Method Article

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

DOI:

10.3791/60571

⸱

January 18th, 2020

 ,  , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan embriyonik kök hücrelerinin (HESC' ler) in vitro farklılaşması, insan gelişimini hem biyolojik hem de moleküler düzeylerde inceleme yeteneğini dönüştürmüş ve rejeneratif uygulamalarda kullanılmak üzere hücreler sağlamıştır. Farklılaşmamış hESC'leri ve embriyoid gövdeyi (EB) korumak için koloni tipi kültürünü kullanan hESC kültürü için standart yaklaşımlar ve farklı mikrop katmanlarına farklılaşma için rozet oluşumu verimsiz ve zaman alıcıdır. Burada sunulan bir koloni tipi kültür yerine hESCs kullanarak tek hücreli bir kültür yöntemidir. Bu yöntem, koloni tipi hESC'lere benzer düzeylerde hESC belirteçlerinin ekspresyonu da dahil olmak üzere, farklılaşmamış hESC'lerin karakteristik özelliklerinin sürdürülmesini sağlar. Buna ek olarak, protokol 1 hafta içinde NPC'ler üreten tek hücreli tip hESC'lerden nöral progenitor hücre (NPC) üretimi için etkili bir yöntem sunar. Bu hücreler son derece çeşitli NPC marker genleri ifade ve çeşitli nöral hücre tipleri ayırt edebilirsiniz, dopaminerjik nöronlar ve astrositler de dahil olmak üzere. HSS'ler için bu tek hücreli kültür sistemi, bu süreçlerin moleküler mekanizmalarının, bazı hastalıkların çalışmalarının ve ilaç keşif ekranlarının araştırılmasında yararlı olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) daha sonra çeşitli çok güçlü progenitor hücre soyları ayırt üç birincil mikrop katmanları, ayırt etme potansiyeline sahip. Bu soylar daha sonra insan vücudunda tüm hücre tipleri neden. In vitro hESC kültür sistemleri insan embriyonik gelişimini inceleme yeteneğini dönüştürmüş ve bu süreçlerin biyolojik ve moleküler düzeyde nasıl düzenlendiğine dair yeni bilgiler edinmek için değerli bir araç olarak hizmet vermiştir. Benzer şekilde, insan hastalardan izole edilen somatik hücrelerin yeniden programlanmasından elde edilen indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) çalışmaları çeşitli hastalıklar hakkında yeni bilgiler sağlamaktad....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HESC nitelikli Bodrum Membran Matris Kaplı Plakaların Hazırlanması

  1. Bir jel oluşumunu önlemek için hESC nitelikli bazal membran matrisini (Bkz. Malzeme Tablosu)çözeltisini en az 2-3 saat veya bir gecede 4 °C'de yavaşça eritin.
  2. Bodrum membran matris kaplı plakalar hazırlamak için, soğuk DMEM/F12'de seyreltik matris %2 nihai konsantrasyona kadar. İyi bir şekilde karıştırın ve seyreltilmiş matris çözeltisinin 1 mL'si ile 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kaplayın.
  3. Bodrum membran matris kaplı plakaları oda sıcaklığında (RT) en az 3 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Bazal membran matrisli plakalar, m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan bakım ve hESC'lerin tek hücreli tip kültürünün genişletilmesi ve nöral progenitor hücrelere verimli farklılaşma için geliştirilmiş bir protokol, daha sonra çeşitli downstream nöral soylar halinde ayırt, dopaminerjik nöronlar ve astrositler de dahil olmak üzere.

Temsili faz kontrast görüntüleri, koloni tipi hESC'lerin tek hücreli tip kültüre uyarlaması sırasında hücre morfolojisini farklı basamaklarda göstermektedir(Şekil 1A). Tek hü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HSK'ların çeşitli soylara farklılaşması ve yeterli sayıda farklılaştırılmış hücre nin üretilmesi için ölçeklenebilir ve etkili yöntemler ilaç taraması ve kök hücre tedavisi için önemli kriterlerdir. Çeşitli tek hücreli geçiş yöntemleri, hangi hücrelerin ROCK inhibitörü veya diğer küçük moleküllerin varlığında hayatta kalmayı artırmak için kültürlü, ancak bu kültür yöntemlerinin son ürünleri koloni tipi hESCs17,18,19,<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Carl D. Bortner'e (NIEHS) FACS analizine yaptığı yardımlar için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Z01-ES-101585 ve AMJ'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm m-tabaklaribidi81156Hücre kültürü kabı
6 oyuklu plakalarCorning3516
AccutaseYenilikçi Hücre TeknolojileriAT104-500Hücre ayırma çözeltisi
Activin AR& D sistemi338-AC-050
Askorbik AsitSigma AldrichA4403
B27 takviyesiThermo Fisher17504044
B27 takviyesi (-Vit A)Thermo Fisher12587010
bFGFPeprotech100-18C
Z100065BDNFUygulamalı Biyolojik Malzemeler
DAMON/ICE428-6759
CO2 inkübatörüThermo Fisher4110
Corning hESC-qulified Matris (Magrigel)Corning354277Bazal membran matrisi (buradaki protokolün çoğu için kullanılır)
Cryostor CS 10Kök Hücre Teknolojileri7930Hücre dondurma çözeltisi
DispaseKök Hücre Teknolojileri7923
DMEMThermo Fisher10569-010
DMEM/F12Thermo Fisher10565-018
DorsomorphinTocris3093
EGFPeprotechAF-100-16A
Fetal SığırSerumu Fisher ScientificSH3007003HI
FGF8Uygulamalı Biyolojik MalzemelerZ101705
GDNFUygulamalı Biyolojik MalzemelerZ101057
Geltrex matrisiThermo FisherA1569601Bazal membran matrisi
GlutaMaxThermo Fisher35050061Glutamin takviyesi, 100X
H9 (WA09) insan embriyonik kök hücre hattıWiCellWA09
Heregulin b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
Nakavt DMEMThermo Fisher10829018
Nakavt Serum DeğiştirmeThermo Fisher10828028
LamininSigma AldrichL2020
mTeSR1Kök Hücre Teknolojileri85850hESC kültür ortamı
N2 takviyesiThermo Fisher17502001
NEAAThermo Fisher11140050
NeurobazalThermo Fisher21103049
Poli-L-ornitinSigma AldrichP3655
ROCK inhibitörüTocris1254
SB431542Tocris1614
SHHUygulamalı Biyolojik MalzemelerZ200617
Stemdiff Nöral Progenitör ortamıKök Hücre Teknolojileri5833NPC genişleme ortamı
Santrifüj

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Embryonic Stem CellsSingle Cell CultureNeural Progenitor CellsEmbryoid Body FormationROCK InhibitorNeural Induction MediumDopaminergic NeuronsAstrocyte DifferentiationFACS AnalysisQuantitative PCR

Related Articles