Salmonella Enfekte Doku Kültür Hücrelerinde NF-κB bağımlı Luciferase Aktivasyonu ve Gen Ekspresyonunun Nicelleştirilmesi

Özet

Burada, nf-κB::luciferase reporter constructs,hücre lysate parlaklık ölçümleri yoluyla, hücre hatlarında aktif B hücrelerinin (NF-κB) aktivasyonunun nükleer faktör kappa-ışık-zincir arttırıcısını hızlı ve kolay bir şekilde ölçmek için bir protokol saklıyız. Ayrıca, gen ekspresyonu Salmonella Typhimurium ile enfekte hücrelerden izole RT-qPCR ile belirlenir.

Özet

Dimerik transkripsiyon faktörü NF-κB çeşitli sitokinler ve kemokinler ifade indükleyerek inflamatuar yollar da dahil olmak üzere birçok hücresel yanıt yollarını düzenler. NF-κB konstitutively ifade edilir ve B hücreleri inhibitörü kappa ışık polipeptid gen arttırıcı inhibitör protein nükleer faktör tarafından sitosol içinde sekestre edilir, alfa (IκBα). NF-κB'nin aktivasyonu, IκBα'nın bozulmasını gerektirir, bu da NF-κB'de nükleer bir lokalizasyon sinyalini ortaya çıkarır ve çekirdeğin ticaretini teşvik eder. Çekirdekte nf-κB, ininterlökin 6 (IL-6) ve IL-23 gibi nf-κB hedef genlerinin promotor bölgesine bağlanır ve ekspresyonların dışavurumlarını destekler.

NF-κB'nin aktivasyonu transkripsiyon veya çeviriden bağımsız olarak gerçekleşir. Bu nedenle, NF-κB'nin aktivasyon durumu, nf-κB'nin özellikle çekirdekteki sayısallaştırılması veya NF-κB hedef genlerinin ifadelerinin ölçülmesi ile ölçülmelidir. Bu protokolde, nf-κB ile transfeced hücreler::luciferase muhabir yapısı in vitro doku kültürü teknikleri kullanılarak NF-κB aktivasyonu için test edilir. Bu hücreler Salmonella Typhimurium ile enfekte nf-κB etkinleştirmek için, hangi çekirdeğe trafik ve luciferase organizatörü bölgede κB sitelerine bağlanır, ifadesini indükleyen. Hücreler lysed ve luciferase test sistemi ile analiz edilir. Hücreler tarafından üretilen luciferase miktarı bir plaka okuyucu tarafından algılanan lüminesans sinyalinin yoğunluğu ile ilişkilidir. Bu yordam tarafından oluşturulan Parlaklık sinyali, NF-κB aktivasyonunu çeşitli koşullar altında değerlendirmek için hızlı ve son derece hassas bir yöntem sağlar. Bu protokol aynı zamanda gen ekspresyonunun göstergesi olan bağıl mRNA düzeylerini saptamak için kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) kullanır.

Giriş

Nükleer faktör-κB (NF-κB) protein ailesi, çeşitli biyolojik yollarda gen ekspresyonunu düzenleyen önemli transkripsiyon aktivatörleridir. NF-κB aktivasyonu hedef genlerin transkripsiyon indükler, birçoğu bağışıklık ve inflamatuar yanıtlar için önemlidir, hücre çoğalması, stres yanıtları ve kanser ilerlemesi^1,2. NF-κB patojen temizliği için erken inflamatuar sonuçlar aracılık ayrılmaz bir rol oynar. NF-κB aktivasyonunun aracılık ettiği birçok biyolojik süreç göz önüne alındığında, sinyalizasyonundaki aksaklıklar sağlık ve hastalık açısından ciddi sonuçlar doğurabilir. NF-κB sinyalizasyonunda fonksiyon mutasyonlarının kaybı çeşitli immün yetmezlik fenotiplerinde ilişkilidir, fonksiyon mutasyonlarının kazanımı ise B hücreli lenfomalar ve meme kanserleri de dahil olmak üzere çeşitli kanser türleri ile ilişkilidir³. Ayrıca, birçok patojenler doğrudan virülans^{faktörlerinin}ekspresyonu ile NF-κB aktivasyon durumunu modüle gösterilmiştir 4^,5,6,7.

NF-κB aktivasyonu, patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP) olarak bilinen lipopolisakkaritler (LPS), flagellin ve peptidoglikanlar gibi bakteriyel ürünler de dahil olmak üzere birçok değişken uyaranların bir sonucu olarak bilinmektedir. Bu PAMP'ler, NF-κB aktivasyonuna ve NF-κB'ye bağlı inflamatuar genlerin bir dizi sinin sonraki ekspresyonuna yol açan Toll benzeri reseptörler (TLR) ve Nod benzeri reseptörler (NLR) gibi patern tanıma reseptörleri (PrR' ler) tarafından tespit edilir⁸. PAMP'ler tarafından PRR aktivasyonuna ek olarak, bakteriyel efektör proteinler gibi diğer bakteriyel ürünler NF-κB aktivasyonuna neden olabilir. İlginçtir, bakteriler de aktif NF-κB yolu zayıflatmak ve patojenik geliştirmek etkileyici proteinlerifade, bağışıklık önemli bir aracı olarak NF-κB önemini vurgulayan⁹.

NF-κB dimer'lerini oluşturan beş farklı alt birim vardır; p50, p52, RelA (p65), RelB ve cRel. İki ana NF-κB heterodimerp50:RelA ve p52:RelB dimers vardır. Aktif NF-κB dimers ÇEŞITLI hedef genlerin organizatörü ve arttırıcı bölgelerde, κB siteleri olarak bilinen DNA sitelerine bağlanır. Normal homeostatik koşullar altında, NF-κB inhibisyon proteinleri olarak bilinen bir aile ile etkileşime girebilmekte olup inaktif kalır. Uyarılma üzerine, IκB IκB Kinase (IKK) tarafından fosforile edilir, hangi her yerde hedeflenmesağlar, ve daha sonra bozulma. IκB'nin bozulması, nükleer bir lokalizasyon sinyali ortaya çıkararak NF-κB'yi harekete geçirir. NF-κB daha sonra çekirdeğe aktarır ve burada hedef genlerin promotör bölgesindeki κB sitelerini bağlar ve transkripsiyon^10'uteşvik eder. Böylece NF-κB'nin aktivasyonu NF-κB hedef genlerinin mRNA ekspresyonunu düzenler ve bu değişiklik RT-qPCR¹¹gibi RNA niceleme leri ile ölçülebilir.

Elektroforetik hareketlilik kayması tahlilleri (EMSA), nükleer translokasyon ve gen muhabiri tahlilleri de dahil olmak üzere NF-κB aktivasyonunun ölçümü için yaygın olarak kullanılan çeşitli yöntemler vardır. EMSA nükleik asitler ile protein kompleksleri tespit etmek için kullanılır. Uyarılmış hücreler nükleer proteinleri izole etmek için fraksiyona alınırlar, transreretik NF-κB de dahil olmak üzere, daha sonra NF-κB bağlayıcı etki alanını içeren radyoetiketli nükleotitlerle kuluçkaya yatırılır. Örnekler bir jel üzerinde çalıştırılır ve ³²P etiketli nükleik asit otoradyografi ile görüntülenir. Protein fraksiyonunda NF-κB mevcutsa, jel den daha yavaş göç edecek ve ayrıbantlar halinde mevcut olan nükleotitleri bağlar. Aktif NF-κB'den yoksun hücrelerin nükleer fraksiyonları (örneğin, uyarılmamış kontrol hücreleri) nükleotitler jelin ucuna daha hızlı göç ettikçe hiçbir bant üretmez. Bu yöntemin önemli bir dezavantajı, ikili anlamda büyük ölçüde nicel olmasıdır (yani, açık veya kapalı) ve NF-κB bağlama kapasitesinde anlamlı farklılıkları yeterince yakalayamamaktır. Ayrıca, bu yöntem fonksiyonel NF-κB hedef genler için önemli olan kromatin yapıları dikkate almaz^12,13.

Önceki yönteme benzer şekilde, çok kuyulu plakaların NF-κB bağlama dizisini içeren nükleotitlerle kaplandığı bir "kaymaz" töz vardır. Proteinlerin nükleer fraksiyonları ile hücrelerin tedavisisonrasında, NF-κB kuyuya bağlı nükleotitlere bağlanır. Daha sonra anti-NF-κB antikorları eklenir, bu da bağlı NF-κB ile etkileşime girerek NF-κB miktarıyla orantılı olarak nf-κB aktivasyon derecesini gösteren kolorimetrik bir sinyal üretir. Bu yöntem, radyoetiketli nükleik asitler gerektirmemesi ve karşılaştırmaaçısından nicel olması nedeniyle EMSA'ya göre avantajlıdır. Ancak, bu yöntemin bir uyarı yine NF-κB hedef genlerin kromatin durumları arasında ayrım yapmaz¹⁴.

NF-κB aktivasyonunun saptabildiği bir diğer yöntem de kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) ile, DNA ve etkileşen proteinler formaldehit ile çapraz bağlanır ve spesifik anti-NF-κB antikorları ile immünopsipatatedilir. Belirli nükleotid parçaları daha sonra saflaştırılır ve PCR amplifikasyon veya doğrudan yüksek iş elde etme sıralaması ile tanımlanır. Bu yöntemden elde edilen sonuçlar, NF-κB bağlama aktivitesinin hedef genlerle yarı kantitatif sonuçlarını sağlar. Ancak, sonuçlar son derece her^adım15de fiksasyon koşulları ve arıtma işlemleri bağlıdır.

Nükleer translokasyon tahlillerinde hücreler NF-κB aktivasyonunu tetiklemek için uyarılır ve sonra sabitlenir. Sabit hücrelere anti-p65 antikorları eklenir. Alternatif olarak, p65 alt biriminin kendisi yeşil floresan yeşil (GFP) gibi floresan peptid ile etiketlenebilir. Her iki durumda da, immünofluorescence hücresel dağılımı belirlemek için p65 lokalizasyonu görüntüleme sağlayacaktır. Araştırmacılar, sitosolik ve nükleer lokalize protein oranını ölçerek NF-κB'nin göreli aktivasyon durumunu belirleyebilirler. Bu yöntemin bir dezavantajı immünfloresans nispeten zaman alıcı olmasıdır, pahalı antikorlar gerektirir, ve nispeten daha fazla teknik uzmanlık ihtiyacı¹⁶.

Muhabir genler, ilgi çeken bir genin düzenleyici ve ifade kalıplarını incelemek için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Tipik olarak, muhabir genler kolayca tespit edilebilir bir protein için kodlayan bir gen erimiş ilgi geninin promotör dizisinden inşa edilmiştir. Enzimatik aktiviteler, floresan veya lüminesans özellikleri olan proteinler genellikle analiz ve nicel yetenekleri için seçilir. Böylece, okuma (örneğin, parlaklık, floresan) gen ekspresyonunun saptanması için bir sinyal görevi göremez. Bu muhabir yapıları daha sonra epitel hücreleri veya makrofajlar gibi farklı hücre türlerine tanıtılabilir.

Protokolde açıklanan bir klonlanmış HeLa hücre hattı kullanımı (HeLa 57A) bir luciferase muhabiri ile immünglobulin κ-chain promoter bölge κB konsensüs üç kopyasını içeren bir transfected¹⁷. Luciferase ekspresyonu hücre stimülasyonu sonrasında ortaya çıkan NF-κB aktivasyonuna bağlıdır. Uyarılmış hücreler luciferase tsay kitinde sağlanan hücre lisis tamponu kullanılarak kolayca lysed edilir. Hücre lisate bir kısmı daha sonra luciferin içeren luciferase tsay tampon ile karıştırılır. Luciferin luciferase substrat ve luciferase varlığında ışık üretimi için gereklidir. Israr tamponu ile lysate birleştirdikten sonra, çözüm Lüminesans olarak bilinen bir süreçte ışık yayar. Lümenlerde üretilen ışık miktarı, lysate'de bulunan luciferase miktarı ile orantılıdır ve NF-κB aktivasyonunun bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Lümen okumaları, temel NF-κB aktivitesini hesaba katmak için uyarılmamış bir standarda göre yorumlanır ve sinyalin kendisi güvenilir ölçüm için birkaç dakika stabildir. Buna ek olarak, HeLa 57A hücre hattı stfecably bir NF-κB-bağımsız β-galactosidaz muhabiri ile transfected. Β-galaktosidaz muhabiri kurucu olarak ifade edilir ve β-galaktosidaz aktivitesi hücre canlılığını veya hücre sayılarında değişimi kontrol etmek için ölçülebilir¹⁷. Luciferase değerleri daha sonra β-galaktosidaz değerlerine ayarlanabilir ve uyarılmamış kontrol hücreleri üzerinde kat artış olarak rapor edilebilir.

NF-κB, NF-κB bağımlı hedef genlerin artan ekspresyonundan sorumlu bir transkripsiyon faktörü olduğundan, NF-κB bağımlı artmış gen ekspresyonunu kontrol etmek için yapılan bir takip deneyi nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonudur ( RT-qPCR). RT-qPCR, gen ekspresyonundaki değişikliklerin çeşitli büyüklük sıraları üzerinden ölçülebildiği son derece hassas bir yöntemdir. Uyarılmış ve kontrol hücreleri fenol-kloroform ekstraksiyon u yoluyla RNA için hasat edilir. Faz ayrımından sonra, RNA sulu tabakanın ana bileşeni olarak ayıklanır. RNA daha sonra çökeltilir ve saf pelet üretmek için yıkanır. Bu pelet daha sonra yeniden yapılır ve DNase tedavisi ile kirletici DNA'dan daha fazla temizlenir. Saf RNA sonra tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturmak için transkripsiyonu ters yazılır. Bu cDNA daha sonra belirli bir mRNA dizisinin bolluğunun gen ekspresyonunu belirlemek için ölçüldüğü nicel PCR teknikleri ile analiz edilebilir. Bu teknik çevirisel kontrolü, çeviri sonrası modifikasyonu, protein bolluğunu veya protein aktivitesini açıklamaz. Ancak, birçok gen, özellikle pro-inflamatuar süreçlerde yer alanlar, NF-κB ile düzenlenir ve mRNA bolluğu onların ifadelerinin göstergesidir.

Burada önerilen yöntem, NF-κB aktivasyonunun hücresel lysate'nin lüminesans tahlilleri ile saptanabileceği hızlı ve basit bir yöntem kullanır. NF-κB hedef gen ekspresyonunun RT-qPCR'ı belirli genlerin ekspresyonunu ölçmek ve NF-κB aktivasyonunun fonksiyonel aktivitesini doğrulamak için kullanılabilir. Böyle bir sistemin en büyük avantajları, NF-κB aktivasyonunu modüle eden bir dizi koşulun yüksek iş gücü taramasına olanak tanıyan sadeliği ve hızıdır. Bu protokol bir NF-κB ifade diğer hücre hatları için uygundur::luciferase muhabiri, ve stable transfected RAW264.7 hücreleri¹⁸gösterilmiştir . Hücre lisisinden itibaren bir lüminesans sinyali oluşturmaya kadar numuneleri işlemek için gereken süre çok azdır ve yaklaşık bir saatlik bir zaman dilimini alır. NF-κB ölçümü sadece opak plakalar, parlaklığı ölçebilen bir plaka okuyucu ve elektronik tablo programı gibi basit veri analizi yazılımları gibi temel laboratuvar ekipmanı gerektirir.

Protokol

1. Hücre Geçişi ve Tohumlama

1. Dulbecco'nun modifiye Kartal medyasının (DMEM) 10 mL'sini içeren 75 cm^2'lik bir şişedeki HeLa 57A hücrelerini %5 CO₂ kuluçka makinesinde 37 °C'de %5 ısı inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenince koruyun.
2. Aspire hücre kültürü ortam ve yıkama 1 mL 0.05% tripsin-EDTA çözeltisi. Tripsin ini aspire edin ve ek 1 mL ile değiştirin. Hücrelerin şişeden ayrılmasını sağlamak için şişeyi 37 °C'lik bir kuluçka makinesine 4-5 dakika yerleştirin.
3. Hücre kültürü ortamının 9 mL'sini ekleyin ve hücreleri yerinden çıkarmak ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için şişenin altını birkaç kez hafifçe yıkayın.
4. Seyreltin HeLa 57A hücreleri 1:6 veya 1:8 taze medya ve tohum yeni şişeler içine. Geçiş hücreleri % 90'ı konfluent olduğunda veya her üç günde bir hücreleri en az %25 birarada tutarlar.
5. Hücre stimülasyonundan bir gün önce HeLa 57A hücrelerini deneyin ve 10 mL büyüme ortamında askıya alın. Hemositometre kullanarak askıdaki hücreleri sayın ve hücreleri 50 mL konik tüpte 2,5 x 10⁵ hücre/mL'lik son konsantrasyona seyreltmek için büyüme ortamını kullanın.
6. 250 μL hücre süspansiyonu (~6,25 x 10⁴ hücre) 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya aktarın. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için konik tüpü periyodik olarak kapatın ve ters çevirin. Hücrelerin kuyularda düzgün bir şekilde dağdığından emin olmak için plakaya yan tarafta hafifçe dokunun.
7. Plakayı %5 CO₂ kuluçka makinesinde 37 °C'ye aktarın ve hücrelerin bir gecede bağlanmasını ve büyümesini bekleyin.

2. Bakterilerin Hazırlanması

1. Enfeksiyondan iki gün önce, tek koloniler üretmek için LB agar plakaları üzerine Salmonella serisi dondurulmuş stokları. Plakaları 37 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine aktarın ve bir gecede büyümeye izin verin.
2. Enfeksiyondan bir gün önce steril bakteri kültür tüplerine 3 mL likit et suyu (LB) ekleyin ve ortama uygun antibiyotikleri ekleyin.
3. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, çizgili bakteri kültürlerinden tek bir koloni seçin ve lb ortama döngü dokunun. Aşı yaptıktan sonra tüpleri kaplayın ve döngüyü atın.
4. Tüpleri 37 °C, 180 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesine yerleştirin ve bir gecede büyümesini bekleyin.
5. Enfeksiyon günü, kuvözden bir gecede bakteri kültürlerini alın.
6. Uygun olduğunda antibiyotik içeren 3 mL taze LB ekleyerek alt kültür için tüpler hazırlayın.
7. Bir gecede bakteri kültürünün 30 μL'sini (100'de 1 seyreltme) yeni hazırlanmış ortama aktarın. Tüpleri 37 °C'de 3 saat boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.
8. 3 saat kuluçkadan sonra, 1 mL steril LB suyu plastik bir cuvette içine boş olarak hizmet vermek için aktarın. Numune analizi için kullanılacak diğer cuvettelere 900 μL LB aktarın.
9. 100 μL bakteriyel alt kültürü 900 μL LB ve pipet içeren bir cuvette birkaç kez karıştırmak için aktarın. Her bakteriyel süspansiyon için bunu tekrarlayın.
10. 600 nm (OD₆₀₀₎dalga boyunda bakteri kültürlerinin optik yoğunluğunu (OD) ölçmek için spektrofotometreyi açın.
11. Boşluğu spektrofotometreye yerleştirin. Oryantasyona dikkat edin, çünkü bu tür bir işaret gösteren en üste doğru bir işaret olmalıdır.
12. Kapağı kapatın ve arka plan absorbansını elde etmek için spektrofotometredeki Boş düğmesine basın.
13. Boş cuvette'yi aynı oryantasyonda bir örnek cuvette ile değiştirin ve Okutuşuna basın.
14. Bu örneklerin OD₆₀₀ değerlerini kaydedin. Seyreltme faktörlerini hesaba katmak için değeri 10 ile çarpın.
15. Kabaca 1 x 10⁹ cfu/mL'ye karşılık gelen yaklaşık 1,0 emici değer elde etmek için bakteriyel alt kültürü taze LB ile seyreltin. Bir cuvette bu süspansiyon 1:10 seyreltin ve absorbans ölçmek - ~ 0.1 bir değer vermelidir.
16. Yeni bir tüpte, seyreltilmiş alt kültürün uygun bir hacmini taze LB'ye ekleyerek inokül olarak kullanılmak üzere 1 x 10⁸ cfu/mL süspansiyon elde edin.
17. Yaklaşık 10² cfu/mL son seyreltme yapılana kadar 450 μL steril PBS (10 kat seyreltme) içeren bir tüpe 50 μL bakteriyel süspansiyon aktararak inokülseri seyreltme hazırlayın.
18. En düşük iki seyreltmenin 100 μL'sini (sırasıyla 10 ve 100 koloni şekillendirme ünitesine^karşılık gelen 10 00 000) lb agar plakasına aktarın ve tek kolonielde etmek için süspansiyonu bir hücre dağıtıcısı ile yayın. Bu plakaları 37 °C'lik bir kuluçka makinesine aktarın ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
19. Ertesi gün kolonileri saymak ve gerçek inoculum konsantrasyonu belirlemek için ilk inoculum bakteri konsantrasyonu hesaplamak.

3. Hücrelerin Enfeksiyonu

NOT: Bu noktada, hücreler yaklaşık% 90 birleşim olmalıdır. 48 kuyulu bir plakadaki HeLa 57A hücreleri için bu, her kuyuda yaklaşık 1 x 10⁵ hücredir. Hücreler 10 enfeksiyon (MOI) veya 10⁶ cfu / iyi çokluğu ile enfekte olacaktır.

1. Her bir kuyu için kullanılacak enfeksiyon koşullarına göre plakanın kapağını etiketlayın, her koşul triplicate olarak yapılmaktadır.
2. Uygun kuyulara 10 μL inokül ekleyin. Enfekte olmayan kontrol kuyularına 10 μL steril LB ekleyin.
3. Enfeksiyon süresini senkronize etmek için plakayı bir masa üstü santrifüje yerleştirin ve 5 00 x g'da 5 dk boyunca döndürün, böylece plaka dengelenir.
4. Enfekte hücreleri 37 °C'de %5 CO₂ kuluçka makinesine 1 saat aktarın.
5. Bir sonraki adımda kullanılmak üzere 37 °C'lik bir su banyosuna hücre kültürü ortamının bir aliquot'u yerleştirin.
6. Enfeksiyon zamanından bir saat sonra, su banyosundan hücre kültürü ortamını çıkarın ve %70 etanol ile dış yüzeyi silin. Doku kültür plakasını biyogüvenlik kabinesine aktarın.
7. Steril tekniği kullanarak, kuyulardan aspirasyon ortamı ve taze, sıcak hücre kültürü medya 250 μL ile değiştirin.
8. Plakaları 37 °C'de %5 CO₂ kuluçka makinesine 4 saat daha iade edin.
9. CO₂ kuluçka makinesinden plakaları çıkarın ve medyayı kuyulardan aspire edin. Luciferase analizi için adım 4.1 devam edin. RNA yalıtımı için adım 5.1'e geçin.

4. Luciferase Analizi

1. Kuyulara 100 μL 1x hücre lisis tamponu ekleyin. Tampon ilk reaktif bağlı olarak, bir çalışma konsantrasyonu seyreltilmiş gerekebilir.
2. Plakayı -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın ve etkili hücre lisisi sağlamak için en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Dondurulmuş hücre lisatiçeren plakayı bir tezgahın üzerine yerleştirin ve üreticinin tavsiyelerine göre luciferase substrat reaktiflerini hazırlayın.
4. Luciferase substrat reaktiflerin oda sıcaklığını dengelemesine izin verin.
5. Plaka okuyucuyu açın ve ilgili okuyucu programını açın. Makineyi parlaklığı ölçecek şekilde ayarlayın.
6. Her numunenin 10 μL'sini opak 96 kuyuluk bir kuyuya aktarın.
7. Opak plakanın her kuyusuna çok kanallı pipet kullanarak Luciferase Assay Reaktifinin 50 0L'sini ekleyin.
8. Kuyuları karıştırmak ve alt yüzeyin sıvıyla kaplı olduğundan emin olmak için yan taraftaki tabağa hafifçe dokunun. Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve okumayı başlatın.
9. Parlaklık değerlerini elektronik tablo programına kopyalayın ve sonuçları çizin.

5. RNA İzolasyon

1. Her kuyuya 500 μL guanidium tiyosiyanat ekleyin ve tam bir lizin sağlanması için birkaç kez pipet yukarı ve aşağı.
2. İçeriği etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. RNA kalitesini korumak için numuneleri mümkün olduğunca buzüzerinde saklayın.
3. 4 °C'ye bir masa üstü santrifüj ayarlayın ve protokolün geri kalanı için bu sıcaklıkta santrifüj korumak.
4. Her numune tüpüne 100 μL kloroform ekleyin, sıkıca kaplayın ve 15 s. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatın.
5. 4 °C'de 15 dk için 12.000 x g santrifüj. Bu süre zarfında, yeni tüpler etiketleyerek RNA arıtma sonraki adım için hazırlayın.
6. Üst sulu fazı 250 μL izopropanol içeren yeni tüpe aktarın, orta veya alt katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin.
7. Kullanılmayan ürünü protein analizi için de kullanılabilen -80 °C'lik bir dondurucuda saklayınız. RNA daha sonra gerekirse artık sulu katman da yedek olarak hizmet verebilir.
8. Vortex sulu tabaka ve izopropanol karışımı ve örnekleri 10 dakika oda sıcaklığında oturup izin.
9. Numuneleri 12.000 x g'de 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin.
10. Tüpleri santrifüjden çıkarın. RNA çökelti tüpün yan ve alt kısmında beyaz bir pelet oluşturur. Tüpleri açın ve bir atık kabına dökerek supernatant dikkatle çıkarın.
11. RNA peletini %75 etanol ve girdap 500 μL ekleyerek yıkayın.
12. 4 °C'de 5 dk için 8.000 x g santrifüj.
13. Dışarı dökerek supernatant çıkarın ve tekrar% 75 etanol ile pelet yıkayın.
14. 4 °C'de 5 dk için 8.000 x g santrifüj.
15. Küçük hacimli bir pipet (örn. 10-200°L hacim) kullanarak, herhangi bir sıvıyı tüpe geri itmemeye veya pipet ucuyla peleti yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Pelet yerinden olursa, santrifüj kısa ve tekrar supernatant kaldırmaya çalışın.
    1. RNA peletlerini havayla kurutun. Peletler herhangi bir örnek için görünürse, periyodik olarak (her 5 dakikada bir) beyazdan temizliğe doğru değişip değişmediklerini kontrol edin ve kuru olduklarını belirtin. Peletler açık dönmeye başladıktan sonra, RNA'yı eritmek için 20°L ultra saf, RNa serbest su ekleyin.
    2. Peletler başlangıçta herhangi bir örnek için görünür değilse, sadece supernatant çıkardıktan sonra ultrasaf su 5 dk ekleyin.
16. Çözünürlüğü artırmak için, çözeltiyi bir pipet ucu ile birkaç kez geçirin ve 55-60 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.

6. RNA'nın DNase Tedavisi

1. RNA bütünlüğünü korumak için, aksi belirtilmedikçe RNA örneklerini buz üzerinde saklayın. Şu anda, 10x DNase tampon dondurucu dan kaldırılabilir ve buz üzerinde çözülmeye izin.
2. Tüm numune analiz yüzeylerini tüy bırakmayan bir bezle temizleyerek spektrofotometreyi numune analizi için hazırlayın.
3. Analizden önce bir arka plan ölçümü alın. Bunu yapmak için sensörü RNA peletlerini eritmek için kullanılan aynı ultra saf suyun 1,5 00 000'ı ile yükleyin. Arka plan okuması oluşturmak için Boş Oku düğmesine basın.
4. Cihazın numune yükleme yüzeyini silmek için tüy bırakmayan bezi kullanın. Her örnek okumadan sonra bu adımı tekrarlayın.
5. 1,5 μL'lik yeniden askıya alınan RNA'yı numune sahibine yükleyin ve Read Sample'ıseçin. Tüm örnekler okunana kadar tekrarlayın.
6. 1,5 mL mikrosentrifuge tüpte numune başına 2,4 μL 10x DNase tamponu ve 1 μL DNase birleştirerek DNase ana karışımını hazırlayın. Ana karışımı iki ekstra birim için hazırlayın.
7. Tüpü birkaç kez hareket ettirerek ana karışımı karıştırın. Kısaca tüpün altındaki içeriği toplamak için tüp santrifüj. 20 μL RNA numunesine 3,4 μL mastermix ekleyin. Daha önce olduğu gibi, kısa bir süre flicking ve santrifüj tarafından karıştırın içeriği.
8. Numuneleri 20 dk. 37 °C'de ayarlanmış bir ısı bloğuna aktarın.
9. 20 dk ısı bloğu üzerine örnekleri yerleştirdikten sonra, çalışma tezgahına yerleştirilen bir tüp raförnekleri aktarın.
10. DNase inaktivasyon reaktifinin içeriğini yavaşça girdaplayın. 2,6 μL DNase inaktivasyon reaktifini RNA içeren tüplere aktarın ve homojen bir karışım oluşturmak için tüpleri hareket ettirin.
11. 1 dk için 12.000 x g'de numuneleri santrifüj edin.
12. Dikkatle pipet yeni, etiketli tüp için supernatant.

7. mRNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu

1. Numune miktarına bağlı olarak bir ana karışım ve pipetleme yoluyla kaybı hesaba katmak için iki ekstra karışım hazırlayın (Tablo 1). 1 μg RNA kullanın ve toplam 50°L'lik bir hacme H₂O ekleyin.

Reaktif	Hacim (3L)	Son Konsantrasyon
MgCl2 (25mM)	3.5	1,75 mM
Ters transkripsiyon tamponu (10x)	5	1 x
dNTP karışımı (her biri 10 μM)	2.5	500 nm
rastgele hexamer (100 μM)	1.25	2,5 μM
Multiscribe ters transkriptaz (50 U/μL)	1	1 U/μL
RNase inhibitörü (20 U/μL)	1.25	1.25 U/μL
RNA (1 μg)		20 ng/uL
H2O	50'ye kadar üst

Tablo 1: Ters transkripsiyon ana karışımı için bileşenler ve reçete.

2. Numuneleri sıkıca kapatın ve yan taraftaki PCR tüpleri, kapaktaki etiketler daha sonra termocycler'ın ısıtılmış kapağından çıkarılabileceği nden etiketleyin. Girdap ile karıştırın.
3. Kısaca pcr tüpleri tüpün altına örnek toplamak için santrifüj.
4. PCR tüplerini bir termocycler'a yerleştirin ve örnekleri aşağıdaki ayarların altında çalıştırın:
   10 dk için 25 °C, 30 dk için 48 °C, 5 dk için 95 °C ve ardından 10 °C'de tutun.
5. Yeni sentezlenen cDNA içeren tüpleri -20 °C'lik bir dondurucuya aktarın veya qPCR analizinde hemen kullanın.

8. RT-qPCR Analizi için Hazırlama ve Yükleme Plakası

1. Başlamadan önce, numune analizi için 384-well qPCR plakakurulum planı.
2. Buz üzerinde astar ve cDNA çözülür.
3. Ana karışımı hazırlayın (bkz. Tablo 2),ayrıca pipetleme yoluyla kaybı nı hesaba katmak için yaklaşık %10 ekstra.

Reaktif	Hacim (3L)
10 μM F astar	1
10 μM R astar	1
Ultrasaf H2O	4
2x SYBR yeşil	10

Tablo 2: QPCR ana karışımının bileşenleri ve tarifi.

4. Girdap ana karışımı ve bir tekrarlayıcı pipet kullanarak 384-iyi plaka kuyularına 8 μL dağıtmak. Numuneler her astar ve cDNA örnek kombinasyonu için çoğaltılamaz olarak analiz edilecektir.
5. P10 (veya daha küçük) pipet kullanarak, analiz edilecek her astar kümesi için yinelenen kuyulara 2 μL cDNA aktarın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her kuyudan sonra uçları değiştirin.
6. Yapışkan filmi yüzeye dikkatlice uygulayarak plakayı kapatın ve tüm kuyuların kapalı olmasını sağlayın. Sıkıca mühürlemek için bir sızdırmazlık kürek veya rulo kullanarak film basın.
7. Bir kontrütük içinde plaka yerleştirin, bir denge olarak boş bir plaka ile. 5 dk için 500 x g plaka santrifüj.

9. QPCR Analizi için Thermocycler'ın Çalıştırıl

1. Bilgisayarda ve gerçek zamanlı PCR cihazında güç.
2. RT-qPCR yazılımını açın ve Yeni Deneyseçin.
3. Kurulum sekmesinin altında, çalıştırma parametrelerinin ayarlanabileceği Deneme Özellikleri'niseçin.
4. Sonuçları depolamak için kullanılan dosya adını ve ayarlarını ayarlayacak Olan Deneme Adınıtanımlayın.
5. Enstrüman Seçimiiçin, analizi çalıştıracak olan şu anda bağlı olan aracı seçin. Karşılaştırmalı CT (ΔΔCt) çalıştırma yöntemini seçin.
6. Kullanılacak floresan DNA boyası olarak SYBR Yeşil Reaktifleri ve rampa hızı olarak Standart'ı seçin.
7. Erime Eğrisi Ekle'nin yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun.
8. Tanımsekmesi'nin altında, hedefleri (yani güçlendirilecek genler) ve örnekler (yani deneysel koşullar) atayın.
9. Atla sekmesini seçin. Kuyuları 384 kuyulu plakanın yükleme şemasına karşılık gelen uygun hedefler ve numunelerle etiketleyin.
10. Çalıştır Yönteminiseçin. (Tablo3)listelenen analiz parametrelerini kullanın.

	Sahne Yi tutun		PCR Sahne Alanı		Erime Eğrisi Aşaması
	Adım 1	Adım 2	Adım 1	Adım 2	Adım 1	Adım 2	Adım 3
Temp	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
Zaman	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
Veri Toplama				Evet			Evet
Döngü sayısı	1 x		40x		1 x

Tablo 3: Termocycler için çevrim parametreleri.

11. 384 kuyulu plakayı termocycler'a yerleştirin ve analize başlayın.

10. Delta-delta Ct Yöntemi ile QPCR Sonuçlarının Analizi (2^-ΔΔCt)

1. Akış analizini engelleyebilecek hatalar için qPCR reaksiyonundan oluşturulan sonuçları analiz edin. Birçok hata sistem tarafından otomatik olarak işaretlenir.
2. Düzgün bir şekilde inşa edilmiş astarlar için, erime eğrilerinin yalnızca bir tepe noktası olmalıdır. Daha fazla analiz birden fazla tepe ile erime eğrisi içeren kuyular hariç.
3. ΔΔCt yöntemini kullanarak verileri çözümlemek için Ct değerlerini bir elektronik tablo programına dışa aktarın. Önerilen biçim sağlanır (Tablo 4). Son sütun, denetim örneklerine göre örneğin kat ifade değişimidir.

	Temizlik geni (GAPDH)			İlgi geni (IL6)
	Ct1	Ct2	Ave Ct	Ct1	Ct2	Ave Ct	ΔCt	Ave ΔCt ctrls	ΔΔCt	2^-(ΔΔCt)	Geomean
Kontrol 1	15.33	15.37	15.35	26.81	26.91	26.86	11.51	10.51	1.00	0.50	1.00
Kontrol 2	16.83	16.77	16.80	26.89	26.92	26.91	10.11	10.51	-0.41	1.33
Kontrol 3	17.56	17.53	17.54	27.38	27.56	27.47	9.93	10.51	-0.59	1.50
Sl1344 1	15.50	15.41	15.45	22.15	22.13	22.14	6.69	10.51	-3.83	14.21	13.23
SL1344 2	16.02	15.98	16.00	23.01	22.96	22.98	6.98	10.51	-3.53	11.57
SL1344 3	17.27	17.30	17.28	23.99	23.98	23.98	6.70	10.51	-3.82	14.09
sipA sopB sopE2 1	15.38	15.41	15.39	23.31	23.09	23.20	7.80	10.51	-2.71	6.56	7.29
sipA sopB sopE2 2	16.01	16.05	16.03	23.89	23.92	23.91	7.88	10.51	-2.64	6.23
sipA sopB sopE2 3	16.78	16.78	16.78	24.02	24.06	24.04	7.27	10.51	-3.25	9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1	15.52	15.60	15.56	27.04	27.03	27.03	11.47	10.51	0.96	0.51	0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2	15.56	15.59	15.57	26.37	26.42	26.39	10.82	10.51	0.31	0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3	15.91	15.92	15.91	26.24	26.12	26.18	10.27	10.51	-0.25	1.19

Tablo 4: QPCR verilerini analiz etme biçimi.

Sonuçlar

Burada açıklanan tsay, NF-κB'ye bağlı luciferase muhabiri kullanılarak transkripsiyon faktörü NF-κB'nin aktivasyonuna odaklanarak HeLa hücrelerinin bir hattına dönüştürüldü. Aktive NF-κB, pro-inflamatuar sitokinler IL6 ve IL23de dahil olmak üzere hedef genlerin κB bağlayıcı bölgelerini bağladığı çekirdeğe aktarır. NF-κB aktivasyonuna genel bir genel bakış Şekil 1'degösterilmiştir. Gram-negatif bakteri Salmonella enterica serovar Typ...

Tartışma

Açıklanan protokolün en önemli katkısı, hücrelerde NF-κB aktivasyonunu saptamak için hızlı ve kolay bir yöntem sunmasıdır, bu da birden fazla uyarıcı koşulun veya NF-κB aktivasyonunu etkileyen ilaçların yüksek iş analizine olanak sağlar. Burada Salmonellaenfekte HeLa hücrelerinde NF-κB aktivasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Bu hücreler diğer patojenler ile enfeksiyon için yanı sıra NF-κB aktivasyonu bakteriyel enfeksiyonun etkisini incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, HeLa 57A hücrelerinde NF-κB ba...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yapışkan film	VWR International	60941-070
Kloroform	Fisher Biyoreaktifler	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse tedavi kiti	Qiagen	79254
dNTP'ler	Promega	U1511
Etanol	Fisher Biyoreaktifler	BP2818100	moleküler sınıf
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A hücreleri			Ref # 15
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti	Uygulanan Biyosistemler	4368814
İzopropanol Fisher	Biyoreaktifleri	BP26181
Kanamisin	Fisher Biyoreaktifleri	BP906-5
LB agar	Fisher Biyoreaktifler	BP1425-500
Lizojeni suyu	Fisher Biyoreaktifler	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Termo Bilimsel		spektrofotometre
Promega lusiferaz tahlil sistemi	Promega	E1501	Hücre lizis tamponu ve lusiferin substratı
Rastgele Heksamers	Thermo Scientific	SO142
Gerçek zamanlı GAPDH ileri astar			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'Gerçek
zamanlı GAPDH ters astar			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'Gerçek
zamanlı IL-23 ileri astar			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'Gerçek
zamanlı IL-23 ters astar			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'Gerçek
zamanlı IL-6 ileri astar			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'Gerçek
zamanlı IL-6 ters astar			5'-CATGTCTCTTTTCTCAGG GCTG-3'Ters
Transkriptaz	Uygulanan Biyosistemler	4308228
RNAse inhibitörü	Thermo Bilimsel	EO0381
RT tamponu	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 Δ sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039			Ref # 18
SL1344 Δ sopE ve Delta; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039			Ref # 18
SYBR yeşil	Uygulamalı Biyosistemler	4309155	2x mastermix
Tri-reaktif	Moleküler Araştırma Merkezi	TR 118	guanidin tiyosiyanat
Tripsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	%0.05 Tripsin-EDTA
Ultra saf su	Fisher Biyoreaktifleri
VWR International	89218-294	384 kuyulu plaka	için kuyu plakası