucu (TEC)
Kloramfenikol, %98, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Soğutma bloğuN/AN/AÖzel öğütülmüş alüminyum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Trifenilmetan boya
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG7528
Dimetil Sülfoksit (Sertifikalı ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, %99, biyokimya için, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 Isı Emici BileşikDow1446622Termal macun
ETİL ALKOL, 200 PROOF ACS/USP/NF SINIF 5 GAON POLİ KÜPPharmco by Greenfield Global111000200CB05Etanol
Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N', N'-tetraasetik asitSigma-AldrichE3889EGTA
Etilendiamintetraasetik asitSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReaktifler Mikrobiyoloji Medya Katkı Maddeleri: TriptonFisher ScientificBP1421Tripton
Fisher BioReaktifler Mikrobiyoloji Medya Katkı Maddeleri: Maya ÖzüFisher ScientificBP1422Maya özü
Floresbrite YG Mikroküreler, Kalibrasyon Sınıfı 3.00 ve mikro; mPolysciences18861
Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GliserolSigma-AldrichG5516
GpCppJena Bioscience'tanNU-405LGuanozin-5 '[ (&alfa;,β)-metileno]trifosfat (GMPCPP)
GS Power'ın 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 fit, %99,9 Telli Oksijensiz Bakır OFC, Kırmızı/Siyah 2 İletken Bağlı Zip Kablosu Araba, Ses, Ev Sineması Amazon B07428NBCW için Güç / Hoparlör Elektrik KablosuBakırtel
Ganozin 5'-trifosfat sodyum tuzu hidratSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Deterjan
HEPES Sodyum Tuzu (Beyaz Toz), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
Yüksek performanslı blender makinesiAIMORESAS-UP1250Blender
His GraviTrapGE Healthcare11003399Yerçekimi Kolonu
İmidazolSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758İzopropil ve beta;-D-1-tiyogalaktopiranosid
İzopropil Alkol %99Pharmco by Greenfield Global231000099İzopropanol
JA-10 rotorBeckman Coulter369687
L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidratSigma-AldrichG1501K-Glutamat
Lizozim tavuk yumurtası akıSigma-AldrichL6876
Magnezyum klorür heksahidratSigma-AldrichM2670MgCl2 ve boğa; 6H2O
MES sodyum tuzuSigma-AldrichM50572- (N-Morfolino) etansülfonik asit sodyum tuzu
MOPSSigma-AldrichM12543- (N-Morfolino) propansülfonik asit
MP-3022TE TeknolojisiMP-3022Termokupl
N, N, N ', N'-Tetrametiletilendiamin% 99, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS SpektrofotometreThermo Fisher ScientificE112352Spektrometresi
Nikon Ti2-E Nikon Ters MikroskopNikonMEA54000
Norland Optik Yapıştırıcı 81Norland ÜrünleriNOA81UV yapıştırıcı
Novex Sharp Önceden Boyanmış Protein StandardıThermo Fisher ScientificLC5800Protein standart merdiven
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1,5 mm, 10 oyukluThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS jel
Optima L-90K UltrasantrifüjBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 sargısı, 4" genişliğinde; 125 ft/ruloCole-ParmerEW-06720-40Balmumu filmi
Pe 300 ultra Aydınlatma Sistemi Tek Bant, 3mm Işık Kılavuz kontrolü Pod güç kaynağıNikonPE-300-UT-L-SB-40Soğuk LED Aydınlatıcı
Fenilmetansülfonil florürSigma-Aldrich78830PMSF
Fosfoenolpirüvik asit monopotasyum tuzu, %99BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Test KitiThermo Fisher Scientific23200
Pierce Proteaz İnhibitörü Mini TabletlerThermo Fisher ScientificA32953
BORULARSigma-AldrichP67571,4-Piperazindietansülfonik asit
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poli (etilen glikol)Sigma-Aldrich81300PEG. Ortalama molekül ağırlığı 20.000 Da
Potasyum Hidroksit (Peletler/Sertifikalı ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W Güç Kaynağı (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300Jel kutusunun DC güç kaynağı
PS-12-8.4ATE TeknolojisiPS-12-8.4ASıcaklık kontrol cihazının
DC güç kaynağıTavşan kasından piruvat kinaz / laktik dehidrojenaz enzimleriSigma-AldrichP-0294PK / LDH
Sessiz Bir Lifegard Fıskiye Pompası, Saatte 296 GalonAmazonB005JWA612Balık tankı pompası
Rosetta 2(DE3)pLysS Yetkili Hücreler - NovagenMillipore Sigma71403Yetkili hücreler
Keskin Mikrodalga ZSMC0912BS Sharp 900W Tezgah Üstü Mikrodalga Fırın, 0.9 Fit Küp, Paslanmaz ÇelikAmazonB01MT6JZMRSuyu kaynatmak için mikrodalga
Sodyum Klorür (Kristal/Sertifikalı ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Sodyum dodesil sülfatSigma-AldrichL3771SDS
Sodyum fosfat monobazikSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Streptavidin ProteiniThermo Fisher Scientific21122
SükrozSigma-AldrichS7903
TC-720TE TeknolojisiTC-720Sıcaklık kontrolörü
Tris Base, Moleküler Biyoloji Sınıfı - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Tip 45 Ti rotorBeckman Coulter339160
Tip 70 Ti rotorBeckman Coulter
Tip 70.1 Ti rotorBeckman Coulter342184
VWR Genel Amaçlı Laboratuvar Etiketleme BandıVWR89097-916Kağıt bantlar
VWR Mikro Kapak Camları, Kare, No. 1 1/2VWR48366-227Cam lameller
VWR Düz ve Buzlu Mikro Kaydıraklar, PremiumVWR75799-268Cam kaydıraklar
XCell SureLock Mini HücreliThermoFisher ScientificEI0001Jel kutusu
ZYLA 5.5 USB3.0 KameraNikonZYLA5.5-USB3Tek renkli CCD kamera
izleyici parçacıklar Glikoz Oksidaz 337922

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002(2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102(2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114(2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375(2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470(2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688(2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1(2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246(2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564(2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486(2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601(2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037(2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102(2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142(2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102(2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333(1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006(2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304(2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microtubule Based Active FluidsKinesin Driven Flow ControlTemperature Tuning MethodFlow Speed RegulationActive Fluid PreparationFluorescent Microscopy ImagingTracer Particle TrackingTemperature Control SetupMicrofluidic Device DesignArrhenius Characteristic Analysis

Related Articles