Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Summary

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Abstract

Hücre içi bakteriler, konak proteinleri ve/veya bunların ilişkili biyolojik yollarını bakterinin yararına bozmak için harekete giren konak sitosola efektör proteinler adı verilen virülans faktörleri salgılarlar. Putatif bakteriyel efektör proteinlerinin tanımlanması, bakteri genom dizilimindeki gelişmeler ve salgı adaylarını ve/veya ökaryotik benzeri genlerin silico olarak tanımlanmasına olanak sağlayan algoritmaların ortaya çıkması yla daha yönetilebilir hale gelmiştir. Etki alanları. Ancak, bu önemli virülans faktörlerinin belirlenmesi sadece bir başlangıç adımıdır. Doğal olarak, amaç efektör proteinlerin moleküler fonksiyonunu belirlemek ve konak ile nasıl etkileşime açıklanır. Son yıllarda, maya iki melez ekran ve kütle spektrometresi ile birleştiğinde büyük ölçekli immünopretri gibi teknikler protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde yardımcı olması. Bir konak bağlayıcı ortağın tanımlanması, bakteriyel efektör proteinin moleküler işlevini niçin açıklığa kavuşturmaya yönelik önemli bir ilk adım olsa da, bazen konak proteinin birden fazla biyolojik işlevi olduğu saptandı (örneğin, aktin, klathrin, tubulin), veya bakteriyel protein, konak proteinlerini fiziksel olarak bağlamayabilir, bu da araştırmacıyı manipüle edilen kesin konak yolu hakkında önemli bilgilerden mahrum bırakabilir. Bir bastırıcı ekran ile birleştiğinde modifiye maya toksisite ekranı bakteriyel efektör proteinler tarafından etkilenen konak yollarını belirlemek için adapte edilmiştir. Toksisite ekranı, genellikle büyüme kusuru olarak kendini gösteren konak biyolojik yolları etkileyen efektör proteinin neden olduğu mayadaki toksik etkiye dayanır. Bir maya genomik kütüphane ifadesi bakteriyel efektör proteintoksisitesini bastırmak ve böylece etkici protein hedefleri yolunda proteinleri belirlemek konak faktörleri tanımlamak için kullanılır. Bu protokol hem toksisite hem de bastırıcı ekranlar için ayrıntılı talimatlar içerir. Bu teknikler moleküler klonlama ve maya ve Escherichia coliekimi yeteneğine sahip herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Introduction

Burada sunulan benzer prosedürlerin ilk raporu Legionella pnömofili tip IV efektör SidD karakterize,^Rab11 değiştirir bir deAMPylase . Karşılaştırılabilir teknikler birkaç L. pnömofili efektörlerinin karakterizasyonu için kullanılmıştır^1,2,3. Bir Coxiella burnetii tip IV efektör protein^karakterizeetmek için yapılan tetkik, ve son zamanlarda bu tekniğin yararı Klamidya trachomatis inklüzum membran proteinlerin karakterizasyonu için genişletildi⁵ .

Protocol

1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: Plakalar tisme gününden önce hazırlanmalı ve 1 ay boyunca iyi olacaktır. Medya ve reaktifler herhangi bir noktada yapılabilir ve 1 ay boyunca iyidir.

1. 1,000 mL'lik bir kabın içinde 800 mL distile suda 100 g D-(+)-glikozu eriterek glikoz çözeltisinin 1 L'sini (%10 w/v) hazırlayın. Distile su ile hacmi 1 L olarak ayarlayın. Steril 1 L ortam depolama şişesine 0,2 m steril filtreden süzün.
2. 1 L kabında 800 mL distile su damıtılmış su 100 g D-(+)- galaktoz eriterek galaktoz çözeltisinin 1 L'sini (%10 w/v) hazırlayın. Distile su kullanarak sesi 1 mL'ye ayarlayın ve 0,2 m steril filtrede....

Results

Gerçek maya bastırıcı ekran yapılabilir önce, ilgi efektör protein maya toksisite için test edilmelidir. Bu bir galaktoz indükleyici kontrolü altında maya ilgi protein ifade ederek gerçekleştirilir. Glikozda büyüme (nonindücing koşulları) öncelikle toksisite özellikle ilgi proteininin ekspresyonundan kaynaklandığından ve genel bir kusur olmadığından emin olmak için karşılaştırılmalıdır. Şekil 3'tegösterildiği gibi toksisite daha küçük koloniler ve/veya büyümenin azalması olarak kendini göste.......

Discussion

Bu protokol, modifiye edilmiş maya toksisitesi ve bastırıcı ekran kullanarak bakteriyel efektör proteinler tarafından hedeflenen konak biyolojik yollarını belirlemek için adım adım prosedürleri özetliyor. Kullanılan maya suşu, S. cerevisiae W303, hem urasil hem de lösin için yardımcı dır. Suş urasil auxotrophy pYesNTA-Kan vektörü üzerinde ilgi protein taşıyan maya seçmek için kullanılır ise lösin ekofofimaya genomik kütüphane vektör pYep13 seçmek için kullanılır. Maya genomik kütüphane plazmidleri 3−13 ORF taşır.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galaktoz	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet Jel ekstraksiyon kiti	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR saflaştırma kiti	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet plazmid mini hazırlık kiti	Thermo	K0503
Glikoz	MilliporeSigma	G8270-1KG
Ringa Balığı Sperm DNA'sı	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Lityum asetat dihidrat	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz	New England Biolabs	M0530
Poli (etilen glikol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligaz	New England Biolabs	M0202S
Triptofan	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Maya özü	Fisher Bilimsel	BP1422-500
Maya mini hazırlık kiti	Zymo	D2001
Amino asitsiz maya azot bazı	MilliporeSigma	Y0626-250G
Maya Sentetik Bırakma Orta Takviyeleri	MilliporeSigma	Y1501-20G	urasil olmadan
Maya Sentetik Bırakma Orta Takviyeleri	MilliporeSigma	Y1771-20G	olmadan urasil, lösin, triptofan