Hayvan çeşitliliğinin kökenlerine uzun süredir devam eden ilgimize rağmen, morfoloji, fizyoloji ve davranışın evriminin altında yatan genetik değişiklikler hakkında sınırlı bir anlayışa sahibiz. Meksika tetrası, Astyanax mexicanus, özelliklerin nasıl evrimleştiğine dair anlayışımızı ilerletmek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu balık türü, Meksika ve Güney Teksas'taki nehirlerde bol miktarda bulunan gözlü nehirde yaşayan morf (yüzey balığı) ve Kuzeydoğu Meksika'daki Sierra del Abra bölgesindeki sürekli karanlık kireçtaşı mağaralarında gelişen gözsüz mağarada yaşayan morflar (mağara balığı) olmak üzere iki morfotip olarak bulunur1. En az iki bağımsız yüzey balığı istilasından kaynaklanan bilinen 29 mağara popülasyonu vardır 2,3. Mağara ve nehir morfları birbirine bağlı kalmıştır ve laboratuvarda üremeleri kolaydır, bu da araştırmacıların mağaradaki benzersiz seçici baskılara yanıt olarak gelişen özellikleri genetik olarak haritalandırmasına olanak tanır. Örneğin, ışığın yokluğu gözlerin 4,5,6,7,8,9, pigmentin 10,11,12,13,14 ve uykunun 15,16,17,18,19 gerilemesine yol açmıştır; besin sınırlaması aşırı yemeyi20, kilo almayı21 ve yağ depolamayı22 seçmiştir; ve karanlıkta gezinmek, çevreyi algılama yeteneğinin artmasını sağlamıştır 23,24,25,26,27,28. Giderek artan sayıda araştırmacı, evrimin genetik temelini keşfetmek için bu balıktan yararlanıyor. Mağara balıklarında adaptif olan bazı özellikler insanlarda zararlı olduğundan, mağara balığı biyomedikal araştırmalar için de çekici hale gelmiştir 21,29,30,31. Tekrarlanabilirliği teşvik etmek ve yeni araştırmacılar için bir platform sağlamak amacıyla, bu JoVE Yöntemleri Koleksiyonu, hayvancılık, özellik ölçümü ve gen aktivitesinin incelenmesi için teknikler sağlar.
Başlangıç noktası olarak, Peuß ve arkadaşları tarafından gösterilen tüp bebek prosedürü. 32 , 1) üremesi zor olabilecek mağara/yüzey melezleri, 2) mikroenjeksiyonlar için tek hücreli aşama embriyoları ve 3) embriyonik fenotiplerin analizi için aşama uyumlu örnekler elde etmek için bir yöntem sağladığı için birden fazla amaca hizmet eder. A. mexicanus tipik olarak gece yumurtlar. Peuß ve diğerleri. Aydınlık-karanlık döngüsünü değiştirmek ve normal çalışma saatleri içinde gamet toplamak için hazırlanmış balıkları elde etmek için bir sistem tanımlayın. Gamet koleksiyonunun görsel gösterimi, bu adım dikkatli bir teknik gerektirdiğinden özellikle yararlıdır. Makaleleri, embriyogenez sırasında gen ekspresyon modellerinin karşılaştırılması da dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış uygulaması için gereklidir.
Luc ve diğerleri. 33 , A. mexicanus embriyolarında gen ekspresyonunu görselleştirmek için optimize edilmiş sağlam bir in situ hibridizasyon protokolü sağlar. Bir kontrol listesi (ek dosya olarak sağlanır) kullanarak bu çok günlük prosedürü basitleştirirler ve sorun giderme yönergelerini paylaşırlar. Bu yöntemin tamamlayıcısı olan Riddle ve ark. 34 , tam montajlı immünohistokimya kullanılarak yumurtadan çıkmış balıklarda gen ekspresyonunun ve protein lokalizasyonunun nasıl inceleneceğini gösterir. Yumurtadan çıktıktan ve beslenme başladıktan sonra morfotipler arasında anlamlı karşılaştırmalar yapmak için büyüme koşullarını kontrol etmek gerekir. Yetişkinlerin doğal yumurtlama yoluyla nasıl yetiştirileceğini ve diğer besin kaynaklarına kıyasla besin içeriği ve maliyet açısından önemli avantajlara sahip bir rotifer diyetinde sabit yoğunluklarda larvaların nasıl yetiştirileceğini gösterirler. İmmün boyama protokolleri, beyin, bağırsak ve pankreastaki antijenleri, yumurtadan çıktıktan 12 gün sonra başarılı bir şekilde tanır ve organ gelişiminin ve işlevinin geç aşamalarının sorgulanmasına olanak tanır. Daha da önemlisi, A. mexicanus'ta başarıyla kullanılan antikorların bir listesini sağlarlar. Luc ve arkadaşlarının kombine yöntemleri. ve Riddle ve diğerleri. genetik manipülasyonun etkilerini analiz etmek için yararlıdır.
Bu Yöntemler Koleksiyonunda, Stahl ve diğerleri. 35 , A. mexicanus'ta gen fonksiyonunu manipüle etmenin birçok yolunu tanımlar: morfolino mikroenjeksiyonu, CRISPR-Cas9 aracılı mutajenez ve Tol2 aracılı transgenez. Piko-enjeksiyonu ve enjekte edilen embriyoların taranmasını göstermenin yanı sıra, morfolinoların, kılavuz RNA'ların ve transgenlerin tasarlanması için yararlı kılavuzlar sağlarlar. Bu tekniklerin her birini doğrulayan sonuçları paylaşırlar. Örneğin, ekleme bloke edici bir morfolino kullanarak Hipokretin/oreksin'i (HCRT) hedeflemek, mağara balıklarında lokomotor aktiviteyi azaltır ve uykuyu artırır; CRISPR/Cas9 kullanarak yüzey balıklarında oca2'nin (mağara balığı albinizmine neden olan lokus) düzenlenmesi, albino yüzey balıkları üretir; ve Tol2 transgenezi kullanılarak bir pan-nöronal zebra balığı promotorörü tarafından yönlendirilen genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesinin eklenmesi, Meksika tetrasında neredeyse her yerde bulunan nöronal ekspresyon sağlar. Zebra balıklarında geliştirilen genetik araçların çoğunun, benzer genomları nedeniyle doğrudan mağara balıklarına aktarılabileceğine dikkat çekiyorlar. Makaleleri, A. mexicanus'ta fonksiyonel çalışmalar yapan araştırmacılar için önemli bir kaynaktır ve davranış da dahil olmak üzere fenotipleri ölçmeye odaklanan ek makaleleri tamamlar.
Mağara balıkları uykuyu önemli ölçüde azalttı ve sirkadiyen ritmi değiştirdi 36,37,38. Bu, bir omurgalıda uykudaki varyasyona genetik ve çevrenin katkısını araştırmak için heyecan verici bir fırsat sunuyor. Jaggard ve diğerleri. 39, farklı yaşam evrelerinde ve farklı bağlamlarda uykuyu kaydetmek için kullanılabilecek ucuz malzemelerden bir sistemin nasıl oluşturulacağını gösterir. Ayrıca, bu kurulumda balık takibinin nasıl otomatikleştirileceğini ve uyku ve hareket için nicel ölçümlerin nasıl elde edileceğini açıklarlar. Teknikleri, yüksek verimli ilaç ve genetik taramanın yanı sıra geleneksel genetik haritalama çalışmaları için de geçerlidir.
Azalan uykuya ek olarak, mağara balıkları, değişen beslenme açısı ve titreşim çekimi 16,30,40 dahil olmak üzere, yiyecek aramayla bağlantılı lokomotor aktivitelerde farklılıklar geliştirmiştir. Bu faaliyetlerin nasıl geliştiğini anlamanın merkezinde, onları gelişimsel değişikliklerle ilişkilendirmek yer alır. Worsham ve diğerleri. 41 davranışları kaydetmek ve bunları nöromastlardaki değişikliklerle ilişkilendirmek için mevcut yöntemler; su akışına tepki veren dış mekanosensoriyel yapılar. İlk olarak, titreşim çekimini ve uykuyu kaydetmek için odaların nasıl oluşturulacağını gösterirler ve özgür yazılım ve özelleştirilebilir komut dosyaları kullanarak davranışların nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir açıklama sağlarlar. Daha sonra, bir floresan mitokondriyal boya kullanarak canlı yetişkin balıklarda nöromastların nasıl görselleştirileceğini ve yine özgür yazılım kullanarak nöromast sayısının yarı otomatik bir şekilde nasıl ölçüleceğini gösterirler. Titreşim çekimi ve nöromast sayısı23 ile ilişkilidir; Yöntemleri, bu ilişkiyi sorgulamak için adım adım bir protokol sağlar. Jaggard ve Worsham'ın yöntemleri, ek davranışları ortaya çıkarmak için kullanılabilir ve diğer balık türlerine de uygulanabilir. Bu yöntemler, davranışsal evrimin genetik temelini keşfetmek için gerekli olan nicel ve tutarlı sonuçlar üretir.
Gen fonksiyonunu ölçmek ve manipüle etmek için modern teknikler, evrimsel çalışmaları karşılaştırmalı çalışmalardan mekanik hale getirmiştir. Birleştirildiğinde, bu Yöntemler Koleksiyonundaki makaleler, A. mexicanus'ta gen fonksiyonu araştırmalarını yürütmek için bir rehber kitap görevi görür. Araştırmacılar, yüzey ve mağara morfları arasındaki morfoloji, fizyoloji ve davranışta büyüleyici farklılıklar ortaya çıkarmış olsa da, henüz ayrıntılı olarak keşfedilmemiş ve muhtemelen keşfedilecek daha çok şey var. Daha fazla çalışma yapıldıkça, bu küçük balık evrim anlayışımız üzerinde büyük bir etkiye sahip olmaya devam edecek.