Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi

4.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60523

⸱

27 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2School of Life Science, University of Science and Technology of China, 3State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.

Özet

T Foliküler Yardımcı (Tfh) hücreleri, germinal merkez (GC) gelişimi ve yüksek benzeşimli antikorların üretimi için yardım sağlama konusunda uzmanlaşmış bağımsız bir CD4+ T hücre alt kümesidir. grip virüsü enfeksiyonunda, etkili virüs eradikasyonunu kolaylaştırmak için sağlam Tfh ve GC B hücre yanıtları indüklenir, bu da Tfh ile ilişkili çalışma için nitelikli bir fare modeli sağlar. Bu yazıda, farelerde influenza virüsü enfeksiyonu sırasında temel Tfh ilişkili immün yanıtın tespitinde protokolleri açıkladık. Bu protokoller şunlardır: influenza virüsünün intranazal infülasyonu; akış sitometrisi boyama ve poliklonal ve antijene özgü Tfh hücrelerinin, GC B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin analizi; GC'lerin immünofluoresans tespiti; serumda influenza virüsüne özgü antikorun enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA). Bu tahliller temel olarak influenza virüs enfeksiyonunda Tfh hücrelerinin farklılaşmasını ve işlevini ölçerek farklılaşma mekanizması ve manipülasyon stratejisinin aydınlatıcı çalışmalarında yardımcı olunmaktadır.

Giriş

Son on yılda, germinal center (GC) B gelişimindeki temel rolleri için yeni tanımlanan CD4+ T hücre alt kümesi olan Tfh hücre alt kümesi üzerinde çok sayıda çalışma odaklanmıştır. Esas olarak bir gen represörü olarak kabul edilen B hücreli lenfoma 6 (Bcl6), Bcl6'nın ektopik ekspresyonunun Tfh farklılaşmasına yol açmanın yeterli olduğu ve Bcl6'nın eksikliğinin kaybolan Tfh farklılaşması 1 ,2,3ile sonuçladığı kanıtı için Tfh hücrelerinin soyu belirleyici faktörüdür. Diğer CD4+ T yardımcı alt kümelerinin aksine, iltihap bölgelerine göç ederek efektör işlevlerini yerine getirirken, Tfh hücreleri B hücresi yardımını esas olarak dalak ve lenf düğümünün B hücre foliküler bölgesinde sağlar. Ortak uyarıcı moleküller ICOS ve CD40L, Tfh ve GC B hücreleri arasındaki etkileşimde önemli roller oynar. Tfh farklılaşması sırasında, ICOS konyak B hücrelerinden gerekli sinyalleri iletir ve ayrıca B hücre bölgesi lokalizasyonu4,5için seyirci B hücrelerinden geçiş sinyalleri alan bir reseptör görevi görür. CD40L, B hücrelerinin çoğalması ve sağkalım için Tfh hücrelerinden gelen sinyallerin arabulucusudur6. CD40L ile benzer rolü oynayan bir diğer faktör, esas olarak Tfh hücreleri tarafından salgılanan sitokin IL21'dir. IL21, GC B hücrelerinin gelişimini ve yüksek benzeşimli antikorların üretimini doğrudan düzenler, ancak Tfh farklılaşmasındaki rolü hala tartışmalıdır7,8. Akış sitometrisi analizinde Tfh hücrelerinin tanımlanmasında en sık kullanılan PD-1 ve CXCR5 de bu alt kümenin farklılaşmasında ve işlevinde önemli roller oynamaktadır. CXCR5, B hücre foliküler kemokinin reseptörüdür ve B hücre foliküllerinde Tfh hücrelerinin lokalizasyonuna aracılık eder9. PD-1 artık sadece foliküler rehberlik işlevine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda GC B hücrelerinin benzeşim olgunlaşması sürecinde kritik sinyalleri iletir10. Bu bulgulara dayanarak, bu moleküllerin ekspresyonunu değerlendirmek temel olarak Tfh hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini yansıtabilir.

GC, sekonder lenfoid organlarda indüklenmiş geçici bir mikroanatomik yapıdır ve Tfh hücrelerine oldukça bağımlıdır, bu nedenle Tfh yanıtını değerlendirmek için mükemmel bir okumadır. GC'de, sitokinler ve ko-uyarıcı moleküller tarafından aracılık edilen sinyalleri aldıktan sonra, B hücreleri yüksek benzeşimli antikorlar oluşturmak için sınıf değiştirme ve somatik hipermütasyona tabidir11. Diferansiyel antikor sınıfı anahtarlama, IL4 ve IL21'in IgG1 sınıfının değiştirilmesine neden olduğu diferansiyel sitokin nişinde gerçekleşirken, IFNφ IgG2 sınıfının12'yegeçmesine neden olur. Plazma hücreleri salgılanan antikorların üreticileridir ve ölümcül olarak farklılaştırılmış hücrelerdir. Tfh hücreleri gibi, GC'deki B hücrelerinin gelişimi de birçok önemli molekülün dinamik ekspresykülü ile ilişkilidir. Mevcut çalışmaya dayanarak, GC B hücreleri B220+PNA+Fas+ veya B220+GL7+Fas+ hücreler ve plazma hücreleri olarak tanımlanabilir, öncüllerine kıyasla, B220'nin downregulate ekspresyolu ve upregulate CD138 ifadesi13. Dahası, bu özelliklerin her ikisi de akış sitometrisinde ve immünofluoresans analizinde tespit edilebilir, böylece GC yanıtının uygun değerlendirmesidir.

Grip virüsü enfeksiyonunda sağlam hücresel ve humoral yanıtlar indüklenir, Tfh ve Th1 hücreleri CD4+ T hücre yanıtı14'e hakimdir, bu da onu Tfh hücreleri farklılaşma çalışması için mükemmel bir model haline getirir. Influenza A/Porto Riko/8/34 Fareye uyarlanmış bir suş olan H1N1 (PR8), bu çalışmada sıklıkla14,15,16. Burada, influenza virüsü enfeksiyonunda Tfh çalışması ile ilgili tahlillerin bazı temel protokollerini açıklıyoruz: 1) PR8 virüsünün intranazal infülasyonu; 2) antijene özgü Tfh hücreleri, GC B ve plazma hücreleri ve akış sitometrisi ile IL21 tespiti; 3) GC'nin histolojik görselleştirilmesi; 4) ELISA ile serumda antijene özgü antikor titresinin tespiti. Bu protokoller, Tfh ile ilişkili çalışmada yeni araştırmacılar için gerekli teknikleri sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan deneyleri, Çin'in Şanghay kentindeki Institut Pasteur Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı hayvan protokolleri esas alınarak gerçekleştirildi.

NOT: Farelerin virüs enfeksiyonu ve organların izolasyonu ABSL2 durumu altında yapılmalıdır.

1. PR8 influenza virüsünün aşılenmesi ve fare ağırlığının kaydedilmesi

  1. ABSL2 odasında 8 haftalık erkek C57BL/6 fareleri enfeksiyon için hazırlayın.
    NOT: Bu protokol dişi farelerle yapılan deneylerde de uygundur.
  2. PR8 virüsünün seyreltilmesi: virüsü -80 ° C dondurucudan alın ve sıvı haline gelene kadar buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Stok virüsünü iyice girdaplayın ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpte steril fosfat tamponlu salin (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH 2 PO4)ile virüsü2PFU/μL'ye seyreltin.
  3. Fare uyuşturma: her fareyi tartın ve kullanılacak sodyum pentobarbital (2 mg/mL) fare ağırlığını (g)) (4 kat (μL) hesaplayın. Hesaplanan sodyum pentobarbital intraperitoneal hacmini enjekte edin.
    NOT: Bu adım, farelerin istikrarlı ve huzurlu bir şekilde nefes almasını sağlamaktır, böylece doğru virüs titresi intranazal olarak aşılanabilir. Çok hızlı veya yavaş kalp atışları uygunsuz anesteziye işaret eder. Ek olarak, göz kuruluğundan kaçınmak için veteriner merhem kullanılması önerilir.
  4. İntranazal Aşılama: seyreltilmiş PR8 virüsünü iyice girdap. Pipet 10 μL ve bir tarafta damla damla intranazal aşılamayı dikkatlice gerçekleştirin. Bu taraftaki tüm farelerin bir kafesteki (maksimum 5 fare) aşısını bitirdikten sonra, diğer tarafta aşılamayı tekrarlayın (farenin nefes almasını aşı boyunca huzurlu ve sabit tutun). Her fare toplamda PR8 virüsünün 40 PFU ile enfekte.
  5. Fareleri daha iyi canlanma için sıcak kafeslere sternal reumbency yerleştirin.
  6. Fare ağırlığını 10 gün boyunca günlük olarak izleyin. (Enfeksiyon günü 0. gün olarak kaydedilir).

2. Lenfositlerin dalak ve mediastinal lenf düğümünden (mLN) izolasyonu

  1. Fare ötenazisi: fareleri küçük bir odaya koyun ve odanın dibinden co2'ye barışçıl bir şekilde pompalayarak fareleri ötenazi edin. Hareket etmediklerinde fareleri dışarı atın ve farelerin tamamen ölmesini sağlamak için servikal çıkık yapın. Fareleri% 75 etanol ile batırın ve biyogüvenlik başlığına aktarın.
  2. Fareleri emici kağıt kaplı diseksiyon köpük plakasına diseksiyon iğneleri ile hareketsiz hale koyun. Karın orta çizgisi ve arka bacaklar boyunca cildi diseksiyon makası ile kesin ve cildi cımbızla gerin. Gerilen cildi diseksiyon iğneleri ile hareketsiz hale ederim.
  3. Her fare için iki adet 6 cm'lik tabak hazırlayın ve buzda saklayın. Her yemeğe 70-μm hücre süzgeci koyun ve% 1 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 5 mL DMEM ekleyin (DMEM (% 1 FBS))
  4. Dalak izolasyonu: karın boşluğunu diseksiyon makası ile açığa çıkarmak için peritonu kesin. Dalağını al ve hazırlanan yemeğe koy.
  5. mLN izolasyonu: diyaframı ve kafes kaburgasının altını timus çevresine kesin. Kaburgayı kenara çekin ve torasik boşluğu açığa çıkarmak için diseksiyon iğneleriyle sabitleyin. Akciğeri sağ tarafa çekin ve mLN almak için cımbız kullanın, kalbin altında ve nefes borusunun ventral tarafının yakınında.
  6. MLN'yi hazırlanan yemeğe koyun.
  7. Tek hücreli süspansiyonları elde edin: dalak veya mLN'yi 70-μm hücre süzgecinden 3 mL şırıngan pistonla hafifçe mesh edin. Hücre süzgecini 1 mL taze DMEM (%1 FBS) ile durulayın. Hücre süspansiyonu yeniden ıslatın ve 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  8. Hücre süspansiyonu 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve 1 mL DMEM (%1 FBS) ekleyin.
  9. Hücre peletini 1 mL-pipet ile iyice yeniden ıslatın. Dalak hücresi süspansiyonlarına 4 mL DMEM (%1 FBS) ekleyin ve aşağıdaki işlemler için buzda tutun.
    NOT: Tek hücreleri peletten tamamen izole etmek için hücre peletini öncelikle 5 mL değil, 1 mL orta ile yeniden depolamak gerekir.
    Bu adımdan itibaren tüm işlemler normal laboratuvarda gerçekleştirilebilir.
  10. Dalak hücre sayımı
    1. Tüpleri birkaç kez yukarı ve aşağı çevirerek hücreleri yeniden biriktirin. 10 μL'yi 90 μL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponuna alın (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Oda sıcaklığında (RT) 3 dakika kuluçkaya yatırın ve reaksiyonun sonlandırılması için 900 μL soğuk PBS ekleyin.
    2. 4 °C'de 6 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. 100 μL soğuk PBS ile yeniden depola. 10 μL hücreyi 10 μL w/v trippan mavisine alın ve hemositometre ile hücre sayımı için karışımdan 10 μL alın.
    3. Hesaplama: hücreleri normal yöntem olarak hesaplayın. Kısacası, hemositometredeki iki çapraz köşe karesinde hücre numaralarını sayın ve her köşe karesi için N1, N2 alın. 5 mL hücre süspansiyonunun hücre konsantrasyonu (N1+N2)/2 x 104 /mL olarak hesaplanmalıdır.

3. PD-1 ve CXCR5 ile Poliklonal Tfh hücrelerinin immünostainingi

  1. Biotin-anti-CXCR5 antikor ile boyama.
    1. Tüpü yukarı ve aşağı çevirerek hücre süspansiyonlarını yeniden dirsindirin. FACS tüpüne 2 x10 6 hücre alın ve 2 mL boyama tamponu ekleyin (PBS (%1 FBS, 1 mM EDTA)). Girdap salınım cihazında girdapla yıkayın.
    2. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Sıvıyı dökerek süpernatantı atın ve tüp ağzını emici kağıda iki kez batırın.
    3. Tüp tabanına dokunarak hücre peletini kalıntı sıvısı ile gevşetin. Tüpü buzun üzerindeki tüp tutucusuna koyun.
      NOT: Kalıntı sıvı hacmi yaklaşık 25 μL'dir.
    4. Her tüp için 0,2 μL fare önleyici CD16/CD32 (Fc-reseptör engelleyici) ekleyin. Tüp tabanına hafifçe dokunarak girdap ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslanın.
      NOT: Her tüp için 5μL boyama tamponu ile seyrelterek birden fazla numune için antikor karışımı hazırlayın. Karışım tarifi seyreltilerek (n/10+1) x 0,2 μL Fc-reseptör bloker (n/10+1) x 5 μL boyama tamponuna hazırlanmalı ve her tüpe 5,2 μL karışım eklenmelidir.
    5. Tüp tabanına dokunarak her tüp ve girdap için 30 μL boyama tamponu kalıntısına 0,3 μL biotin-anti fare CXCR5 ekleyin.
      NOT: Karışımı adım 3.1.4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
    6. Tüpe 30 dakikada dokunarak hafifçe ıslatıcı hücrelerle 1 saat boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
      NOT: 30 dakikada girdap, daha iyi boyama için hücre agregalarını önlemektir.
    7. Girdap salınım cihazına 2 mL boyama tamponu ve girdap ekleyin. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj ve 3.1.2 adımında açıklandığı gibi süpernatantı atın. Tüpe dokunarak girdap ve sonraki boyama için buz üzerinde kuluçkaya yaslanın.
  2. Diğer yüzey işaretleyicilerle boyama.
    1. Adım3.1.4'teaçıklandığı gibi antikor karışımını ( Tablo 1 ) hazırlayın.
    2. Her tüpe antikor karışımı ekleyin. Tüp tabanına dokunarak girdap ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yaslanın.
    3. Hücreleri 2 mL boyama tamponu ile yıkayın. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj.
    4. Süpernatant atın ve 400 μL boyama tamponu ekleyin. Girdap salınım cihazındaki tüpü girdaplayın ve akış sitometri analizine kadar tüpü karanlıkta tutun.

4. PR8 influenza virüsünün NP'ye özgü Tfh hücrelerinin immünostainingi

NOT: NP'ye özgü Tfh hücrelerini boyamanın bu protokolü önceki çalışmalardan15,17.

  1. 3.1. adımda açıklandığı gibi biotin-CXCR5 boyama gerçekleştirin, ancak boyama için alınan hücre numarasının akış sitometrisinde kaydedilecek kadar antijene özgü hücre için 3 x10 6 olması dışında.
  2. Tüpe 3.1.7'den 0.3 μL APC-konjuge-IAbNP311-325 MHC sınıf II(NP 311-325)tetramer ekleyin. 3.1.4 adımında olduğu gibi birden fazla numune için karışım hazırlayın
    NOT: CD4 ve anti-CD4 antikor arasındaki bağ optimal tetramer lekesini engelleyeceğinden, anti-CD4 antikorunun eklenmesinden önce tetramer lekesi önemlidir.
  3. Tüpe hafifçe dokunarak hücre karışımını yeniden saklayın ve RT'de 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
    NOT: Buharlaşmayı azaltmak için tüplerin ağzına ıslak bir kağıt örtün
  4. Diğer yüzey işaretleyicilerinin karışımını ekleyin (Tablo 1) ve 30 dakika boyunca RT'de inkübasyona devam edin.
  5. Hücreleri 3.2.3 ve 3.2.4 adımlarında açıklandığı gibi yıkayın ve yeniden uygulayın.

5. Poliklonal Tfh hücrelerinde Bcl6'nın immünostainingi

  1. Boyama tamponu yerine2mL PBS ile son yıkama dışında bölüm 3'te açıklandığı gibi yüzey işaretleyicileri ( Tablo 2 ) boyama gerçekleştirin.
  2. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Tüp tabanına hafifçe dokunarak süpernatant ve resuspend hücre peletlerini atın.
  3. Hücre fiksasyonu için tüpe 300 μL% 3.7 formaldehit çözeltisi (PBS ile% 37 formaldehitten seyreltilmiş) ekleyin. Girdap salınım cihazında girdap ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
  4. Yıkama için 2 mL boyama tamponu ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ekleyin. Tüpe hafifçe dokunarak süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
  5. %0,2 Triton-X 100'ün 300 μL'sini ekleyin ve vorteks salınım cihazına girdapla hücreleri yeniden depoleyin. RT'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
  6. Yıkama için 2 mL boyama tamponu ekleyin. 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. Tüp tabanına hafifçe dokunarak süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
  7. Her tüp için 1,5 μL PE-anti-Bcl6 antikoru ekleyin. Karışımı yeniden çıkarmak için tüp tabanına hafifçe dokunarak ve her 30 dakikada bir tüpe hafifçe dokunarak RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Karışım buharlaşmasını azaltmak için tüplerin ağzına ıslak bir kağıt örtün.
  8. Tüpe %0,01 Triton-X 100 ile desteklenmiş 2 mL PBS ekleyin. Vorteks ve santrifüj 500 x g'da 4 °C'de 6 dakika.
  9. Yıkamayı adım 5.8 olarak tekrarlayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponu ile yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine kadar hücreleri buzun üzerinde karanlıkta tutun.

6. IL21'in hücre içi boyanma

  1. PMA (phorbol 12-myristate 13-asetat) ve iyonomisit ile hücreleri uyarın.
    1. Dalak hücre süspansiyonundan 2 x10 6 hücre alın ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj alın. 500 μL tam T hücre ortamı ile süpernatant ve resuspend hücre pelet atın. Hücreleri 24 kuyu plakasına aktarın.
    2. 500 μL tam orta18'e 20 nmol PMA ve 2 μmol iyonomisin ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın.
    3. 6.2. adımda hazırlanan çözeltiyi 24 kuyu plakasındaki hücre süspansiyonuna ekleyin ve plakayı sallayarak karıştırın. Hücrelere PMA ve iyonomisinin eklenmesi olmadan 500 μL komple T hücre ortamı ekleyerek uyarılmamış kontrolü ayarlayın. 4 saat boyunca 37°C'de bir CO2 inkübatörde kuluçkaya yaslanın.
    4. Golgi aparat aracılı protein taşımacılığını engellemek için her kuyuya 10 μmol BFA (metanol ile çözünmüş Brefeldin A) ekleyin. Plakayı hücre inkübatörüne geri koyun ve 2 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Hücre yüzeyi işaretçisi boyama gerçekleştirin.
    1. Hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyarak yeniden biriktirin ve hücreleri bir FACS tüpüne aktarın. Tüpe 1 mL boyama tamponu ekleyin ve 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj ekleyin.
    2. Adım 3.1.4 olarak Fc-reseptör engelleyici boyama gerçekleştirin.
    3. 2 mL PBS'li hücreleri yıkamak dışında, 3.2.1 ile 3.2.3 adımlarında açıklandığı gibi hücre yüzeyi işaretleyicileri boyama (Tablo3 ) gerçekleştirin.
    4. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj. Tüp tabanına dokunarak süpernatant ve resuspend hücrelerini atın.
  3. Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell boyama kitinden 0,2 μL reaktif ekleyin ve ölü hücrelerin lekelenmesini gerçekleştirmek için tüpü RT'de 10 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın.
  4. Tüpe 2 mL PBS ve girdap salınım cihazına vorteks ekleyin. 4 °C'de 6 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
  5. Hücre sabitlemesini 5.3 ve 5.4 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  6. Hücreleri yeniden depolamak için 300 μL boyama tamponu ekleyin ve tüpleri gece boyunca 4 °C buzdolabında saklayın. Süpernatantı çıkarmak için 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj.
    NOT: Bu adım atlanabilir ve 6.5 adımdan hemen sonra 6.7 adımına devam edebilir.
  7. Girdap salınım cihazındaki tüpe ve girdabın içine 1 mL saponin tamponu (%0,2(w/v) saponin ile desteklenmiş boyama tamponu) ekleyin. Hücre permeabilizasyonunu gerçekleştirmek için buz üzerinde 20 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. 4 °C'de 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ve supernatant atın.
  9. Her tüpe 0,5 μL insan Fc-IL21 reseptörü ekleyin. Antikor karışımını, lekeleme tamponu yerine saponin tamponu ile seyreltin dışında, adım 3.1.4 olarak çoklu olarak hazırlayın.
  10. Hücreleri 30 dakikada yeniden çıkarmak için tüp tabanına hafifçe dokunarak RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  11. Hücreleri yıkamak için 2 mL saponin tamponu ekleyin ve 6 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve tekrar yıkamayı bir kez tekrarlayın.
  12. Her tüpe 0,1 μL APC-anti-insan Ig(H+L) ekleyin. Birden fazla örnek için karışımı adım 3.1.4 olarak hazırlayın, ancak antikoru boyama tamponu yerine saponin tamponu ile seyreltin.
  13. Numuneleri 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve adım 6.11 olarak yıkayın.
  14. Hücreleri 400 μL boyama tamponu ile yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine kadar numuneyi buzun üzerinde karanlıkta tutun.

7. GC B ve plazma hücrelerinin boyanma

  1. Hücreleri alın ve anti-Fc-reseptör antikor boyamasını 3.1.1 ile 3.1.4 arasında adımlar olarak gerçekleştirin.
  2. Kuluçka süresinin 1 saat yerine 30 dakika olması dışında, yüzey işaretleyicileri boyamayı (Tablo 4) 3,1,5 ila 3,1,7 arasında adımlar olarak gerçekleştirin.
  3. Hücreleri 400 μL boyama tamponu ile yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine kadar numuneleri buzun üzerinde karanlıkta tutun.

8. Serumun kandan izolasyonu

  1. Enfeksiyon sonrası 14. günde (d.p.i 14), kanı yüz damarından toplayın ve kan örneklerini gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
    NOT: ABSL2 durumunda kan alma işlemi gerçekleştirin ve bu adımdan itibaren tüm prosedürler normal laboratuvarda yapılabilir.
  2. Kanı 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Kırmızı hücrelerin kirlenmesini önlemek için serumu 200 μL pipetle dikkatlice izole edin. Aliquot her örnek için 3 tüp içine ve -80 ° C'de saklayın.

9. ELISA ile HA'ya özgü antikor titresinin tahlili

  1. ELISA plakalarını kuyu başına 50 μL 2 μg/mL HA protein çözeltisi ile kaplayın ve bir gecede 4 °C buzdolabında kuluçkaya yatırın.
  2. 200 μL PBS seyreltilmiş %0,05 ara (PBST) ile üç kez yıkayın. Her kuyuya 100 μL PBST seyreltilmiş %5 yağsız süt ekleyin ve spesifik olmayan bağlamayı engellemek için RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Serum seyreltme ve inkübasyon: PBS'de seyreltme tamponu olarak %3 BSA hazırlayın. Serumu seyreltme tamponunda 1:50, 1:150, 1:450, ...... 1:36450'ye kadar (3 kat seri seyreltme önerilir). Her kuyuya 50 μL seyreltilmiş serum ekleyin ve bir gecede 4°C buzdolabında kuluçkaya yatırın.
  4. Serumu atın ve her kuyuya 200 μL PBST ekleyerek kuyuları bir kez hızlıca yıkayın (yavaşça çalkalayın, sonra atın). Daha sonra plakaları her biri 5 dakika boyunca üç kez 200 μL PBST ile çalkalayıcıda yavaşça yıkayın.
  5. Toplam IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, PBST ile seyreltilmiş) için özel 100 μL HRP etiketli ikincil antikor ekleyin ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakaları 9.4'te açıklandığı gibi PBST ile yıkayın.
  6. 4 °C depolama alanından eşit miktarda A ve Tampon B (TMB) çıkartın ve kullanmadan önce RT'de en az 30 dakika ısıtın. A ve B'yi karıştırın ve her kuyuya 100 μL TMB ekleyin ve yumuşakça sallayarak RT'de 10-30 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bu, TMB Substrat Reaktif Seti (BD,555214) kılavuzunun kısa bir açıklamasıdır.
  7. Reaksiyonun sonlandırılması için her kuyuya pipet 100μL 2MH 2 SO4. OD450 değerini enstrüman aracılığıyla okuyun.
  8. Veri Analizi: arka plan sinyalini (boş kuyunun OD450 değeri) çıkararak son OD450 değerini alın. X eksenindeki seyreltme faktörü ve Y eksenindeki OD450 değeri ile her numunenin antikor izotipine karşılık gelen eğriyi çizin.

10. Histoloji

  1. Dalakları D.P.I. 10'da izole et. RT'de 1 saat boyunca %3,7 formaldehit çözeltisinde sabitleyin.
  2. PBS'deki dalakları (%10 sakkaroz) 1 saat boyunca 4°C'de sulandırın ve daha sonra dalaklar 15 mL tüpün dibine batana kadar yumuşakça sallayarak 4°C'de PBS'de (%30 sakkaroz) susuz kalın.
  3. Susuz dalakları çıkar, optimum kesme sıcaklığı bileşiği ve kriyoseksiyona gömün.
  4. Asetonları -20°C'de önceden soğutun. Doku bölümlerini önceden soğutulmuş aseton ile 10 dakika kuluçkaya yatırın. Dokuyu PBS ile üç kez yıkayın.
  5. %0,2 Triton X-100 içeren PBS ile doku bölümlerini 20 dakika boyunca permeabilize edin ve PBS ile üç kez yıkayın.
  6. Spesifik olmayan bağlamayı RT'de 1 saat boyunca %10 normal keçi serumu (blokaj tamponu) içeren PBS ile engelleyin ve doku bölümlerini pbs ile bir kez yıkayın.
  7. STREPTAVIDIN/BIOTIN engelleme kiti ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin.
    NOT: Bu adımdan itibaren numunelerin kurumasına izin vermeyin.
  8. Birincil antikor ile boyama: doku bölümlerine bloke tampon seyreltilmiş biotin-PNA (25 μg / mL) ve sıçan anti-fare IgD (2.5 μg / mL) ekleyin. Islak odadaki doku bölümlerini bir gecede 4 °C dondurucuda kuluçkaya yatırın.
  9. Doku bölümlerini PBST ile bir kez hızlıca yıkayın. PBST'deki doku bölümlerini 5 dakika boyunca yavaşça sallayarak hızlı bir şekilde yıkayın. Üç kez yıkamayı tekrarlayın.
  10. Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) ve Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) antikorlarını bloke tampon ile seyreltin ve doku bölümlerine dikkatlice ekleyin
  11. RT'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
  12. Doku bölümlerini adım 10.8 olarak yıkayın ve uzun süreli çözelti ile dikkatlice monte edin. Dokuyu kapakçıklarla dikkatlice örtün ve konfokal analize kadar 4°C'de karanlıkta tutun.
  13. Alan boyutu başına GC numaralarını sayarak GC reaksiyonunun büyüklüğünü analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnfluenza virüsü enfeksiyonunda fare morbiditesinin karakterizasyonu
İnfluenza virüsü enfeksiyonundan sonra, fareler, fare morbiditesini izlemek için yaygın olarak kullanılan bir semptom olan şiddetli kilo kaybı ile yansıyan hastalık nedeniyle daha az aktif ve anoreksiktir19. Şekil 1'degösterildiği gibi, PR8 virüs bulaşmış fareler 6. günde kilo vermeye başladı, 8. günde en yüksek kayıp seviyesine ulaştı ve 10. günde başlangıç sevi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yüksek benzeşimli antikorlar üretmek için B hücre yardımı sağlamada özel roller nedeniyle, Tfh hücreleri aşı tasarımı için yeni stratejiler sağlamak için farklılaşma ve manipülasyon mekanizmalarında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. İnfluenza virüsü enfeksiyonu güçlü Tfh ve GC B hücreleri yanıtlarına neden olarak bu araştırma alanı için uygun bir modeldir. Bu yazıda influenza virüsü enfeksiyonunun intranazal aşılama, Tfh ilişkili yanıtın akış sitometrisi, immünoresans ve ELISA ile değerlendirilmesi ile ilgili protokoll...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Debi sitometri tesisi, ABSL2 tesisi ve Şanghay Institut Pasteur SPF hayvan tesisi personeline teknik yardımları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklendi: Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFA0502202), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31570886).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SigmaF1635
Anti-CD16/32 fareThermo Fisher Scientific14-0161-86
APC-konjuge-IAbNP311-325 MHC sınıf II tetramerNIH
Bcl-6 PEBiolegend358504klon:7D1
Biotin-CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82klonu: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82klonu: GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42klonu: IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82klonu: IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150klonu: MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070klonu: 7E.17G9
PD1 PE / Cy7Biolegend135216klonu: 29F.1A12
Streptavidin BV421BD Pharmingen563259
Streptavidin PEBD Pharmingen554081
IL21< / güçlü hücre içi boyama>
% 37 formaldehitSigmaF1635
anti-insan IgGJackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları109-605-098
Brefeldin ASigmaB6542
insan FCc IL-21 reseptörüR& D Sistemi
iyonomisinSigmaI0634
Canlı / Ölü Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre boyama kitiThermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
SaponinMP102855
< güçlü > GC B ve plazma hücreleri boyama< / güçlü >
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81klonu: RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070klonu: 281-2
CD95 (FAS) PE / Cy7BD Pharmingen557653klonu: Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82klonu: 11-26c
PNA FITCSigmaL7381
< güçlü >ELISA ile HA'ya özgü antikor titresinin tahlili< / güçlü>
PR8-HAÇin Biyolojik11684-V08H
BSASSBC
Keçi anti fare Ig (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)SouthernBiotech5300-05
Keçi anti fare IgM (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)SouthernBiotech5300-05
Keçi anti fare IgG1 (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)SouthernBiotech5300-05
Keçi anti fare IgG2b (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)SouthernBiotech5300-05
Keçi anti fare IgG2c (SBA Klonotipleme Sistemi-HRP)SouthernBiotech5300-05
TMB Substrat Reaktif SetiBD Pharmingen555214
Histoloji
Alexa Fluor 555-Keçi-anti sıçan IgGYaşam TeknolojisiA21434
anti-fare IgDBiolegend405702
biyotinile PNAVektör laboratuvarlarıB-1075
seyreltik Alexa Fluor 488-streptavidinYaşam TeknolojisiS11223
normal keçi serumuSouthernBiotech0060-01
Pro-uzun altın antifade reaktifiThermo Fisher ScientificP3630
STREPTAVIDIN / BIOTIN engelleme kitiVektör laboratuvarlarıSP-2002
%37 formaldehitin güçlü> immün boyaması

Kaynaklar

  1. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  3. Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  4. Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
  5. Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
  6. Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
  7. Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
  8. Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
  9. Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
  10. Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
  11. Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
  12. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
  13. Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
  14. Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
  15. Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495(2014).
  16. He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
  17. León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
  18. Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
  19. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  20. Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
  21. Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  22. Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
  23. Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
  24. Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Akış Sitometrisi AnaliziCXCR5 BoyamaELISA Deneyiİmmünofloresan TespitLenf Nod İzolasyonuDalak Hücre SüspansiyonuVirüs İnokülasyon Protokolü
Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.