Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Summary

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Abstract

Omurgalı sinir sisteminin gelişimi karmaşık hücresel davranışlar ve etkileşimlerin hassas bir koordinasyon gerektirir. Vivo görüntüleme tekniklerinde yüksek çözünürlüklü kullanımı, canlı organizmada bu süreçlere açık bir pencere açabilir. Örneğin, hücreleri ve bunların dölleri sinir sistemi formları olarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir bölme. Son yıllarda, çok renkli tekniklerde teknik gelişmeler araştırılabilir soru türlerini genişletti. Çok renkli Brainbow yaklaşımı sadece hücreler gibi ayırt etmek için değil, aynı zamanda her bir ata hücresi türetmek ilgili hücrelerin birden fazla farklı klonları renk kodu için kullanılabilir. Bu, geliştirme sırasında birçok farklı klonların ve davranışlarının aynı anda çok katlı bir soy analizine olanak tanır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz. Bu, özellikle geleneksel promotör odaklı renkleri kullanarak farklı bir şekilde etiketlemesi zor olan hücreler arasındaki hücresel etkileşimleri takip etmek için yararlıdır. Yaklaşımımız aynı anda birden fazla farklı klon lar arasındaki soy ilişkilerini izlemek için kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak oluşturulan büyük veri kümeleri, genetik veya farmakolojik manipülasyonlar arasında nicel olarak karşılaştırılabilen zengin bilgiler sağlar. Sonuçta oluşturulan sonuçlar sinir sisteminin nasıl geliştiği hakkında sistematik sorulara cevap yardımcı olabilir.

Introduction

Gelişimin ilk aşamalarında, özel leştirilmiş progenitor hücrelerinin havuzları proliferatif bölgelerde tekrar tekrar bölünür ve farklı kız hücreleri dizileri üretir. Bu gelişim döneminde doğan hücreler daha sonra farklılaşır ve yeni doğan organları oluşturmak için seyahat ederler. Sinir sisteminde radyal glia gibi atalar ventriküler bölgelerde olgunlaşmamış nöronlara yol açar. Nöronlar ventriküllerden uzaklaşır ve olgunlaşırken, genişleyen doku sonunda beynin son derece karmaşık yapılarını oluşturur^1,2,3,4,5

Protocol

Hayvan denekleri ile ilgili prosedürler Lewis & Clark Koleji'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Zebrabalığı Embriyolarının Mikroenjeksiyonu

1. Mikroenjeksiyonlar^39,40gerçekleştirmeden önce öğleden sonra seks ayrılmış çiftleme tankları vahşi tip, yetişkin zebra balığı kurmak.
2. Mikroenjeksiyonların olduğu sabah DNA çözeltisini hazırlayın. Seyreltik hsp:Zebrabow¹¹ plazmid DNA 0.1 mM KCl ~10 ng/μL konsantrasyonu, birlikte 2.5% fenol kırmızı ve 3.75U Cre rekombingaz enzim.
3. 45 dk ....

Results

Bu bölümde, burada açıklanan in vivo çok renkli hızlandırılmış görüntüleme yaklaşımı kullanılarak elde edilebilen sonuçlara örnekler gösterilmektedir. Gelişmekte olan zebra balığı^hindbrain14 proliferatif ventriküler zonlarında hücrelerin Brainbow renk kodlu klonları göstermek(Şekil 1).

Tipik olarak, Brainbow etiketli hücreler belirli bir radyal lif boyunca düzenlendiğinde, göreceli RGB kanal ağırlıkları olarak ölçülebilen aynı rengi

Discussion

Bu protokol, gelişmekte olan zebra balığı arka beyninde progenitor hücreleri ve nöronların klonlarını görselleştirmek ve Brainbow ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi¹¹kullanarak in vivo onları takip etmek için bir yöntem açıklar. Bu protokolün in vitro veya ex vivo çalışmalara kıyasla en büyük avantajı, omurgalı beyninin proliferatif bölgesini zaman içinde doğal ortamında doğrudan gözlemleyebilme yeteneğidir. Bu teknik retroviral vektörler kullanarak tek bir klon etiketli önceki çalışmalar üzeri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL transfer pipeti (ince uçlu)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-fenil-2-tiyoüre (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Embriyo pigmentasyonunu önlemek için E3'te 0,2 mM'ye seyreltilmiş
50 mL konik tüpler	Corning	352070	Isı şoku veren embriyolar için
6 lb naylon misina	SecureLine	NMT250	Embriyo manipülatörleri yapmak için
7,5 mL transfer pipeti	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881 E3
Pamuklu çubuklar	Püriten	867-WC TUTKAL YOK	Embriyo manipülatörleri yapmak için
Cre rekombinaz	New England Biolabs	M0298M
Dijital kuru banyo	Genemate	490016-616	LMA'yı 42 &°C'de depolamak için kullanılır; C
Epifloresan diseksiyon kapsamı
Cam kılcal tüpler	Dünya Hassas Aletler	TW100F-4
İnkübatör	Forma Scientific	3158	Embriyoları 28 ° C'de tutmak için; C
Enjeksiyon plakası kalıpları	Uyarlanabilir Bilim Araçları	TU-1
Isotemp su banyosu	Fisher Scientific	2320	Isı şoku veren embriyolar için
KCl	AMRESCO	0395	E3 ve enjeksiyonlar için DNA çözeltisi için
Lazer taramalı konfokal mikroskop	Zeiss	LSM710
LE agaroz	Genemate	E3120	Oluşturmak için agaroz enjeksiyon plakaları
Düşük eriyik agaroz (LMA)	AMRESCO	J234
Çiftleşme tankları	Aquaneering, Inc.
MgSO4	için	M9140	E3
Mikromanipülatör	Dünya Hassas Aletler	M3301
Mikropipet Çektirme	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Trikain-S	Batı Kimya A.Ş.		Ters ozmoz (RO) suyunda 4 mg / mL'de yapılan stok, daha sonra embriyoları uyuşturmak için 0.2 mM'lik nihai konsantrasyona E3'e damla damla eklenir
NaCl	J.T. Baker	4058-01	E3
Petri kapları için (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	Embriyoları barındırmak ve görüntüleme odası oluşturmak için (60 mm)
Fenol kırmızısı	Sigma	P0290
Yumuşak dikişli halka işaretleyiciler	Yonca İğne Sanatı, Inc.	354	Petri kabı ile görüntüleme odası oluşturmak için
Süper yapıştırıcı (Ultra jel kontrolü)	Loctite	1363589	Embriyo manipülatörleri yapmak için
Şırınga iğneleri	Beckton Dickinson	BD329412	Embriyoların dekoryonasyonu için