Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Yirmi yıl önce, hangi hyphal morfogenez ve altta yatan moleküler hücre biyolojisi filamentöz mantarlar görselleştirilmiş olabilir şekilde membran seçici floresan Fei Mao boya FM 4-64¹uygulanması ile devrim oldu . Daha sonra, mantar hücre duvar dinamiklerinin hayati floresan belirteci olarak kitin bağlayıcı boya Calcofluor Beyaz yararı^{gerçekleştirildi 2}. O zamandan beri, hem boyalar hem de bunların varyantları mantarlarda organel dinamiklerinin canlı hücre görüntüleme analizlerinin doğal bir parçası haline gelmiştir ve ipliksi mantar yaşam tarzına benzeri görülmemiş içgörüler sağlamaya devam etmektedir. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo- ve eksositoz ve hücre duvarı morfogenezi nin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır. Endositon izleme tahlilleri, endositon genel çalışması ile ilgili çeşitli hücre biyolojik soruların ele alınmasını sağlar³. Bunun için FM boya ilavesi üzerine lekeli bölmelerin lokalizasyonu, hızı ve devamı zaman atlamalı mikroskopi ile kaydedilir ve test edilen mantar suşları arasında nicel olarak karşılaştırılır^4. Hücre duvar boyaları hücrenin dış sınırını çizgive polarize hiphal uç büyüme 2 dahil olmak üzere morfogenetik olayların izlenmesine izin^,hiphal dallanma⁵, hyphal füzyon^6,7 ve septum oluşumu⁸. Ayrıca lokalize hücre duvarı birikiminin sayısallaştırılmasını ve hücre duvarı biyogenezi sırasında kusurların belirlenmesini kolaylaştırın^9. Herhangi bir floresan belirteç biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ayrıntılı bilgi onun başarılı in vivo uygulaması için temel bir ön koşul olduğundan, bu özellikleri ilk bu makalede özellikli altı boyalar için özetlenmiştir.

Membran selektif boyalar
FM (Fei Mao) styryl boyalar geçemeyen ama biyolojik membranların lipid çift katmanlı dış broşür ile geri dönülmez küçük amfilik^{moleküller10}. Onlar sulu çözeltide hemen hemen floresan olmayan, ancak plazma membran entegrasyonu üzerine yoğun floresan hale, mükemmel sinyal-to-gürültü üreten (S / N)-oranları¹¹. Bu özellikler onları ideal plazma membran ve hücre içi organel dinamikleri görselleştirmek için uygun hale, endo izleme de dahil olmak üzere- ve eksoz¹². Yeşil floresan FM 1-43 ve kırmızı floresan FM 4-64 bu amaçlar için en yaygın olarak kullanılan iki floresan membran belirteçleridir. SynaptoGreen C4 ve SynaptoRed C2, sırasıyla FM 1-43 ve FM 4-64 yerine birbirinin yerine kullanılabilen alternatif tedarikçilerden gelen jenerik moleküllerdir.

Styryl boyalar üç önemli yapısal bölgeden oluşur: (1) boyanın lipid çift katmanlı içine yerleştirilmesini kolaylaştıran lipophilic kuyruk, (2) boyanın spektral özelliklerini belirleyen ve bir ila üç çift bağ ile birbirine bağlanmış iki aromatik halkadan oluşan florofor çekirdeği ve (3) boyanın membrandan tam olarak takılmasını ve permeasyonunu engelleyen pozitif yüklü hidrofilik kafadan oluşur (Şekil 1A).

Uzun lipophilic kuyruk, yüksek boya hidrofobiklik ve böylece membrana yakınlık bağlayıcı, ama alt su çözünürlüğü ve membran de-boyama oranı. Sonuç olarak, farklı FM boya çeşitleri farklı boyama dinamiği ve desenleri üretir. C4 kuyruklu FM 1-43'ün yüksek hidrofobikliği, equimolar konsantrasyonlarda uygulandığında plazma zarlarında ve iç organellerde daha hızlı bir şekilde daha güçlü ve daha kararlı floresan sinyali sağlar 4-64 kısa C2 kuyruklu FM 4-64'ten daha hızlıdır (Şekil 2).

Daha da önemlisi, her iki FM boyasının^11'in insaedilen sabit ve yüksek ilişkilendirme/ayrışma oranları, her bir boya molekülü 13'ün ortalama tutma süreleri^13'ün membran işlevinin lokalize bozulması olasılığını azaltır, örneğin membran akışkanlığının modifikasyonu veya membran proteinlerinin zorunlu kalıcı etkileşimi yoluyla. Bu moleküllerin hayati boyalar olarak kullanılabilmesinin en önemli nedeni muhtemelen budur. Bununla birlikte, 50 μM üzerindeki FM boya konsantrasyonları mantar ve bitki^{hücreleri2,14}için toksiktir ve BY-2 tütün protoplastlarından elde edilen kanıtlar 20'den fazla mM FM boyanın plazma membran doygunluğu14'e yol gösterdiğini göstermektedir. Bu nedenle, özellikle mükemmel görüntüleme gibi az 2-5 μM^15,16ile elde edilmiş olduğu göz önüne alındığında, bu sınırı aşmamak tavsiye edilir.

Özellikle, FM boyalarının spektral özellikleri belirli membran mikroortamına bağlı olarak büyük ölçüde değişir (gözden^14). Genel olarak, saf çözücü çözeltilerde FM boyalarının uyarma ve emisyon spektrumları (genellikle ürün bilgilerinde belirtildiği gibi) hücresel ortamlardan önemli ölçüde farklıdır ve çoğu durumda canlı hücre görüntüleme ayarlarını seçmek için doğrudan danışılamaz. Örneğin FM 1-43 ve FM 4-64'ün uyarma/emisyon maksimması, metanoldeki çözümlerine göre mantar membranlarına bağlandığında sırasıyla 37/46 nm ve 43/64 nm ile mavi ye kaydırılır hale gelir (Tablo 1).

FM 4-64 ve FM 1-43'ün plazma zarını, endo-/exositozisin ve spitzenkörper ve mitokondri dahil organel dinamiklerinin izlenmesi için temel leri, daha önce^2,4,17,18,19filamentöz mantar türlerinin geniş bir yelpazesi için kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir. Çeşitli ipliksi mantar türlerinde çalışan her iki FM boyası için önerilen görüntüleme ayarları Şekil 1B'degösterilmiştir. Ancak, mevcut ekipmanın veya kültür ortamı, pH veya sıcaklık gibi belirli hücresel ve deneysel koşulların teknik sınırlamaları bazı adaptasyonlar gerektirebilir. Neyse ki, FM boyalar geniş bir spektral aralıkta çalışır ve çok iyi görüntüleme sonuçları heyecan verici FM 1-43 ile elde edilir 514 nm veya FM 4-64 ile 488 nm. Sonuç olarak, her örnek türü ve amaçlanan uygulama için en uygun görüntüleme ayarları ayrı ayrı belirlenmelidir.

Stoke'un 135 nm'den fazla FM 4-64'ün yer değiştirmesi, yeşil ışık yayan floroforlarla mükemmel, eşzamanlı ortak görüntüleme sağlar; bu sık sık plazma membran ve endositik yol^9,20göre yeşil floresan protein (GFP) etiketli füzyon proteinlerin hücre içi lokalizasyon dinamikleri değerlendirmek için yararlanılır.

Hücre duvarı seçici boyalar
Calcofluor White M2R (CFW), ayrıca Floresan Parlatıcı 28 olarak pazarlanan, muhtemelen bakterilerin hücre duvarları leke için kullanılan en iyi bilinen floresan boya, mantar, yosun, yüksek bitki ve böcekler. Başlangıçta kağıt, tekstil ve deterjan sektöründe optik beyazlatma ajan olarak kullanılan, mantar enfeksiyonlarıklinik tanı için faydaları erken gerçekleştirildi^21,22. CFW geri dönüşümsüz olarak yeni doğan kitin zincirine müdahale ettiği için hücre duvarı biyogenezi sırasında normal kitin mikrofibril montajını bozar ve hücre duvarı stresi oluşturur²³. Bu sırayla glukan ve chitin synthase aktivasyonu 24 ,²⁵sonucu olarak yerelolarak yükseltilmiş hücre duvarı birikimine yol açan bir hücre duvarı hasar onarım mekanizması tetikler . Bu fenomen hücre duvar polimerlerine uygun şekilde bağlanarak çalışan herhangi bir boya ile oluşabilir, konsantrasyona bağlıdır ve en çok misel in en verimli büyümesini ve dolayısıyla en hassas kısımlarını temsil eden hyphal uçlarında fark edilir (Şekil 3). Hücre duvarı hasarına yanıt veren moleküler makinenin kapsamlı bir özeti son zamanlarda²⁶sağlanmıştır.

Fototoksisite ile birlikte aşırı boya hyphal kompartmanlarının hızlı hücre lizisine yol açabilir(Film 1). Bununla birlikte, yabani tip "hayati" olan boya konsantrasyonlarına karşı artan duyarlılık, işlevsiz mutantların hücre duvarı biyosentezindeki kusurları belirlemek için kullanılabilir⁹. CFW ve Kongo Kırmızısı (CR) için, Direct Red 28 olarak da bilinen ve mantar ve böcekler için α ve β-kitin spesifik hücre duvarı lekesi olarak kullanılan başka bir tekstil renklendiricisi^27,28, chitin sintazları kuvvetle indükleyen eşik konsantrasyonları > 60 μM CFW ve > 70 μM CR, sırasıyla, konsantrasyonları <15 μM ya boya değiştirmek veya mantar büyümesini inhibe etmedi^29,30,31. Hickey ve ark. CFW için bu eşik konsantrasyonu 25 μM²yerleştirilir. Bu nedenle, boya konsantrasyonları ≤ 5 μM strese bağlı eserler dışlamak ve gerçekten "hayati floresan boyalar"^2,32olarak bu moleküllerin kullanılmasını sağlamak için kullanılması tavsiye edilir. Bu eşit Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) ve Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), Direct Yellow 86 ve Direct Red 23, sırasıyla, mantar için uygulama daha on yıl önce 33 önce ilk kez bildirilmiştir diğer iki yararlı hücreli duvar boyaları eşanlamlı için geçerlidir³³. Ama onların olağanüstü spektral özellikleri rağmen^34,35, her iki boya kullanımı o zamandan beri çok sınırlı olmuştur^36,37. Daha önce 1,5 μM CFW²için gösterildiği gibi, 2 μM SPF çok yüksek zamansal çözünürlük(Film 2)ile yerel koşullar altında hücre duvarı dinamikleri çözmek için yeterlidir. Aynı sonuçlar 2 μM CR veya PFS ile elde edilebilir.

Bu dört boya, CFW, SPF, PFS ve CR birlikte, modern floresan mikroskoplarda kullanılan neredeyse tam görünür emisyon ışık spektrumu (400-700 nm) kapsayan bir dizi hücre duvarı seçici floresan belirteçleri içerir (Şekil 4). Hücre duvarı polimerlerine bağlanma üzerine floresan yoğunluğundaki önemli artış dört polimerin de doğasında vardır ve mükemmel S/N oranları oluşturur. Bu sırayla boya konsantrasyonları ve uyarma ışık yoğunluğu çok düşük tutmak için izin verir ve "düşük doz" canlı hücre görüntüleme tekniği²olarak hücre duvarı boyama gerçekleştirmek için izin verir. Bu hücre duvar boyaları plazma zarı geçirimsiz olduğundan, aynı anda canlı/ölü lekeleri olarak işlev görürler. Özellikle, onların son derece geniş emisyon ışık spektrumları nedeniyle, diğer floroforlar ile CFW ve SPF co-görüntüleme özellikleri ile ilgili bazı sınırlamalar dikkatle dikkate alınması gerekir.

1. Mantar örneklerinin hazırlanması

1. Mantar öncesi kültürler
   1. Trichoderma atroviride veya Vogel'in Minimal Medium (VMM) için trichoderma atroviride veya Vogel's Minimal Medium (VMM) nörospora crassa için patates dekstroz agar (PDA) gibi uygun bir katı agar orta üzerinde istenilen zorlanma aşılamak. Transformant suşları ile çalışırken uygun bir seçim işaretçisi ekleyin.
   2. Organizmanın en uygun sıcaklığında ön kültürü kuluçkaya yatırın. Örneğin, T. atroviride atroviride atroviride atroviride atroviride at. 30 °C'de N. crassa, ve 12 h/12 h ışık/karanlık döngüleri bir sporulating misel gelişmiş ama henüz plaka kenarına ulaşmadı kadar. Standart boyutta petri kabı (9.2 cm Ø), bu 4-6 gün ortalama vahşi tip T. atroviride alır, N. crassa yabani türü ortalama 3-4 gün sonra bu aşamaya ulaşır.
2. Mantar kolonilerinin yetiştirilmesi
   1. Steril bir neşter kullanarak, pre-kültür koloni kenarından sporulating olmayan misel taşıyan küçük bir 3 mm x 3 mm agar blok kesti.
   2. Deneysel kültürü aşılamak için taze bir katı orta plaka nın ortasına agar blok yerleştirin.
   3. Deneysel kültürü, araştırılması amaçlanan gelişim aşamasına göre kuluçkaya yatırın. Örneğin, yabani tip T. atroviride PDA üzerinde yaklaşık 2 cm çapında koloniler geliştirmek için karanlıkta 20-22 saat gerektirir, yabani tip N. crassa vmm üzerinde karanlıkta 30 °C'de 30 °C'de 14-16 h kuluçka dan sonra yaklaşık 4 cm koloni çaplarına ulaşır.
      NOT: Karanlıkta kuluçka otofloresans alabilen pigmentlerin oluşumunu önler. Orta arka plan floresanını deneysel kültürden ortadan kaldırmak için, agar'ı şeffaf bir katılaştırıcı maddenin %1,5 w/v'u (Malzeme Tablosunabakınız) ve tanımlanmış en az ortama sahip herhangi bir karmaşık ortamla değiştirin.
3. Katı çimlenme kültürlerinin yetiştirilmesi
   1. Kültür öncesi plakadan konidial sporları hasat etmek ve ortaya çıkan spor süspansiyonunu 15 mL'lik vidalı bir tüpte toplamak için 5 mL steril fizyolojik tuz çözeltisi (%0,9 w/v NaCl) kullanın.
   2. Spor süspansiyonu güçlü girdaplarla iyice karıştırın ve daha sonra 1 cm x 5 cm'lik steril filtre kumaşının üzerine süzün (Malzeme Tablosunabakın) 1 mL'lik pipet ucuna (önceden monte edilmiş ve otoklavlanmış) taze steril bir boruya doldurulmuş.
   3. Bir hücre sayma odası ile spor yoğunluğunu belirleyin ve fizyolojik tuz çözeltisi ile 1 x 10⁷ hücre/mL spor süspansiyonu hazırlayın.
      NOT: Spor süspansiyonu 4 °C'de iki haftaya kadar tutulabilir.
   4. 20 mL katı orta boy standart boy Petri kabı (9,2 cm Ø) hazırlayın ve üzerine 15-20 steril cam boncuk (3 mm Ø) ekleyin.
   5. Pipet 200 μL spor süspansiyonorta plaka üzerine ve eşit nazik sallayarak tüm plaka boyunca hücreleri dağıtmak. Yeniden kullanmak için% 70 etanol ile bir beher içine cam boncuk toplamak.
   6. Deneysel kültürü, araştırılması amaçlanan gelişim aşamasına göre kuluçkaya yatırın. Örneğin, T. atroviride yabani türü PDA üzerinde conidial germlings geliştirmek için karanlıkta 25 °C'de 5-6 saat gerektirir, N. crassa yabani türü vmm üzerinde karanlıkta 30 °C'de 30 °C'de kuluçka 3-4 saat sonra conidial mikroplar gelişir.
      NOT: Herhangi bir orta arka plan floresanını deneysel kültürden ortadan kaldırmak için, agar'ı şeffaf bir katılaştırıcı maddenin %1,5 w/v'u ve tanımlanmış bir minimal ortama sahip herhangi bir karmaşık ortamı değiştirin.
4. Sıvı mikrop kültürlerin ekimi
   1. 8 kuyulu bir mikro-slaytın her kuyusuna 190 μL likit kültür ortamı doldurun.
   2. 1 x 10⁷ hücre/mL spor çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin (1.4.1-1.4.3 adımlarında hazırlanır) ve birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Ortaya çıkan toplam hücre sayısı kuyu başına 1 x 10 5'tir.
   3. Deneysel kültürü, araştırılması amaçlanan gelişim aşamasına göre kuluçkaya yatırın. Örneğin, yabani tip T. atroviride patates dekstroz suyu (PDB) içinde conidial germlings geliştirmek için karanlıkta 25 °C'de 5-6 saat gerektirir, yabani tip N. crassa ise sıvı VMM karanlıkta 30 °C'de 30 °C'de kuluçka 3-4 saat sonra conidial mikroplar geliştirir.

2. Boya çalışma çözümlerinin hazırlanması

1. Her boyanın tam çözünürlüğünü garanti etmek için, uygun miktarda (Tablo 1'deki tam ağırlıkları görün) %100DMSO'ya ekleyerek dimetil sülfoksitte (DMSO) 2 mM stok çözeltisi hazırlayın ve girdap ile iyice karıştırın.
   DİkKAT: DMSO'yu septumla kapatılmış bir şişeden aldığınızdan emin olun; şeffaf bir sıvı olmalıdır. Hava ile temas üzerine, DMSO kahverengi döner -muhtemelen iz kirlerinin oksidasyonu nedeniyle-ve olumsuz hücre büyümesini veya boya boyama etkileyebilir.
2. Filtre, stok çözeltisini 0,2 μm şırınga membran filtresinden taze steril 1,5 mL reaksiyon tüpüne sterilize edin. Boya beyazlatma en aza indirmek için, alüminyum folyo tüp sarın.
   NOT: Boya stok çözeltisi, erime/donma döngülerini önlemek için daha küçük hacimlerde kullanılabilir ve 4 °C'de birkaç ay bekletilebilir.
3. 198 μL steril distile suyun 198°L'inde 2 μL boya çözeltisini temiz steril 1,5 mL reaksiyon tüpünde eriterek 20 μM sulu boya çözeltisi hazırlayın. Boya beyazlatma en aza indirmek için, alüminyum folyo tüp sarın.
   NOT: Boya çalışma çözeltisi deney gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
4. Numune montajı sırasında (bkz. bölüm 3), boya çalışma çözeltisi standart olarak 1:10 oranında seyreltilecek ve son boya konsantrasyonu 2 μM ve %0,1 w/v son DMSO konsantrasyonu elde edilecektir.
   NOT: Boya çözeltisi ile montaj sıvısı arasındaki hacim oranını değiştirerek farklı seyreltme faktörlerinin seçilmesi, istenilen son boya konsantrasyonunu kolayca adapte etmenizi sağlar.
   DİkKAT: Boya veya DMSO toksisitesi nedeniyle istenmeyen etkileri önlemek için, seyreltme faktörü 5 μM boya ve% 0.4 w / v DMSO maksimum son konsantrasyonları neden 1:4 altına düşmemelidir. Daha yüksek boya konsantrasyonları hızlı bir şekilde sistemi doygunlaştırır ve güvenilir sinyal miktarını önlerken, %0,5'ten fazla w/v (≥ 62,5 mM) DMSO hücre gelişimini bozabilir³⁸.

3. Mikroskopi için numune hazırlama

1. Ters agar blok yöntemiile mantar kolonilerinden (adım 1.2) veya katı çimlenme kültürlerinden (adım 1.3) montaj örnekleri.
   1. Temiz 24 mm x 60 mm cam kapak kaymasını (#1 = 0,13-0,16 mm kalınlıkta) hazır tutun ve 18 μL sıvı minimum ortam (VMM veya M9) veya fizyolojik tuz çözeltisini merkeze ekleyin.
   2. 18°L'lik sıvıya 20°M boya çözeltisinin 2 μL'sini ekleyin ve hava kabarcıklarının üretimini önlerken birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.
      NOT: Birkaç numune ile çalışırken, deney boyunca eşit boya konsantrasyonu sağlamak için herkes için sıvı boya çözeltisinin ana karışımını hazırlamaları tavsiye edilir.
   3. Temiz bir neşter ile koloninin veya katı mikrop kültürünün çevresinden 15 mm x 15 mm'lik bir numune kesip orta damlanın yanına dikey olarak yerleştirin.
   4. Bloğun üst kenarını desteklemek için neşter ve bloğun arka tarafını yerinde tutmak için bir parmak kullanarak, misel veya mikropları sıvının üzerine taşıyan tarafı yavaşça indirin. Örnek artık mikroskop aşamasına aktarılmaya hazır.
      DİkKAT: Hücreler üzerindeki mekanik stresi en aza indirmek ve numune ile kapak kaymaları arasında sıkışmış hava kabarcıklarını önlemek için bunu yavaş ve dikkatli bir şekilde yapmak esastır.
2. 1.4 adımdan sıvı mikrop kültürleri monte edin.
   NOT: En uygun şekilde, odacıklı mikro-kuyu slaytlarında sıvı mikromling kültürleri doğrudan transfer edilebilir ve mikroskop aşamasında daha fazla manipüle edilebilir.
   1. 200 μL sıvı ortama 22 μL boya çözeltisi ekleyin ve standart son konsantrasyonlarda 2 μM boya ve %0,1 w/v DMSO elde edin.
      NOT: Sıvı mikrop kültürleri floresan boyalar (veya inhibitörler gibi diğer kimyasallar) de kayıt sırasında, deneyin istenilen herhangi bir zaman noktasında eklenebilir büyük bir avantaja sahiptir. Bu durumda, hücreleri rahatsız etmemek için sıvı damlalarını çok yavaş yönetmek için özel bakım alınmalıdır. Sistem titreşimleri ve Brown hareketi zaten bazı hücre hareketi tanıtmak olabilir.

4. Canlı hücre mikroskopisi

1. Temel görüntü edinme ayarlarını ayarlayın. Aşağıdaki görüntü edinme ayarları, tek tek hyphae boyama dinamikleri yakalamak için izin verir ve aşağıdaki tahlillerin her ikisi için de geçerlidir
   1. Cihazın tam çıkış gücünün %20'si kadar %5-10 lazer gücü uygulayın.
   2. Yüksek sayısal diyafram ≥ ile Bir Plan Apo 60x-63x gliserol veya su daldırma hedefi kullanın.
   3. 1024 x 256 piksel görüntü boyutu ayarlayarak ve 2-3 optik zum faktörü kullanarak görüntü edinme alanını hiphae'nin anahattıyla sınırlandırın.
   4. 400 Hz ile çift yönlü tarama kullanın.
   5. En hassas dedektörün kazancını %100'e ayarlayın.
   6. Zaman atlama kaydı için, boya ağartma veya fotoğraf stresi üretmeden makul zamansal çözünürlük sağlamak için her 15 s bir kare ile görüntü edinimi başlatın.
   7. 3B kayıt için, makul uzamsal çözünürlük sağlamak için hiphae ve uzay optik bölümleri 1 μm arayla sınırına üst ve alt mekansal sınırı ayarlayın.
      NOT: Hyphae'nin hızlı büyümesi nedeniyle, Z eksenindeki yüksek uzamsal çözünürlük genellikle X/Y ekseninde veya başka bir şekilde yüksek zamansal çözünürlük için feda edilmiştir. Sadece çok modern confokal lazer tarama mikroskoplar her iki talebi karşılamak için yeterince hızlı.
2. Endositon alımı tahlilleri
   1. Mikroskopi sisteminde bulunan FM 1-43 ve/veya FM 4-64 için en iyi uyarma/emisyon ayarlarını belirlemek ve buna göre ayarlamak için Şekil 1 ve Tablo 1'e başvurun.
      NOT: Önerilen 2 μM konsantrasyonu ile plazma zarına FM boyasının eklenmesi normal sağlıklı hücrelerde anında gerçekleşir. İlk plazma zarından tübüler vakuollerde boya görünümüne kadar tüm süreç genellikle oda sıcaklığında 30-45 dakika içinde tamamlanır. FM boya konsantrasyonu arttırmak S/N oranını artırır ve böylece daha yüksek kontrastlı görüntüler üretir. Bununla birlikte, organel boyamanın kronolojik ardışık atasını ayırt etmeyi zorlaştırarak etiketleme işlemini de hızlandırır.
   2. Yukarıdaki önerilen temel görüntü edinme ayarlarını kullanarak görüntü kaydını başlatın ve sonuçları değerlendirin.
   3. Denemenin odaklandığı plazma zarı veya endositon dinamiği nin yönünü yakalamak için gereken mekansal ve zamansal çözünürlüğe görüntü kazanım ayarlarını optimize edin.
   4. Örneğin, X/Y'de çok hızlı dinamikleri yakalamak için, genel görüntü boyutunu, görüntüyalnızca bir odak düzlemini küçültün ve tarama hızını 1 fps'ye yükseltin. Z ekseninde daha yüksek çözünürlük için X/Y çözünürlüğünü azaltın, görüntü boyutunu küçültün ve optik kesitler arasındaki mesafeyi 0,5 μm'ye düşürün.
3. Hücre duvarı dinamiği
   1. Mikroskopi sisteminde bulunan uygulanan hücre duvar boyası için en iyi uyarma/emisyon ayarlarını belirlemek ve buna göre ayarlamak için Şekil 4 ve Tablo 1'e başvurun.
      NOT: Geniş emisyon spektrumları nedeniyle, CFW ve SPF, ağırlıklı olarak GFP olmak üzere diğer floroforlarla eşzamanlı eş zamanlı görüntüleme için uygun değildir. Bazı kısıtlamalar bile bu boyalar ile sıralı görüntüleme yaklaşımları için geçerlidir, ve böylece ayrı ayrı optimize edilmesi gerekir.
   2. Yukarıdaki önerilen temel görüntü edinme ayarlarını kullanarak görüntü kaydını başlatın ve sonuçları değerlendirin.
      NOT: Önerilen 2 μM konsantrasyonu ile, hücre duvarına boya eklenmesi mutlaka anlık değil, makul derecede hızlıdır. Septum oluşumunun tüm süreci, örneğin, oda sıcaklığında yaklaşık 5-7 dakika oda sıcaklığında²⁰ortalama alır. Hücre duvar boyası konsantrasyonu artırmak S / N-oranı nı artırır ve böylece daha hızlı yüksek kontrast görüntüleri üretir. Ancak, aynı zamanda hızla indüklenen hücre duvarı hasar onarım nedeniyle eserler tanıttı.
   3. Görüntü edinme ayarlarını, bölüm 4.2.3'te belirtildiği gibi, deneyin odaklandığı hücre duvarı morfogenezinin yönünü yakalamak için gereken mekansal ve zamansal çözünürlüğe optimize edin.

Nicel görüntü analizi
Hücresel süreçleri "sadece" görselleştirmenin yanı sıra, canlı hücre görüntülemesi kaydedilen verilerden nicel bilgiler elde etmenizi sağlar. Genel olarak, nicel görüntü analizi olan uygun tartışma bu makalenin kapsamı çok ötesinde karmaşık bir konudur, dolayısıyla, okuyucu özel ders kitapları ve makaleler39,40,41sevk edilir. Bununla birlikte, aşağıdaki örnek verilerle ilişkili bazı temel yönergeler sağlanmaktadır. Görüntü nicelemesine izin vermek için birkaç önemli önkoşul karşılanmalıdır: (1) floresan boyaların tanımlanmış molariteleri doğru göreli karşılaştırmasağlamak için tüm numunelere uygulanmalıdır; (2) görüntü edinme ayarları emisyon ışık dedektörleri asla doymuş asla bir şekilde ayarlanmalıdır, aksi takdirde maksimum yoğunlukları kesilir; (3) görüntü edinme ayarları tutarlı bir deneysel set sırasında sabit kalmalıdır, aksi takdirde yapay yoğunluk değişiklikleri tanıtılır; (4) görüntü verileri, tüm enstrüman ayarlarını içeren meta bilgilerle birlikte bilgi kaybız bir dosya biçiminde kaydedilmelidir; ve (5) görüntü analizi, istenen nicel bilgileri ayıklamak için gereken en az sayıda işlem sonrası adımla sınırlandırılmalıdır.

Genellikle, kaydedilen sinyallerin mutlak niceliklenmesine olanak sağlayacak tanımlanmış standartlar canlı hücrede mevcut değildir. Bu nedenle, en basit haliyle, nicel görüntü analizi, aynı görüntüdeki piksel yoğunluklarının veya aynı ayarlarla kaydedilen farklı görüntüler arasındaki göreli karşılaştırmasına dayanır. Üreticinin mikroskop kontrol yazılımı normalde görüntü sonrası işleme ve nicel analiz için temel araçları içerir veya görüntü bölümleme, eşik, oran görüntüleme, vb için ek fonksiyonlar ile yükseltilebilir. ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), buzlu (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS Biyoimage Bilişimi (http://cme.msu.edu/cmeias/) ve Wimasis (https://www.wimasis.com/en/) dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme veri türleri için farklı şekilde uygun olan çeşitli açık kaynak görüntü işleme platformları mevcuttur.

Sunulan örnek veriler ImageJ platformu kullanılarak işlendi ve analiz edildi. Kısaca, hücredeki hyphal uç apeksi veya septa gibi belirli bölgeler, büyükçe alan seçim araçlarıyla işaretlenir ve içerdiği tüm piksellerin yoğunluğu uygulanan "ölçüm aracı" yazılımıyla okunur. Kontrollerden ve deney numunelerinden elde edilen yoğunluk verileri, matematiksel olarak analiz edilerek grafik olarak hazırlanan bir elektronik tablo dosyasına aktarılır. Daha fazla bilgi atıf orijinal yayınlarda bulunabilir.

Örnek veri 1: FM 4-64 alım tahlilleri
Mantar örnekleri koloniler (adım 1.2) olarak eklenmiş ve ters agar blok yöntemi (adım 3.1) ile monte edilmiştir. FM 4-64'ün son konsantrasyonu 1.67 μM idi. Görüntüleme ayarları: HCX PL APO 63x/1.3 NA gliserol daldırma hedefi ters konfokal lazer tarama mikroskobunda (Bkz. Malzeme Tablosu); FM 4-64 uyarma 488 nm ve emisyon 600-700 nm; 150 dk. FM 4-64 alımı için her dakika bir kare gen delemesi ve gen aşırı ifade mutantlar endositoz spatio-temporal organizasyon kusurları tespit etti Mantar özgü Sur7-aile protein 2 (Sfp2) T. atroviride9 (Şekil 5).

Örnek veri 2: Endositik bölmelere yönelik floresan füzyon proteinlerinin FM 4-64 birlikte boyanması
Mantar örnekleri koloniler (adım 1.2) olarak eklenmiş ve ters agar blok yöntemi (adım 3.1) ile monte edilmiştir. FM 4-64'ün son konsantrasyonu 2 μM idi. Görüntüleme ayarları: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC su daldırma hedefi ters konfokal lazer tarama mikroskobu nda (Bkz. Malzeme Tablosu); GFP uyarma 488 nm ve emisyon 500-530 nm, FM 4-64 uyarma 488 nm ve emisyon 600-700 nm ve parlak alan ile iletilen ışık dedektörü ile, hepsi aynı anda; 15 dakikaya kadar her 15 s. FM4-64 co-boyama için her 15 s. iki gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) etiketli transmembran proteinleri Sfp2 ve Gpr1 T. atroviride endositik yol (Şekil 6, Film 3, Film 4) ile ilgili olarak kullanılmıştır.

Örnek veri 3: Morfogenetik farklılıkların belirlenmesi için FM 4-64 ortak boyama
Mantar örnekleri koloniler (adım 1.2) olarak eklenmiş ve ters agar blok yöntemi (adım 3.1) ile monte edilmiştir. FM 4-64'ün son konsantrasyonu 2 μM idi. Görüntüleme ayarları: Ters konfokal lazer tarama mikroskobunda Plan Apochromat 63x/1.4 NA yağ daldırma hedefi (Bkz. Malzeme Tablosu); GFP uyarma 488 nm ve emisyon 505-550 nm, FM 4-62 uyarma 488 nm ve emisyon 574-691 nm ve parlak alan ile iletilen ışık dedektörü ile, hepsi aynı anda; 15 dakikaya kadar her 8,5 s'de bir kare. FM4-64 co-boyama floresan olarak etiketlenmiş BUD-6 polarizomkompleks proteinin subselliler lokalizasyon dinamikleri ile ilişkilendirilmesine izin verilen bud-6 polarizom kompleks proteini, örneğin septa ve polarize hipüf uç büyümesinin oluşumu gibi, ve n. crassa'nın vahşi tipi ve mutant suşları arasındaki subsella organizasyonu ve hiphal mimarisindeki belirgin farklılıklar (Şekil 7, Film 5).

Örnek veri 4: Hücre duvarı boyama morfogenetik farklılıkları ortaya çıkarır
Mantar örnekleri koloniler (adım 1.2) olarak eklenmiş ve ters agar blok yöntemi (adım 3.1) ile monte edilmiştir. 2 μM CFW, 20 μM SPF ve 100 μM CR son konsantrasyonlar kullanıldı. Görüntüleme ayarları: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC su daldırma hedefi ters bir konfokal lazer tarama mikroskobu (Malzeme Tablosubakınız); CFW ve SPF uyarma 405 nm ve emisyon 430-470 nm, CR uyarma 543 nm ve emisyon 580-620 nm. HÜCRE duvar polimerleri ile CFW, SPF ve CR farklı etkileşim özellikleri Δsfp2 mutant ve T. atroviride9yabani türü suşu arasındaki morfogenetik farklılıkları vurgulamak . Yüksek boya konsantrasyonları tarafından neden hücre duvarı stresi artan vahşi türüne göre mutant daha hızlı ve daha belirgin oluşur. Buna ek olarak, aynı görüntüler hiphal çapı ve her iki suş arasındaki septal mesafe ile ilgili morfogenetik farklılıkları ölçmek için izin(Şekil 8).

Örnek veri 5: Hücre duvarı biyosentezinin gerçek zamanlı izlenmesi
Mikroplar 8 kuyulu odalı mikro slaytlarda (adım 3.2) sıvı kültür (adım 1.4) olarak yetiştirildi. Son CFW konsantrasyonu 0.12 μM. Görüntüleme ayarları: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC su daldırma hedefi ters bir konfokal lazer tarama mikroskobu; CFW uyarma 405 nm ve emisyon 420-470 nm; 35 dk kadar her 20 sin için bir kare. Çok düşük CFW konsantrasyonu boya molekülleri ile hücre duvarının doygunluğu önler ve hücre duvarı biyosentezinin kantitatif gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Bu, yeni hücre duvar malzemesinin birikiminin tek düze olmadığını, ancak N. crassa'da mikrop füzyonundan önce bir hücre nin hücre eki üzerine göreli yer değiştirmesinden kaynaklanan lokalize fiziksel gerilmelere çok hızlı bir şekilde yanıt verdiğini ortaya koymaktadır (Şekil 9, Film 6).

Şekil 1: FM boyalarının biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri. (A) FM 1-43/SynaptoGreen C4 ve FM 4-64/SynaptoRed C2 kimyasal yapıları. (B

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları ve ifşa etmek için hiçbir şey olduğunu beyan.