Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

21.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60575

⸱

29 Ocak 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

Bu makalede

Özet

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Özet

İmmünohistokimya hem normal gelişimsel hem de hastalık durumlarında protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Birçok immünohistokimya protokolü memeli doku ve doku bölümleri için optimize edilmiş olsa da, bu protokoller genellikle memeli olmayan model organizmalar için modifikasyon ve optimizasyon gerektirir. Zebra balıkları, gelişim süreçlerinin moleküler, genetik ve hücresel biyolojik mekanizmalarını araştırmak için temel, biyomedikal ve çevirisel araştırmalarda giderek daha fazla model sistem olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı bir model sistemi olarak birçok avantaj sunmak ama aynı zamanda optimal protein tespiti için modifiye teknikleri gerektirir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarda tam montaj floresan immünohistokimyası için protokolümüzü sağlıyoruz. Bu protokol ayrıca, istihdam edilebilen birkaç farklı montaj stratejisini ve her stratejinin sağladığı avantaj ve dezavantajlara genel bir bakışı açıklar. Ayrıca, tüm montaj dokusunda kromojenik substratların saptanmasını ve kesitli larva dokusunda floresan tespitine olanak sağlayacak değişiklikler de tanımlıyoruz. Bu protokol birçok gelişimevrelerinin ve embriyonik yapıların incelenmesi için geniş ölçüde geçerlidir.

Giriş

Zebra balığı(Danio rerio)kısa nesil zaman, hızlı gelişme ve genetik teknikler için amenability dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle biyolojik süreçlerin çalışması için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak, zebra balıkları genellikle toksikolojik araştırma ve ilaç keşif için yüksek iş ölçekli küçük molekül ekranlarda kullanılır. Zebra balığı aynı zamanda tek bir dişinin rutin olarak bir seferde 50-300 yumurta üretebildiği ve optik olarak berrak embriyoların gelişim süreçlerinin verimli bir şekilde görüntülenmesi için dışarıdan geliştiği göz önüne alındığında gelişimsel süreçlerin incelenmesi için de cazip bir modeldir. Ancak, erken araştırma n-etil-N-nitrozourea (ENU) veya diğer mutajenler ters genetik teknikler kurulmasında zorluklar nedeniyle kullanarak ileri genetik ekranlar çoğunlukla dayanıyordu. Kabaca yirmi yıl önce, morpholinos ilk zebra balığı nda hedeflenen genleri yıkmak için kullanılmıştır1. Morfolinonos erken gelişim aşamasında bir embriyo içine mikroenjeksiyon aşağıdaki hedef mRNA çeviri inhibe küçük antisense oligonükleotidler vardır. Morfolinoların en büyük zaafı, hücrelerin bölünmesiyle seyreltilmeleri ve genellikle döllenme sonrası (hpf) 72 saat etkisini kaybetmeleridir. Morpholos zebrabalığı gen bozulması için güçlü bir araç olmaya devam ederken, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs), çinko-parmak nükleazlar (ZFNs), ve düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) daha yakın zamanda doğrudan zebra balığıgenomu2,3hedef için kullanılmaktadır . Bu ters genetik stratejiler, ileri genetik ve yüksek iş elde ekranları ile birlikte, gen ekspresyonu ve fonksiyonu çalışma güçlü bir model olarak zebra balığı kurduk.

Gen fonksiyonunu inceleme yeteneği genellikle gen veya gen ürün ekspresyonunun spatio-temporal dağılımının değerlendirilmesi gerektirir. Erken gelişim sırasında bu tür ifade kalıplarını görselleştirmek için en sık kullanılan iki teknik yerinde hibridizasyon (ISH) ve tüm immünohistokimya (IHC) bulunmaktadır. In situ hibridizasyon ilk olarak 1969 yılında geliştirilmiştir ve birorganizmadamRNA ifadesini tespit etmek için etiketli antisense RNA problarının kullanımına dayanır 4 . Buna karşılık, etiketli antikorlar protein ekspresyonunu görselleştirmek için immünohistokimyada kullanılır. Algılama için proteinlerin etiketleme fikri 1930'ların5'ine kadar uzanır ve ilk IHC deneyi 1941'de FITC etiketli antikorların enfekte dokularda patojenik bakterileri tespit etmek için kullanıldığında yayınlanmıştır6. ISH ve IHC gelişti ve sonraki yıllarda önemli ölçüde geliştirilmiş ve şimdi her ikisi de rutin moleküler ve tanısal araştırma laboratuvarı7,8,9,10,11kullanılır . Her iki tekniğin de avantajları ve dezavantajları olsa da, IHC ISH üzerinde çeşitli avantajlar sunar. Pratik olarak, IHC ISH çok daha az zaman alıcı ve birincil antikor maliyetine bağlı olarak genellikle daha az pahalıdır. Buna ek olarak, mRNA ekspresyonu her zaman güvenilir bir protein ekspresyonu metomu değildir, çünkü farelerde ve insanlarda protein bolluğu varyasyonunun sadece üçte birinin mRNA bolluğu ile açıklanabileceği gösterilmiştir12. Bu nedenle, IHC ish verilerini onaylamak için önemli bir ektir, mümkün olduğunda. Son olarak, IHC ISH 13,14,15tarafından belirlenemeyen hücre altı ve eş yerelleştirme verileri sağlayabilir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvaları halinde immünohistokimya ile proteinleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için adım adım bir yöntem tanımlıyoruz. Bu tekniğin amacı tüm embriyo ilgi bir proteinin mekansal ve zamansal ekspresyonu belirlemektir. Bu teknoloji antijene özgü primer antikorlar ve floresan etiketli ikincil antikorlar kullanır. Protokol, slayta monte edilmiş doku bölümlerinde ve floresan yerine kromojenik yüzeylerle kullanıma hazır dır. Bu protokolü kullanarak, biz zebra balığı iskelet kası gelişmekte olduğunu göstermek iyonotropik glutamat reseptörleri ifade eder, asetilkolin reseptörlerine ek olarak. NMDA tipi glutamat reseptör alt birimleri 23 hpf'de uzunlamasına kasüzerinde saptanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde tanımlanan zebra balığı yetiştiriciliği yetişkinler ilahı ve embriyolarla çalışma prosedürleri Murray State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Embriyo Toplama ve Fiksasyon

  1. Yetişkin zebra balığı karışık seks çiftleri veya grupları bir gecede sistem suyu yla dolu bir örgü veya oluklu astarile tanklara yerleştirerek yumurtlama tanklarını hazırlayın.
  2. Işıklar açıkken, dışkı kaldırmak için tatlı sistem suyu için yumurtlama tankı su değiştirin. 09:00'da ışıklar yanan 14 saat/10 h açık karanlık bir döngü kullanın.
  3. Yumurtalar yumurtladıktan sonra, yetişkinleri ev tanklarına geri döndürün.
  4. Bir transfer pipet kullanarak veya bir örgü süzgeç içine dökerek onları çizerek yumurta toplamak.
  5. Yumurtaları embriyo ortamıyla yarı yarıya doldurulmuş Petri yemeklerine (örneğin 0,5 mg/L metilen mavisi olan %30 Danieau veya E2 embriyo ortamı) aktarın ve çanak başına embriyo sayısını 50 ile sınırlandırın.
  6. Ölü ya da bölmek için başarısız herhangi bir yumurta çıkarın.
    NOT: Ölü embriyolar opak hale geldikçe ve genellikle "bulutlu" göründükleri için kolayca tanımlanabilirler. Metilen mavisi embriyo ortamına eklenirse, ölü embriyolar koyu mavi bir görünüm edersiniz.
  7. Yumurtaların 28.5 °C'de istenilen aşamaya ulaşınayına kadar kuluçkaya yatırın. Bu deney için, 23 hpf kadar embriyolar yükseltmek.
  8. İsteğe bağlı) Melanogenezi önlemek için embriyo larda 24 hpf ila 200 μM 1-fenil 2-tiourea (PTU) embriyoyutunur. Alternatif olarak, çamaşır suyu embriyoları fiksasyon sonrası (isteğe bağlı bölüm 5 bakınız).
  9. Günlük embriyo veya PTU ortamını değiştirin.
  10. Stereomikroskop altında ultra ince uçlu forceps kullanan dechorionate unhatched embriyolar. Alternatif olarak, kimyasal olarak embriyoları oda sıcaklığında birkaç dakika embriyo orta 1 mg/mL Pronase kuluçka ile dechorionate. Pronase gelen embriyolar çıkarın ve embriyo orta ile üç kez yıkayın.
  11. Dechorionated embriyolar plastik yapışacak. Embriyo ortamda çözünmüş% 1-2 agarose ile kaplanmış cam veya plastik Petri yemekleri saklayın. Hasarı en aza indirmek için ateşcilli Pasteur pipetleri kullanarak dechorionated embriyoları taşıyın.
  12. Embriyoları plastik veya ateş cilalı pipet kullanarak 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın.
  13. Bir mikropipet ile embriyo orta çıkarın. Sadece her sıvı değişikliğinden sonra embriyoları kapsayacak kadar sıvı bırakın.
  14. Kimyasal duman kaputunda 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
    DİkKAT: PFA tehlikeli bir maddedir. Eldiven giyin ve kirlenmiş sıvıları ve katıları belirlenen alanlarda atın.
  15. Oda sıcaklığında hafif sallanan ile 1-2 saat için% 4 PFA içinde embriyolar düzeltin. Alternatif olarak, embriyoları 4 saat ile geceye kadar 4 °C'de sabitler.
  16. 1x PBS + %1 Triton-X (PBTriton) içinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  17. Embriyoları hemen kullanın veya 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
  18. Uzun süreli depolama için embriyoları %100 metanol (MeOH) 2 saat veya geceleme -20 °C'de susuz bırakın. Embriyoları -20 °C'de MeOH'da aylarca saklayın.
    DİkKAT: MeOH tehlikeli bir maddedir. Eldiven giyin ve kirlenmiş sıvıları ve katıları belirlenen alanlarda atın.

2. Embriyo Hazırlama

  1. Oda sıcaklığında seri kuluçka yoluyla embriyolar rehydrate.
    1. 75% MeOH/25% 1x PBS 5 dakika, sallanan incubate.
    2. 5 dakika için% 50 MeOH/50% 1x PBS inkübat, sallanan.
    3. 5 dakika için% 25 MeOH/75% 1x PBS incubate, sallanan.
    4. 5 dakika için% 100 PBTriton inkübat, sallanan.
  2. (İsteğe bağlı) 10 μL taze çözülmüş proteinaz K stoğu (10 mg/mL) ekleyerek buz üzerinde taze proteinaz K çalışma çözeltisi (PBTriton'da 10 μg/mL) hazırlayın.
    1. Proteinaz K'de 30 dk'ya kadar sindirerek embriyoları permeabilize edin.
      NOT: Önerilen zamanlama <24 hpf: hiçbir sindirim; 24 hpf: 15 dk sindirim; ve 7 günlük: 30 dk sindirim.
    2. PBTriton'da permeabilize embriyoları durulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 PFA'da yeniden düzeltin.
    3. Embriyoları PBTriton'da üç kez oda sıcaklığında hafif sallanan 5 dakika yıkayın.

3. Primer Antikor Kuluçka

  1. 2 mg/mL Sığır Serum Albumini (BSA) olan veya olmayan ikincil antikor konak türlerine (pbtriton'da %10 keçi serumu) uyan ticari bir engelleme solüsyonu veya serum seçin.
  2. Embriyoları blokçözeltisinde oda sıcaklığında 1-3 saat veya geceboyunca 4 °C'de sallayarak engelleyin.
  3. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş primer antikorda kuluçka veya pbtriton'da bir gecede 4 °C'de %1 serum sallanırken. Bu deneyde kullanılan birincil antikorlar anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA reseptörü ve antifosfo-Histon H3 idi ve her biri PBTriton'daki %1 keçi serumunda 1:500'lük son konsantrasyona seyreltildi.
  4. Sallarken pbtriton'da 10 dakika oda sıcaklığında beş kez yıkayın.

4. Sekonder Antikor Kuluçka

  1. Birincil antikor ve istenilen dalga boyu konak türlerine göre ikincil bir antikor seçin.
  2. Bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş ikincil antikorveya %1 serumda oda sıcaklığında (veya geceleme 4 °C'de) sallanırken 2 saat boyunca inküler.
    NOT: Floresan sekonder antikorlar ışığa duyarlıdır. Biz PBTriton% 1 keçi serum seyreltilmiş 1:500 keçi-anti-fare Alexa488 kullanılır.
  3. Bu ve sonraki tüm adımlar için bir ışık engelleme kutusu ile boruları alüminyum folyo veya kapak kapağı ile kaplayın.
  4. Sallarken pbtriton'da 10 dakika oda sıcaklığında üç kez yıkayın.
  5. Embriyo orta% 2 agarose bir yatak üzerinde PBS bir% 50 gliserol çözeltisi embriyolar transferi ve belgelere devam veya aşağıdaki daha fazla işleme adımları devam.

İsteğe Bağlı Adımlar

5. Beyazlatma

  1. 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL 2 M KOH ve %30 H2O2'lik100 μL ekleyerek 1,5 mL'lik bir tüpte çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın.
  2. Tüpü karıştırmak için üç kez ters çevirin.
  3. Pipet 1 mL çamaşır suyu çözeltisi yönde embriyolara.
  4. Gazın kaçabilmesi için embriyo tüp kapağını açın. Kabarcıkları çıkarmak için tezgahtaki tüpü hafifçe dokunun.
  5. Ağartma işlemini izleyin (gerekirse mikroskop kullanın) ve pigment yeterince çıkarıldığında reaksiyonu durdurun (24 hpf için yaklaşık 5 dk veya 72 hpf için 10 dk).
  6. Bir mikropipet ile beyazlatma çözeltisini dikkatlice çıkarın ve pbtriton 1 mL üç kez embriyoları durulayın.
    NOT: Embriyolar bu adımda yapışkandır.
  7. Aşağıdaki belgelere veya daha fazla işleme adımlarına devam edin.

6. Embriyo Diseksiyon ve Deyolking

  1. Sarısını çıkarmak için, küçük bir miktar transfer (~ 200 μL veya tamamen embriyo kapsayacak şekilde yeterli ama yüzebilir nerede sınırlamak için yeterince kısıtlayıcı) bir depresyon slayt veya düz bir cam slayt 1x PBS.
  2. PBS damlacık 1 veya daha fazla embriyo taşımak için plastik bir transfer pipet kullanın.
  3. Sarısı parçalamak ve çok yavaşça embriyonun ventral yüzeyinden sarısı granülleri kazımak için ultra ince çalgılar ve 00 böcek pimleri kullanın (ayrıca cheng ve ark., 2014 bakınız)18.
  4. Sarısı granüllerini çıkarın ve gerektiğinde PBS'yi yeniler.
  5. Embriyo yeterince sarısı ücretsiz olana kadar tekrarlayın.

7. Slaytlarda Düz Montaj

  1. Deyolked embriyoları plastik pipetli yüklü bir cam kaydırağa veya kesilmiş uçlu 1 mL mikropipete (kesme gerilimini azaltmak için) aktarın. 200 μL mikropipet ucu veya böcek pimi ile iskan edilen orient.
  2. Wick uzakta bir Kim mendil veya kağıt havlu ile aşırı PBS.
  3. Slayt ve coverslip montaj ortamı 2-3 damla ekleyin.
  4. Hava yaklaşık 5-10 dakika kuru.
  5. Kapak camı şeffaf ojeile kaydırağın üzerine kapatın.
    NOT: Kapak camı kenarları tamamen ince, sürekli bir oje tabakası ile kaplanmalıdır.
  6. Görüntülemeden önce yaklaşık 10 dk kurumasını bekleyin.

8. Agarose Montaj

  1. Embriyo ortasında, mikrodalga da güvenli bir şişeye veya istenilenden en az 3 kat daha fazla hacimde bir kabın 50 mL'sine 0,5 g agarose ekleyerek %1 agarose hazırlayın.
  2. Bir mikrodalga ısı, her 30 s dönen, agarose tamamen çözülmüş kadar.
  3. 1,5 mL santrifüj tüplerinde 1 mL aliquot yapın. Aliquots oda sıcaklığında saklayın.
  4. Isıtmadan önce kapak kilitleri ile kapak kapakları.
  5. Agarose tüpleri yüzer bir tüp tutucuya, yarı su dolu bir kabın içine yerleştirin.
  6. Mikrodalga 2-3 dakika yüzen tüpler ile beher, ya da agarose tamamen eriyene kadar.
  7. Bir embriyoyu plastik bir pipet veya kesilmiş uçlu 200 μL mikropipetle köprülü kaydırağa aktarın (kesme gerilimini azaltmak için).
  8. Embriyoyu böcek pimleri kullanarak dikdörtgen bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve doğrudan embriyoya yaklaşık 20 μL erimiş agarose ekleyin.
  9. 00 böcek pimi kullanarak kapak kaymasına en yakın ilgi bölgesini hızla yönlendirin.
    NOT: Bu baş aşağı bir montaj.
  10. Agarose tüpünü her kullanım ve mikrodalga arasında sıcak su tüpü şamandırasına gerektiği gibi geri getirin.
  11. Agarose sertleşir zaman bir mikroskop kullanarak görüntü. Monte edilmiş embriyoyu ters bir mikroskopta kullanmak için baş aşağı tutun. Kapak kapağını ters mikroskoplarda kullanmak için (agarose coverslip'in altında olması için) çevirin.

9. Köprülü Slaytlara Montaj

  1. Köprülü slaytlar yapmak için, yapıştırıcı kare superglue küçük bir nokta kullanarak cam slayt kapakları.
    NOT: Kapaklar arasında en az 5 mm genişliğinde bir çukur olmalıdır. İki #1 kapakları yüksek genellikle 24-48 hpf embriyolar için uygundur, üç coverlips yüksek 72 hpf için gerekli olabilir.
  2. 1-2 deyolked embriyoları plastik bir pipet veya kesilmiş uçlu 200 μL mikropipet (kesme gerilimini azaltmak için) ile köprülü slayta aktarın.
  3. Wick uzak bir Kim mendil veya kağıt havlu ile aşırı sıvı.
  4. Doğrudan embriyoya ≥80% gliserol bir damla ekleyin.
  5. Dikdörtgen kapak camı ile kaplayın. Gliserol damlacık kapak cam dokunmak gerekir.
  6. Tamamen embriyo tarafında gliserol marjı ile embriyo kapsayacak şekilde gerekli olduğu gibi kapak cam ve slayt arasındaki alana daha fazla gliserol ekleyin.
  7. Embriyoyu görüntüleme pozisyonuna getirmek için dikdörtgen kapak camı yavaşça kaydırın.

10. DAB Boyama

NOT: Bu bölüm yukarıdaki adım 4.2'den sonra başlar ve 4.

  1. Embriyoları, terleme sırasında oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de peroksidaz konjuge ikincil antikor ile bloke edici bir çözeltide kuluçkaya yatırın.
  2. Oda sıcaklığında 10 dakika PBTriton üç kez yıkayın.
  3. Embriyoları bir kültür plakasına veya bir transfer pipetle depresyon slaytına aktarın.
  4. DDH2O ve %0,3 hidrojen peroksit 50 μL çözünmüş % 1 DAB (3,3'-diaminobenzidin) karışımı ve PBS ile 1 mL getirmek.
    DİkKAT: DAB tehlikeli bir maddedir. Eldiven giyin ve DAB'nin kirlenmiş sıvıve katılarını belirlenen alanlarda imha edin.
  5. Yukarıda hazırlanan DAB çözeltisi ile HRP lekeli embriyoları kapatın ve mikroskop altında renk gelişimi (genellikle 1-5 dk) için monitör.
  6. İstenilen renk gelişimi seviyesine ulaştıktan sonra, embriyoları Kısaca PBS'de durula.
  7. Embriyoları fiksasyondan önce 1,5 mL'lik bir tüpe geri aktarın.
  8. Oda sıcaklığında %4 PFA'da 15-20 dk embriyoları yeniden düzeltin.
  9. Embriyoları PBTriton'da 3 kez 5 dakika yıkayın.
  10. Belgelere devam edin.

11. Slaytlara Monte Edilen Kesitli Dokunun Boyandırılmasını Sağlayacak Modifiye Protokol

  1. Bir pap kalem ile lekeli olmak için doku çevreleyen.
  2. Slaytları nemli bir odaya aktarın.
  3. Doğrudan slayta 1 mL PBS ekleyin.
  4. Katıştırma ortamını çıkarmak için oda sıcaklığında 7 dk kuluçkaya yatın.
  5. Slayt ters çevirerek PBS dökün.
  6. 1 mL'ye kadar TNT tamponu (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, %0.1 Ara 20) 1 dk rehydrate.
  7. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1 mL'ye kadar bloklama çözeltisi (ticari veya %10 serum + %2 BSA) bloke edin.
  8. %1 serumda seyreltilmiş primer antikorda veya 4 °C'de tıkanan çözeltide bir gecede kuluçkaya yatırın.
  9. Oda sıcaklığında 1 mL'ye kadar TNT tamponu beş kez yıkayın.
  10. Oda sıcaklığında veya geceleme 4 °C'de 2 saat boyunca ikincil antikorda kuluçkaya yatırın. Folyo ile oda kapağı veya koyu bir kapak kullanın.
  11. Oda sıcaklığında TNT beş kez yıkayın. Son yıkamayı dökün.
  12. Montaj orta ve coverslip 2-3 damla ile Monte. 5-10 dk oturalım.
  13. Kapak camı açık oje kullanarak kaydırağın üzerine kapatın. Görüntülemeden önce tamamen kurumasını bekleyin.

12. Dokümantasyon

  1. Tüm prosedürü ve sapmaları laboratuar not defterine kaydedin.
  2. Birincil antikorkonsantrasyonu, adını, katalog numarasını, üreticisini ve lot numarasını kaydedin.
  3. Uygun monte edilmiş numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. İlgi çekici bölgeyi bulun.
  4. Nispeten parlak bir örnek seçin. Kamera pozlamasını ayarlayın ve sinyalin doymadan yeterince parlak olması için kazanç elde edin.
  5. Deneysel antikor etiketli embriyolar ve kontrol antikor (ex. IgG) embriyoları arasında karşılaştırma yaparken aynı maruzkalma ayarlarını kullanarak aynı ilgi bölgesinin boyama yoğunluğunu karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tüm monte immünohistokimya bozulmamış hayvan protein ekspresyonunun mekansal desen tespit etmek için antikorlar kullanır. İmmünohistokimyanın temel iş akışı (Şekil 1'degösterilmiştir) zebra balıklarının üremesini, embriyoların yetiştirilmesini ve hazırlanmasını, spesifik olmayan antijenlerin engellenmesini, ilgi proteinini hedeflemek için antijene özgü bir primer antikor kullanılmasını, etiketlenmiş ikincil antikorla birincil antikortespit ini, numuneyi monte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İmmünohistokimya bir organizmada ilgi hemen hemen herhangi bir protein in spatio-temporal ifade karakterize etmek için kullanılabilecek çok yönlü bir araçtır. İmmünohistokimya dokular ve model organizmaların geniş bir yelpazede kullanılır. Bu protokol zebra balıklarında kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Farklı türlerde immünohistokimya farklı fiksasyon ve işleme teknikleri, türlere ve endojen peroksidazların varlığına bağlı olarak çözümler engelleme ve dokuların kalınlığı ve bileşimi nedeniyle kuluçka süreleri gerek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir bilgileri yok.

Teşekkürler

NIH hibe 8P20GM103436 14 fon.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Alüminyum folyo, ağır hizmet tipiKirklandHerhangi bir marka ikame edilebilir
Anti-NMDA antikoruMillipore SigmaMAB363
Anti-fosfo-histon H3 (Ser10), klon RR002Millipore Sigma05-598
Anti-pan-AMPA reseptörü (GluR1-4)Millipore Sigma
Sığır serum albümini (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Kalsiyum Nitrat [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Santrifüj tüpleri, 1.5 mLAxygenMCT150C
Şeffaf ojeSally HansonHerhangi bir oje veya sertleştirici ikame edilebilir
Depresyon (içbükey) slaytElektron Miskroskopi Bilimleri71878-01
DiaminobenzidinTermo Bilimsel1855920
Embriyo ortamı, Danieau, %17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3< / sub>) 2< / sub>, 1.5 mM HEPES ultra saf suda.
Embriyo ortamı, E27.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4< / sub>, 75 & mu; M KH2< / alt>PO<>< /alt>, 25 uM Na2< / alt>HPO4< / alt>, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L metilen mavisi
Yüzer tüp tutucuThermo Scientific59744015
Floresan bileşik mikroskobuLeica BiosystemsDMi8
Floresan stereomikroskopLeica BiosystemsM165-FC
Cam lameller 18 mm x 18 mmCorning284518
Cam lameller 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
Cam slaytlarFisher Scientific12-544-4
GliserolFisher ScientificBP229-1
Keçi anti-fare IgG Alexa 488InvitrogenA11001
HEPES çözeltisiSigma AldrichH0887
Kapaklı nem odasıSimportM920-2
Hidrojen peroksit, %30Fisher ScientificH325-500
Immunedge pap kalemVektör laboratuvarlarıH-4000
Böcek iğneleri, boyut 00Çalmak5213323
Magnezyum Sülfat (MgSO4 ve orta nokta; 7H2O)Sigma Aldrich63138
Mesh süzgeçOneidaHerhangi bir marka ikame edilebilir
MetanolSigma Aldrich34860
Metilen mavisiSigma AldrichM9140
Mikro tüp kapak kilidiAraştırma Ürünleri Uluslararası145062
Mikrodalga fırınToastmaster
Mouse IgGSigma AldrichI8765
Normal keçi serumuMillipore SigmaS02L1ML
Somunlama karıştırıcıFisher Scientific88-861-044
ParaformaldehitFisher Scientific04042-500
Pasteur pipetleriFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1x PBS'de %1 TritonX-100
Permount montaj ortamıFisher ChemicalSP15-500
Petri kabı (cam)Pyrex3160100
Petri kabı (plastik)Fisher ScientificFB0875713
1-fenil 2-tiyoüreAcros Organics207250250
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 10x, pH 7.4Gibco70011-044
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 1x1x, dH2O
Potasyum Klorür (KCl)Sigma AldrichP9333
Potasyum Hidroksit (KOH)FisherP250-500
Potasyum Fosfat Monobazik (KH2< / sub>PO4< / sub>)Sigma AldrichP5655
PronazSigma Aldrich10165921001
Proteinaz KInvitrogenAM2544
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma AldrichS7653
Sodyum Fosfat Dibazik (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Sigma AldrichS7907
Kapaklı ve ekli yumurtlama tankıAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + slaytlarFisher Scientific12-550-15
Süper yapıştırıcı jel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; % 0.1 Ara20; dH2O
Transfer pipetindeFisher13-711-7M
Triklorasetik Asit (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris TabanıFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Ultra ince forsepsFisher Scientific16-100-121
Su, ultra saf/çift damıtılmışFisher ScientificW2-20
MABN83230 içinde seyreltilmiş 10x stoktan yapılmıştır üretilmiştir

Kaynaklar

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376(2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991(2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein EkspresyonuKonfokal MikroskopiAntikor BoyamaDoku FiksasyonuBloklama SolüsyonuSekonder AntikorMontaj StratejileriFloresan Deteksiyonu
Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.