Yöntem makalesi

İnsan Nötrofil Swarming in vitro Kemotaktik ve Moleküler Analizi için Biyopartikül Mikrodizileri

DOI:

10.3791/60544

⸱

16 Şubat 2020

 , 
1William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, The Ohio State University, 2Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mekansal olarak kontrol edilen nötrofil sürüsü sağlayan biyopartikül mikrodizileri üretir. Nötrofillerin göç sırasında serbest bırakıldığı arabuluculara kolay erişim sağlar ve nicel görüntüleme analizine olanak sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofil sürüsü, nötrofillerin enfeksiyon bölgesini mühürlediği ve doku ların yeniden yapılandırıştırışını teşvik ettiği işbirliğine dayalı bir süreçtir. Swarming klasik hücre göç karakteristik desenleri gösteren hayvan modellerinde in vivo incelenmiştir. Ancak, in vivo modelleri erişim ve analiz zor hücreler arası arabulucuları da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar var, yanı sıra doğrudan insan nötrofiller analiz etmek için yetersizlik. Bu sınırlamalar nedeniyle, insan nötrofilleri ile dolu çalışmalar ve swarming sırasında üretilen moleküler sinyallere kolay erişim sağlayan bir in vitro platform için bir ihtiyaç vardır. Burada, çok aşamalı bir mikrodamgalama işlemi in vivo enfeksiyon taklit ederek sürü uyarır bir biyopartikül mikrodizi oluşturmak için kullanılır. Biyopartikül mikrodizi nötrofillerin kontrollü ve istikrarlı bir şekilde akın etmesini sağlar. Mikrodizide nötrofiller hızlarını arttırır ve biyopartikül kümelerinin etrafında kararlı sürüler oluştururlar. Ayrıca nötrofiller tarafından üretilen süpernatant analiz edildi ve 16 proteinin sürü boyunca farklı olarak ifade edildiği keşfedildi. Bu in vitro swarming platformu tekrarlanabilir, mekansal kontrollü bir şekilde nötrofil göçü ve protein salınımı doğrudan analizini kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofiller, kan dolaşımında en bol beyaz kan hücresi1, potansiyel tanı ve tedavi hedefleri olarak dikkat kazanıyor2,3 gut dahil olmak üzere tıbbi koşulların çeşitli dahil olabilir çünkü4, sepsis3, travma5,6, kanser1,7,8, ve çeşitli otoimmün hastalıklar5,9. Nötrofil sürüsü çok aşamalı, sıkı bir süreç çalışma5,10,11özellikle ilginç bir odak yapan bir karmaşıklık ile düzenlenmiştir. Swarming sırasında, nötrofiller çevreleyen sağlıklı doku5,10,11inflamasyon bir site izole . Nötrofil swarming uygun düzenleme yara iyileşmesi ve sonuçta inflamasyon çözünürlükteşviketmek esastır5 ,12. Nötrofil sürüsü öncelikle kemirgen12, 13,14,15 ve zebra balığı10,11,12,15 modellerinde in vivo incelenmiştir. Ancak, bu in vivo hayvan modellerinin doğası sınırlamalar doğuracak5. Örneğin, swarming sırasında nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları analiz5için kolayca erişilebilir değildir. Ayrıca, vivo belirli bir arabulucu için birçok potansiyel kaynaklar vardır, bu nedenle bir in vivo deney belirli bir süreç içinde bu arabulucu rolünü araştırmak için hücresel üretim ve / veya etkileşimi inhibe etmek için genetik bir eksiklik tanıtmak gerekir13. Bir in vitro deney ek hücreler bağlamı olmadan nötrofil gözlem sağlayarak bu komplikasyonu atlatır. Ayrıca, insan nötrofil koordine göç açıklayan araştırma sınırlıdır16. Bir in vitro swarming platformunda, insan nötrofiller doğrudan analiz edilebilir. In vitro swarming platformu in vivo çalışmaların sınırlamaları tarafından bırakılan boşlukları doldurmak için fırsatlar sağlayarak in vivo çalışmalardan elde edilen bilgi üzerine genişletebilir.

In vivo nötrofil sürüsünün imi olan bir in vitro platformihtiyacını gidermek için, nötrofil insidansını mekansal olarak kontrol edilen bir şekilde uyaran biyopartikül mikrodizimlerini desenlememizi sağlayan bir mikrodamgalama platformu geliştirdik. İki aşamalı bir süreçte cam slaytlarda biyopartikül mikrodizileri üretiyoruz. İlk olarak, katyonik polielektrolit (CP) noktalar bir mikrodizi oluşturmak için mikrodamgalama kullanın. İkinci olarak, elektrostatik etkileşim yoluyla CP noktalarına yapışan biyopartiküllerin bir çözeltisi ekliyoruz. Cp tabakasını ilk desenlendirerek, negatif yüklü biyopartikülleri istenilen nötrofil swarming deseni oluşturmak için seçici olarak desenleyebiliriz. Pozitif yüklü tabaka CP yok cam slayt alanlarından biyopartikülleri kaldırır güçlü yıkama adımı ile negatif yüklü biyopartiküller tutar. Ayrıca, CP burada kullanılan, akrilamid ve kuaternif katyonik monomer bir kopolimer, biyouyumlu, bu yüzden nötrofiller bir yanıt neden olmaz. Mikron büyüklüğündeki biyopartikülleri cam kaydırağa immobilize eden çok yüksek bir yüzey yüküne sahiptir, böylece nötrofillerin cam kaydıraktan parçacıkları çıkarmalarını engeller. Bu da mikrodizi halinde düzenlenmiş biyopartikül kümeleri ile sonuçlanır. Nötrofilleri mikrodiziye eklediğimizde, biyopartikül kümelerinin etrafında kararlı sürüler oluşturdular. Nötrofil göçlerini takip ederek, kalabalık nötrofillerin aktif olarak biyopartikül kümelerine doğru göç ettiğini bulduk. Ayrıca, bu platformu nötrofillerin sürü sırasında serbest bırakan bazı aracıları analiz etmek için kullandık. Swarming sırasında farklı bir şekilde ifade edilen 16 arabulucu bulduk. Konsantrasyonları zaman içinde üç genel eğilimleri takip: artış, azalma veya başak. İn vitro nötrofil swarming platformumuz, nötrofil swarming tarafından salınan arabulucuların toplanması ve analizinin yanı sıra mekansal olarak kontrol edilen insan nötrofil sürülerinin analizini de kolaylaştırır. Bir önceki yayında, belirli tıbbi durumları olan hastaların (travma, otoimmün hastalık ve sepsis) sağlıklı donörlerden farklı işlev gören nötrofiller olduğunu gösterdik5. Gelecekteki araştırmalarda, platformumuz çeşitli hasta popülasyonları arasında nötrofil fonksiyonunu analiz etmek için kullanılabilir. Bu platform nötrofil sürüsünde yer alan karmaşık koordinasyonu nicel olarak analiz edebilir. Ek çalışmalar belirli bir hasta popülasyonunun nötrofil fonksiyonu veya ilgi bir patojen nötrofil yanıt hakkında fikir sağlamak için yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, kanlarını bağışlayan sağlıklı gönüllüleri kabul ediyorlar. Kan örnekleri, Ohio State Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Komitesi tarafından incelenen kurumsal inceleme kurulu (IRB) protokolü #2018H0268ne göre gönüllü onayı alındıktan sonra elde edildi.

1. Biyopartikül mikrodizisinin mikroimalatı

  1. Standart fotolitografi prosedürleri kullanarak, ana silikon gofret oluşturmak.
    1. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak istediğiniz tasarımın bir kanıtı oluşturun, ardından krom fotomaske üretmek için bir fotomaske üreticisine gönderin. Burada kullanılan tasarım, 150 μm merkezden merkeze aralıklı daireler halinde doldurulmuş 30 μm çapındaki 4 mm x 4 mm dikdörtgen dizidir. Bu tasarım farklı uygulamalar için ististendiği şekilde değiştirilebilir.
    2. Spincoat bir silikon gofret üzerine negatif photoresist 40 μm kalınlığında tabaka. 65 °C'de 5 dk ve 95 °C'de 10 dk pişirin.
    3. 150-160 mJ/cm2 (Şekil 1A)ile krom fotokopi ile UV ışığına gofret maruz.
    4. 65 °C'de 5 dk ve 95 °C'de 10 dakika pişirin. Bu aşamada desen gofret üzerinde görünür olmalıdır (Şekil 1B).
  2. Iyice polidimethylsiloxane prepolimer ve kür ajan (yani, prepolimer 20 g ve kür ajanı 2 g) bir 10:1 oranı karıştırın ve bir Petri kabında ana gofret üzerinde unred polidimetilsiloksen (PDMS) karışımı dökün(Şekil 1C).
  3. Vakum ana gofret üzerinde hiçbir hava kabarcıkları mevcut olana kadar unred PDMS karışımı tedavi. Bir gecede 65 °C'de kür.
  4. Gofret desenli bölümünün dış çevresinde kesmek için bir neşter kullanın ve yavaş yavaş tedavi PDMS levha kaldırın. PDMS levhasını, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kesme tahtasıüzerine yerleştirin (Şekil 1D).
  5. 8 mm biyopsi zımba(Şekil 1E)ile PDMS levha bireysel pulları dışarı Punch . Bir cam slayt için sekiz pul gerekecektir.
  6. Herhangi bir enkaz kaldırmak için yapıştırıcı bant üzerinde her damga yüz aşağı yerleştirin.
  7. Önceden suda CP'nin 1,6 mg/mL çözeltisini hazırlayın.
    1. Cp tozunun uygun miktarını suya ekleyin (örn. 0,8 g ila 500 mL).
    2. Bir gece oda sıcaklığında bir karıştırma tabağı üzerinde karıştırın, ya da tüm katı suya çözülene kadar. CP çözeltisi oda sıcaklığında 6 ay saklanabilir.
    3. İstenirse, floresan izotiyosiyanat (PLL-FITC) ile etiketlenmiş poli-L-lizin ekleyerek CP çözeltisini floresan yapın.
      1. Cp çözeltisinin yaklaşık 10 mL'si Aliquot. Az miktarda PLL-FITC (0.05 mg) ekleyin. Miktar, floresan parlaklığını istediğiniz gibi ayarlamak için değiştirilebilir.
      2. Girdap 20 s için FITC ile etiketlenmiş CP çözüm, ya da çözüm düzgün, soluk sarı renk olana kadar. Işıktan koruyun ve 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
  8. Pullar yüz yüze yken, cp çözeltisinin 100 μL'lik 1.6 mg/mL çözeltisi ile her pulu asal, CP çözeltisi ile pul arasında hava kabarcıkları oluşmamasını sağlar(Şekil 1F).
  9. Pulları CP çözeltisinin bir katmanına ters çevirin (Şekil 1G).
  10. 1 saat sonra CP çözeltisinden pulları çıkarın.
  11. Dab her ıslak damga temiz bir cam slayt üzerine yüz aşağı 6-8x aşırı sıvı kaldırmak için.
  12. Vakum 1-2 dakika için pulları tedavi.
  13. Damga yerleştirme için bir kılavuz olarak temiz bir cam slayt üstüne sekiz kuyu, 9 mm çapında görüntüleme spacer yapıştırın. Bu boşlukta, her cam slayt sekiz mikrodizi olabilir.
  14. Görüntüleme boşluk larının her kuyunun ortasına bir pul yüz aşağı yerleştirin (yani, toplam sekiz pul kullanın).
  15. Her damganın üzerine 5,6 ± 0,1 g dengeli ağırlık yerleştirin ve damgalama için 10 dk bekleyin (Şekil 1H). Damganın cam kaydırağa eşit olarak basıldığından emin olmak ve CP'nin cam kaydırağa eşit şekilde aktarılmasını teşvik etmek için dengeli bir ağırlık gereklidir.
  16. Ağırlıkları ve pulları cam kaydıraktan çıkarın (Şekil 1I). Cp tabakasının 1.17 adımda açıklandığı gibi biyopartikülleri eklemeden önce 24 saat oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. CP FITC ile etiketlenirse, 1.17(Şekil 1M)adıma geçmeden önce damgalamanın etkinliği 488 nm'de floresan mikroskopla bu noktada kontrol edilebilir .
  17. Boş bir PDMS levhasını görüntüleme uzaylayıcısı boyutuna kesin ve 8 mm'lik biyopsi yumruğu kullanarak bir görüntüleme uzaylayıcısının kuyularıyla hizalanmış PDMS'lerde kuyular oluşturun. PDMS levhasını görüntüleme boşluklayıcısı ile cam slayta yapıştırın (Şekil 1J).
  18. Biyopartiküllerin çözeltisini (örn. E. coli veya zymosan) eritin ve enjeksiyon için suda 500 μg/mL'ye (WFI) seyreltin.
    NOT: Biyopartiküllerin opsonize edilmesine gerek yoktur. Nötrofil yüzey reseptörleri doğrudan bu biyopartiküller19,20,21molekülleri tanımak .
  19. Cam kaydıraiyi iyi her PDMS için biyopartikül çözeltisi 100 μL ekleyin (Şekil 1K).
  20. 30 dakika boyunca cam slayt rock.
  21. Kuyuları suyla iyice durulayın. Biyopartikül mikrodizi, 4 °C'de tozsuz bir ortamda 3 aya kadar saklanabilir. Bu noktada desen, adım 2.1'e geçmeden önce 594 nm'de floresan mikroskopla kontrol edilmelidir(Şekil 1N).

2. Örnek Hazırlama

  1. İstenilen donörden K2-EDTA tüplerinde en az 2 mL taze kan alın. Nötrofillerin beklenen verimi 1-2 x 106 hücre/1 mL tam kandır. Görüntüleme tahlil yaklaşık 1.5 x 105 nötrofil gerektirir ve supernatant analizi 1 x 106 nötrofil gerektirir. Kanı 4 saat içinde kullan.
  2. Ayrı kırmızı kan hücreleri (RBC) tüm kan için 1:5 oranında bir eritrosit agregasyon ajan ekleyerek. Yarı saydam bir tabaka (buffy coat) için 45 dk bekleyin RBC'lerin katmanından ayrı.
  3. 1 mL buffy kat: 9 mL PBS kullanarak buffy kat çıkarın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  4. 190 x g ve 20 °C'de 5 dk santrifüj.
  5. Supernatant aspire ve 5 x 107 hücreleri / mL pelet resuspend.
  6. Nötrofilleri izole etmek için negatif immünomanyetik seçim kiti kullanın.
    1. 50 μL antikor kokteyli/1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. 10 dk bekleyin.
    2. 100 μL manyetik boncuk/1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. 10 dk bekleyin.
    3. Yuvarlak bir alt tüp ve silindirik mıknatıs yer hücre süspansiyon ekleyin. 10 dk bekleyin.
  7. Bir santrifüj tüp içine supernatant dökün. 10 mL'ye kadar PBS ekleyin. 190 x g ve 20 °C'de 5 dk santrifüj.
  8. Aspire süpernatant. IMDM'de %0.4 insan serum albumini ile beyaz peleti yeniden askıya alın.
  9. 37 °C'de 10 dakika boyunca 20 g/mL Hoechst 33342 ile leke çekirdekleri.
  10. Durulama için % 0.4 insan serum albumini ile 5 mL IMDM ekleyin. 190 x g ve 20 °C'de 5 dk santrifüj.
  11. IMDM'de 7.5 x 105 hücre/mL'deki hücreleri %0.4 insan serum albumini ile yeniden askıya alın.
  12. Bir biyopartikül mikrodizi içeren bir PDMS kuyuya hücre süspansiyon100 μL ekleyin. Hücre süspansiyonunun PDMS'nin üst kısmında ki konveks olduğundan ve herhangi bir kabarcık içermediğinden emin olun.
  13. 12 mm çapında kapaklı sızdırmazlık. PDMS'nin açılmasını 12 mm çapında kapak kaymaile iyice kapatın. Aşırı hücre süspansiyonkuyu kenarına kaçar böylece cımbız ile coverslip üzerine yavaşça bastırın. Aşırı hücre süspansiyon kaldırmak için bir doku kullanın.

3. Tahlil ve görüntü analizinin çalıştırıl

  1. Mikropartikül dizisini canlı hücre görüntüleme istasyonundaki hücrelerle 37 °C, %5 CO2ve %90 bağıl neme ayarlanmış bir kafes kuluçka makinesi ile donatılmış bir mikroskopla yükleyin.
  2. 405 nm, 594 nm ve brightfield'da her 10 s'de 10'luk büyütmede görüntüleri kaydetmek için hızlandırılmış floresan ve parlak alan mikroskobu kullanın. Tipik bir deneyde, görüntüler en fazla 2 saat toplanır.
  3. Tek tek nötrofillerin biyopartikül kümesine geçişini izlemek için otomatik bir hücre izleme yazılımı kullanın.
    1. Nokta algılama hücresi izleme yazılımının otomatik regresyon modunu kullanın. Nokta yarıçapını 5 μm'ye (nötrofil çekirdeğinin yaklaşık boyutu) ayarlayın. Minimum parça uzunluğunu 120 s'ye ve bir karenin maksimum boşluk boyutunu ayarlayın.
    2. Hücre izleme yazılımı tarafından oluşturulan verilerden nötrofil konumu ve hızını içeren dosyaları ayıklayın. Bu dosyalar nötrofil geçiş parçaları(Şekil 2C)ve hız ve zaman(Şekil 2D)bir ısı haritası oluşturmak için bir grafik yazılımı ile kullanılabilir.
  4. Seçtiğiniz bir görüntü analizi yazılımı nda sürü boyutunu zaman içinde izlemek için 405 nm floresan görüntüleri kullanın.
    1. Nötrofillerin akın edeceği her biyopartikül kümesinin etrafındaki ilgi bölgelerini (ROI) tanımlayın. Her biyopartikül kümesini analiz etmek için aynı boyutta yatırım getirisi tutun.
    2. Zaman içinde her yatırım getirisi içindeki 405 nm görüntülerin ortalama floresan yoğunluğunu analiz edin.
    3. 0 μm2'den maksimum sürü boyutuna kadar çeşitli sürü boyutlarında manuel ölçümler yaparak ortalama floresan şiddetinin sürü boyutuna doğru bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Zaman içinde sürü boyutunu hesaplamak için bu kalibrasyonu kullanın.

4. Supernatant toplama ve protein algılama

  1. Biyopartikül mikrodizisini içeren kuyularda nötrofilleri 37 °C ve %5 CO2'de 3 saat kuluçkaya yatırın. İstenilen zaman noktalarından numune alın. Tipik olarak, numuneler 0, 0,5, 1 ve 3 saat olarak alınır. Protein dizisi tsay algılama sınırını aşmak için, tek bir kuyunun (200 μL) süpernatant ının tüm hacmi her zaman noktası için kullanılmıştır. Her zaman noktası triplicate olarak analiz edildi.
  2. Parlak alan mikroskobu kullanarak, sürülerin mikrodizi üzerinde oluştuğunu doğrulayın.
  3. Supernatant'ı 200 μL pipetle aspire edin ve 0,45 m'lik santrifüj filtre tüpüne yükleyin.
  4. Supernatant'ı 190 x g ve 20 °C'de 5 dk'lık santrifüj edin ve filtrasyon hacmini toplayın.
  5. Numuneleri işleme süresine kadar -80 °C'de saklayın.
  6. Örnekleri işlemek için çeşitli insan proteinlerini algılayan bir mikrodizi kiti kullanın.
    1. Kit ile birlikte verilen ayrı bir diyaliz tüpüne her numuneden 200 μL ekleyin.
    2. Diyaliz tüplerini en az 500 mL PBS içeren bir kabın içine yerleştirin (pH = 8.0). 4 °C'de en az 3 saat karıştırın. Kabın içinde PBS'yi değiştirin ve bu adımı tekrarlayın.
    3. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 5 dakika için 9.000 x g temiz bir santrifüj tüp ve santrifüj her örnek aktarın. Her supernatant'ı temiz bir tüpe aktarın.
    4. Her numuneyi, diyaliz numunesindeki toplam proteinin 1 mg'ı başına 36 μL 1x etiketleme reaktifi ekleyerek 180 μL'lik diyaliz numunesine biyotinylate edin. 20 °C'de 30 dk. Her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
    5. Her numune tüpüne kit ile birlikte sağlanan 3 μL stop çözeltisi ekleyin. Her numuneyi taze bir diyaliz tüpüne aktarın ve 4.6.2-4.6.3 adımlarını tekrarlayın. Bu aşamada, numune siz devam etmeye hazır olana kadar -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir.
    6. Kit ile sağlanan cam kaydırak -20 °C'de saklanır. Oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Monte edilmiş cam kaydırağı oda sıcaklığında 1-2 saat laminar akış kaputuna yerleştirin.
    7. Kit ile birlikte sağlanan engelleme tamponunun 400 μL'sini monte edilmiş cam kaydıraktan her bir kuyuya ekleyin. 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    8. Presipitatları veya partikülleri temizlemek için hazırlanan numuneleri 9.000 x g'de 5 dk santrifüj edin. Engelleme tamponu ile 5x seyreltin.
    9. Engelleme arabelleği her kuyudan kaldırın. Seyreltilmiş numunelerin 400 μL'sini uygun kuyulara ekleyin. Sallarken oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
    10. Her kuyudan alınan örnekleri decant. 3x'i 800 μL'lik 1x yıkama tamponu ile yıkayın oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her biri sallarken kit ile birlikte sağladım.
    11. Temiz bir kapta, 1x yıkama tampon I. Yıkama 2x oda sıcaklığında 5 dakika her sallanan sırasında 2x yıkama monte cam slayt batırın.
    12. Her alt diziye 400 μL 1x Cy3 konjuge streptavidin ekleyin. Plastik yapışkan şeritler ile kaplayın. Protokolün geri kalanı için ışıktan koruyun.
    13. Sallarken oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
    14. Çözeltiyi decant ve cam slaytı numune odalarından sökün.
    15. Kiti ile sağlanan 30 mL santrifüj tüp, dikkatle cam slayt ve yeterli 1x yıkama tampon i cam slayt kapsayacak şekilde ekleyin. Sallarken oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3x yıkayın.
    16. 30 mL santrifüj tüpte, sallarken oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca 1x yıkama tamponi II ile 2x yıkayın.
    17. Cam kaydırağı 5 dk ddH2O 30 mL ile yıkayın. Hazırlanan cam kaydırak titreyene kadar -20 °C'de saklanabilir.
    18. 555 nm'lik floresan emisyonda cam kaydırağı mikrodizi tarayıcısıyla tarayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofiller biyopartikül mikrodizilerine eklendiğinde, biyopartikül kümelerine temas eden nötrofiller aktive olur ve sürü tepkisini başlatır. Biyopartikül mikrodizi, nötrofil infüzyonu izlemek için zaman atlamalı floresan mikroskobik kullanılarak doğrulandı (Video S1). Nötrofil çekirdeklerinin göçü, biyopartikül kümesine doğru göç ederken izlenir. Nötrofiller biyopartikül kümesine ulaştıklarında çekirdekleri kümedeki diğer çekirdeklerle örtüşmektedir. Bu nedenle, bu yöntemi kullanarak küme içinde bir nöt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro nötrofil sürüsünün uyarması için tek tip biyopartikül dizileri oluşturmak için bir mikro damgalama platformu geliştirdik. Platformumuzun in vitro doğası bize in vivo swarming deneyler, yani swarming nötrofiller tarafından yayımlanan arabulucuları analiz etmek için kötü yeteneği ile ortaya çıkan komplikasyonlar atlatmak için izin verir5. Ayrıca, in vivo modelleri genellikle kemirgenler11,12,13

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma William G. Lowrie Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü ve Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin finansmanı ile desteklenmiştir. Bu raporda sunulan veriler, Ohio State Üniversitesi Kampüs Mikroskobu ve Görüntüleme Tesisi'nde bulunan Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) kullanılarak işlenen görüntülerden elde edilmiştir. Bu tesis kısmen P30 CA016058, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
"Büyük Kolay" EasySep MıknatısSTEMCELL Technologies18001Nötrofil izolasyon kiti ile kullanılacak mıknatıs
Hücre İnkübatörüOkolab777057437 / 77057343Sıcaklık ve CO2 kontrolü için Okolab kafesli inkübatör
EasySep İnsan Nötrofil İzolasyon KitiSTEMCELL Technologies17957İnsan nötrofillerinin
Eclipse Ti2Nikon InstrumentsMEA54010 / MEF55037Ters araştırma mikroskobu
Escherichia coli (K-12 suşu) BioParticles Texas Red konjugeInvitrogenE2863Biyopartikül tozu, Zetag & reg dizisine eklenmeden önce suda çözülür
Harris Uni-Core 8 mm biyopsi zımbasıSigma AldrichZ708925PDMS damgalarını kesmek için
HetaSepSTEMCELL Teknolojileri7906Taze insan kanındaki buffy coat kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için eritrosit agregasyon ajanı
Hoechst 33342Yaşam TeknolojileriH3570Çekirdek floresan lekesi
İnsan L1000 ArrayRaybiotech Inc.AAH-BLG-1000-41000 insan proteinini tespit etmek için yüksek yoğunluklu dizi
İnsan Serumu Albümini (HSA)Sigma AldrichA5843Düşük endotoksin HSA, izole nötrofiller için IMDM'de% 2 çözelti hazırlamak için
Iscove'un Modifiye Dulbeccos' Ortamı (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053İzole nötrofiller
K2-EDTA tüpleriniThermo Fisher Scientific02-657-32Kan alma tüpleri
Düşük Yansıtıcı Krom Fotoğraf MaskesiÖn Aralık Fotoğraf MaskesiN/ABoyutlar 5" x 5" x 0.09" (U x G x D)
Mikrodizi TarayıcıPerkin ElmerASCNGX00Protein desenli mikro alanların floresan okuyucusu
Mikroskopi Görüntü Analizi Yazılımı - ImarisBitplane9.3.0Otomatik hücre izleme analizi
için yazılımNiS Elements Gelişmiş Araştırma Yazılım Paketicanlı hücre görüntüleme ve sürü boyutu hesaplaması içinNikon InstrumentsMQS31100
Poli-L-lizin floresein izotiyosiyanat (PLL-FITC)Sigma AldrichP3069-10MG30.000 - 70.000 MW PLL, CP çözümünü floresan olarak etiketlemek için kullanılan FITC ile etiketlenmiş
SecureSeal 8 Kuyulu Görüntüleme Ara ParçasıGrace Bio-Labs 6540088 kuyulu, 9 mm çaplı, yapışkanlı görüntüleme ara parçası
Silikon GofretÜniversite Gofret590Silikon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 μ m SSP testi
Spin KaplayıcıLaurellWS-650MZ-23NPPB40-µ spincoat için kullanılır; silikon gofret
SU-8 2025MicroChem2025Negatif fotorezist silikon ana gofret
SU-8 GeliştiriciMicroChemY020100Photoresist geliştirici üzerine m katmanı. Çapraz bağlı olmayan SU-8 2025'i silikon gofretten çıkarın
Sylgard 184 (polidimetilsiloksan, PDMS)Dow1673921Mikro damgalar ve PDMS kuyuları yapmak için 2 parçalı silikon elastomer kiti
UV Maruz Kalma Maskeleme SistemiKloéUV-KUB 2UV ışığı ile krom maske aracılığıyla silikon gofret üzerindeki fotorezisti çapraz bağlamak için kullanılır
SuThermo Fisher ScientificA1287303Biyopartikülleri seyreltmek için yüksek kaliteli su
Zetag 8185BASF8185Katyonik polielektrolit (CP), toz, akrilamid ve kuaternize katyonik monomer kopolimeri, suda
çözündüğünde mikro damgalama için "mürekkep çözeltisi" oluştururZymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red konjugeInvitrogenZ2843Biyopartikül tozu, Zetag dizisine eklenmeden önce suda çözünür
immünomanyetik negatif seçimi için kit yeniden süspanse etmek için Otomatik Yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
  2. Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
  3. Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
  4. Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
  5. Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
  6. Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
  7. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
  8. Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
  9. Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
  10. Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
  11. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  12. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  13. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  15. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  16. Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
  17. Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
  18. Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
  19. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
  20. Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
  21. Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
  22. Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
  23. Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
  24. Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
  25. Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
  26. Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
  27. Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
  28. Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyopartik l Mikro DizisiKemotaktik Analiznsan N trofillerin Vitro AnalizSitokin Sal n mLipid Mediyat rlerZaman Atlamal MikroskopiFloresan Mikroskopi

İlgili makaleler