Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Karaciğer Alkol Dehidrogenaz SNS Kobalt(II) Kıskaç Model Kompleksleri Hazırlanması

6.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60668

⸱

19 Mart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

Bu makalede

Özet

Karaciğer alkol dehidrogenaz SNS pincer kobalt (II) model kompleksleri hazırlanması burada sunulmaktadır. Kompleksler CoCl2·6H2O ile ligand öncülü tepki vererek hazırlanabilir ve daha sonra diethyl eter yavaş yavaş kobalt kompleksi içeren bir asetonitril çözeltisi içine yayılarak izin vererek yeniden kristalize edilebilir.

Özet

Kimyasal model kompleksleri bir enzimin aktif bölgesini temsil etmek üzere hazırlanır. Bu protokolde, tridentate kıskaç ligand öncüleri bir aile (her iki kükürt ve bir azot donör atom işlevleri (SNS) ve bis-imidazol veya bis-triazol bileşikleri dayalı) bir aile Tridentate SNS kıskaç kobalt (II) kompleksleri göze CoCl2·6H2O ile metallated vardır. Karaciğer alkol dehidrogenaz için kobalt (II) model komplekslerinin hazırlanması kolay. CoCl2·6H2O'yu ligand öncülünü içeren asetonitril çözeltisine ekledikten sonra hızlı bir renk değişimine dayanarak, karmaşık hızla oluşur. Metal kompleksinin oluşumu, çözeltinin bir gecede reflüye izin vererek tamamlanır. Bu kobalt(II) kompleksleri karaciğer alkol dehidrogenaz (LADH) çinko aktif site için model olarak hizmet vermektedir. Kompleksler tek kristal X-ışını kırınımı, elektrosprey kütle spektrometresi, ultraviyole görünür spektroskopi ve element analizi ile karakterizedir. Kompleksin yapısını doğru bir şekilde belirlemek için, tek kristal yapısı belirlenmelidir. X-ışını kırınımı için uygun olan komplekslerin tek kristalleri daha sonra kobalt(II) kompleksini içeren bir asetonitril çözeltisine diethyl eterin yavaş buhardifüzyonu ile yetiştirilir. Yüksek kaliteli kristaller için, yeniden kristalizasyon genellikle 1 haftalık bir süre içinde gerçekleşir, ya da daha uzun. Bu yöntem diğer model koordinasyon komplekslerinin hazırlanmasında uygulanabilir ve lisans eğitim laboratuarlarında kullanılabilir. Son olarak, başkalarının kendi araştırma için yararlı tek kristaller elde etmek için bu recrystallization yöntemi bulabilirsiniz inanılıyor.

Giriş

Sunulan yöntemin amacı, metalloenzimlerin katalitik aktivitesini daha iyi anlamak için LADH'nin küçük moleküllü analoglarını hazırlamaktır. LADH kofaktör bağlayıcı etki alanı ve çinko (II) metal içeren katalitik etki alanı1içeren dimerik bir enzimdir. LADH, co-faktör NADH varlığında, ketonlar ve aldehitler kendi alkol türevleri2azaltabilir. NADvarlığında +, LADH ketonlar ve aldehitler 2 alkollerin oksidasyonu ters kataliz gerçekleştirebilirsiniz. LADH'nin aktif bölgesinin kristal yapısı, çinko(II) metal merkezinin bir azot atomuna bağlı olduğunu, histidin yan zinciri ve iki kükürt atomu tarafından sağlandığını ve iki sistein ligandı tarafından sunulduğunu göstermektedir3. Daha fazla araştırma çinko metal merkezi bir labile su molekülü ile ligated olduğunu göstermiştir, metal merkezi etrafında sözde tetrahedral geometri ile sonuçlanan4.

Biz daha önce rapor ve SNS kıskaç ligand öncüleri yanı sıra ZnCl2 ile ligand öncüleri metallated zn (II) tridentate ligand öncüsü içeren kompleksleri oluşturmak içinkullanılan 5,6,7. Bu ligand öncülleri Şekil 1'degösterilmiştir. Bu çinko(II) kompleksleri elektron fakiri aldehitlerin stokiyometrik azalması için aktivite sergilediler ve böylece LADH için model kompleksleridir. Daha sonra, SNS ligand öncüleri içeren bakır(I) ve bakır(II) kompleksleri bir dizi sentezve karakterizasyonubildirilmiştir 8,9,10.

LADH bir çinko (II) enzimi olmasına rağmen, LADH'nin kobalt(II) analogları hakkında daha fazla spektroskopik bilgi elde etmek için LADH'nin kobalt(II) model komplekslerini hazırlamakla ilgileniyoruz. Kobalt(II) kompleksleri renklidir, çinko(II) kompleksleri ise beyaz değildir. Kobalt(II) kompleksleri renkli olduğundan, komplekslerin ultraviyole görünür spektrumları elde edilebilir ve kobalt(II) komplekslerinde ligand alanının gücü hakkında bilgi de toplanabilir. Gaussian hesaplamaları ve deneysel olarak elde edilen ultra-viyole görünür spektrumlar kullanılarak, ligand alanının gücü hakkında bilgi elde edilebilir. Kobalt(II) çinko (II) için iyi bir yedek, her iki iyonik yarıçap ve benzer Lewis asitler11,olduğundan ,12.

Sunulan yöntem ladh doğal katalitik davranışı taklit etmeye çalışmak için model kompleksleri sentezleme ve karakterizasyonu içerir5,6. Daha önceLaDH4 çinko aktif sitenin yapısı ve reaktivitesi modellenmiş ladh, çinko (II) model kompleksleri oluşturmak için ZnCl2 ile ligand öncüleri bir aile metallated var. Birden fazla deney sayesinde, bu kıskaç ligands farklı çevre koşulları altında sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve bağlı R-gruplarının çeşitli bir koleksiyon ile istikrarlı kalmıştır. 5,6

Tridentate ligandlar monodenat ligandlara göre tercih edilirler, çünkü tridentat etekli ligandların güçlü şelat etkileri nedeniyle metalasyonda daha başarılı oldukları bulunmuştur. Bu gözlem, tekdenat ligand13'ekıyasla tridentate pincer ligand oluşumunun daha çok tercih edilen bir entropiden kaynaklanmaktadır. Ayrıca, tridentate kıskaç ligands dimerization metal kompleksleri, dimerization karmaşık bir katalitik aktivite yavaş muhtemeldir çünkü tercih edilir dimerization önlemek olasıdır14. Böylece, tridentate pincer ligands kullanarak katalitik aktif ve sağlam komplekslerin hazırlanmasında organometalik kimya başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Kıskaç kompleksleri diğer kıskaç sistemlerine göre daha az çalışılmıştır, çünkü kıskaç kompleksleri genellikle ikinci ve üçüncü sıra geçiş metalleri15içerir.

Metaloenzimler üzerinde yapılan bu araştırma, biyolojideki diğer alanlara uygulanabilen enzimatik aktivitelerinin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Model komplekslerini alternatif yönteme göre sentezleme yöntemi (LADH'nin tüm proteininin sentezi) birçok nedenden dolayı olumludur. İlk avantajı, model komplekslerinin moleküler kütlesinin düşük olması ve hala doğal enzimin aktif bölgesinin katalitik aktivitesini ve çevre koşullarını doğru bir şekilde temsil etme yeteneğine sahip olmasıdır. İkinci olarak, model kompleksleri ile çalışmak ve güvenilir ve ilişkilendirilebilir veriler üretmek daha kolaydır.

Bu el yazması, LADH'nin iki kobalt(II) kıskaç modeli kompleksinin sentetik hazırlanmasını ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Her iki kompleksde de sülfür, azot ve kükürt donör atomları içeren bir kıskaç ligandı bulunmaktadır. İlk kompleks (4) bir imidazol öncüsü dayanmaktadır, ve ikinci (5) bir triazol öncüsü dayanmaktadır. Kompleksler bir hidrojen donör varlığında elektron yoksul aldehitlerin stokiyometri azaltma için reaktivite göstermektedir. Bu reaktivite sonuçları bir sonraki el yazmasında bildirilecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Kloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropil-N'-metileneimidazol-2-tiyoon)piridin]kobalt(II)tetraklorokodatat [4] sentezi

  1. Karmaşık 4hazırlamak için, 2,6-bis (N-izopropil-N'-metileneimidazol-2-tione)piridin (C19H25N5 S2)6 ila 15 mL asetonitrile 100 mL yuvarlak alt flask 0,121 g (3,12 x 10-4 mol) ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) kobalt klorür (II) heksahidrat (CoCl2·6H2O) ekleyin. Reaksiyon çözeltisi kobalt(II) klorür heksahidat eklendikten hemen sonra açık sarıdan zümrüt yeşiline renk değiştirmelidir.
  2. Şişeye bir karıştırma çubuğu ekleyin. Reflü ve tam reaksiyon sağlamak için 20 saat için reaksiyon karıştırın. Azaltılmış basınç altında bir rotovap kullanarak çözücü çıkarın.

2. Kloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropil-N'-metileneimidazol-2-tione)piridin]kobalt(II)tetraklorokodatat [4] yavaş difüzyon ile yeniden kristalizasyonu

  1. Çözünürea asetonitril (7,5 mL) çözün, çözeltiyi filtreleyin ve çözeltiyi 1 dram şişeye eşit olarak yerleştirin. Her şişeyi 1,5 mL asetonitril çözeltisi ile doldurun.
    1. Yavaş buhar difüzyon sağlar şişeleri, kap pamuk ekleyin. Şişenin üst kısmındaki açıklığa pamuk ları rahatça sığdırın.
    2. Şişeleri 50 mL dietil eter içeren 240 mL'lik bir kavanoza yerleştirin. Kavanozu bir kapakla kapatın.
    3. Kristallerin 1 haftalık bir süre içinde büyümesine izin verin.
      NOT: Yeniden kristalizasyon 1 günden uzun sürebilir.

3. Kloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropil-N'-metylenetriazol-2-tiyodin]kobalt(II)tetraklorokodatat [5]

  1. Karmaşık 5hazırlamak için, 2,6-bis(N-izopropil-N'-methylenetriazole-2-tione)piridin (C17H23N7S2)6 ila 15 mL asetonitrile 100 mL yuvarlak alt şişe 0,183 g (4,70 x 10-4 mol) ekleyin. Bu çözeltiye 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) kobalt klorür hekzahidit (CoCl2·6H2O) ekleyin. Reaksiyon çözeltisi kobalt(II) klorür heksahidat eklendikten hemen sonra açık sarıdan kraliyet mavisine renk değiştirmelidir.
    1. Şişeye bir karıştırma çubuğu ekleyin. Reflü ve tam reaksiyon sağlamak için 20 saat için reaksiyon karıştırın. Azaltılmış basınç altında bir rotovap kullanarak çözücü çıkarın.

4. Kloro-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropil-N'-methylenetriazole-2-tione)pyridine]kobalt(II)tetraklorokodatat [5] yavaş buhardifüzyonu ile yeniden kristalizasyonu

  1. Çözünürea asetonitril (9,0 mL) çözün, çözeltiyi filtreleyin ve çözeltiyi 1 dram şişeye eşit olarak yerleştirin. Her şişeyi 1,5 mL asetonitril çözeltisi ile doldurun.
    1. Yavaş buhar difüzyon sağlar şişeleri, kap pamuk ekleyin. Şişenin üst kısmındaki açıklığa pamuk ları rahatça sığdırın.
    2. Şişeleri 50 mL dietil eter içeren bir kavanoza yerleştirin. Şişeyi bir kapakla kapatın.
    3. Kristallerin 1 haftalık bir süre içinde büyümesine izin verin.
      NOT: Yeniden kristalizasyon 1 günden uzun sürebilir.

5. X-ışını kristalografisi

  1. Naylon halka üzerine 4 kristal monte edin. Rigaku Oxford Kırınım difraktometresi ile ilgili verileri toplayın. Burada X-ışını kırınım verileri 173(2) K.'da toplanır.16 17 En az kareler en aza küçültme kullanarak ShelXL18 arıtma paketi ile yapıyı hassaslaştırın.
  2. Naylon halka üzerine 5 kristal monte edin. Rigaku Oxford Kırınım difraktometresi üzerinde X-ışını kırınım verilerini toplayın. Burada X-ışını kırınım verileri 173(2) K.'da toplanır.16 17 En az kareler en aza küçültme kullanarak ShelXL18 arıtma paketi ile yapıyı hassaslaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sentez
4 ve 5 komplekslerinin sentezleri kobalt (II) klorür heksahiditile bis-tione ligand öncüsü içeren bir asetonnitril çözeltisine tepki vererek başarıyla gerçekleştirilmiştir (Şekil 2). Bu reaksiyon hava varlığında bir reflü sıcaklığında meydana geldi. Genel olarak, kompleksleri 4 ve 5 asetonitril, dimetil sülfoksit, diklorometan ve metanol çözünür olduğu gözlendi. Kompleks 4 yeşil re...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

4 ve 5 komplekslerinin hazırlanması kolaydır. Önemli adım, katı CoCl2·6H2O'yu ilgili ligand öncülü içeren bir asetonitril çözeltisine eklemektir. Çözelti, CoCl2·6H2O eklenmesinden sonra saniyeler içinde koyu yeşile dönerek kompleks 4oluşturur. CoCl2·6H2O eklendikten sonra çözelti parlak maviye döner ve kompleks 5oluşturur. Tam reaksiyon sağlamak için, çözüm bir gecede reflü yerleştirilir.<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

John Miecznikowski bu proje için aşağıdaki mali destek aldı: Connecticut NASA Uzay Hibe İttifakı (Ödül Numarası P-1168), Fairfield Üniversitesi Bilim Enstitüsü, Sanat ve Bilim Ler Yayın Fonu Koleji, Fairfield Üniversite Fakültesi Yaz Araştırma Ödeneği ve Ulusal Bilim Vakfı-Büyük Araştırma Enstrümantasyon Programı (Grant Numarası CHE-1827854) 400 MHz NMR spektrometre satın almak için fon için. Ayrıca elektrosprey kütle spektrumları elde yardım için Terence Wu (Yale Üniversitesi) teşekkür. Jerry Jasinski Bir X-ışını diffraktometre satın almak için fonlar için Ulusal Bilim Vakfı-Büyük Araştırma Enstrümantasyon Programı (Grant Number CHE-1039027) kabul eder. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch ve Samantha Zygmont yaz araştırma ödeneği sağlamak için Hardiman Akademisyenler Programı kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mL Yuvarlak Tabanlı ŞişeKimyasal CamCG150691100 mL Tek Boyunlu Yuvarlak Tabanlı Şişe, 19/22 Dış Eklem
AsetonitrilFisherHB9823-4HPLC
Sınıfı Chiller roto-vapLaudaL000638Alpha RA 8
Kobalt Klorür hekzahidratAcros OrganicsAC423571000Acros Organics
Dietil EterFisherE-138-1Dietil Eter Anhydorus
dereceli silindirFisherS6345625 mL dereceli silindir
ocak gözüFisher11-100-49SHIsotemp Temel Karıştırma Ocak Gözü
kavanozlarıFisher05-719-481250 mL kavanozlar
Ligand----------Daha önce Profesör Miecznikowski tarafından sentezlenmiştir
Orta pamuk toplarıFisher22-456-80orta boy pamuk topları
bir dram şişesiFisher03-339TFE Astarlı Kapaklı bir dram
şişesi pipetFisher13-678-20B5.75 inç pipetler
pipet ampulleriFisher03-448-21için Fisher Marka Lateks Ampul
Fisher08-741 D325 mL kum banyosu
geri akış kondansatörüçanak Kimyasal CamCG-1218-A-2219/22 iç eklemli kondenser
RotovapHeidolph Collegiate36000090Brinkmann; Heidolph Collegiate Döner Evaporatör Heidolph WB eko banyolu Heidolph Döner Evaporatör
kum banyosu için deniz kumuAcros Organics612355000kum banyosu için yıkanmış deniz kumu
Karıştırma çubuğuFisher07-910-23Yumurta Şeklinde Manyetik Karıştırma Çubuğu
Vakum gresiFisher14-635-5DDow Corning rotovap
Heidolph CollegiateGres vakum pompası36302830Heidolph Rotovac Valf Kontrolü
kum banyosu için pipet yeniden kristalleştirme kabı için yeniden kristalleştirici için Yüksek Vakumlu

Kaynaklar

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
  2. Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
  3. Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
  4. Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
  5. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
  6. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
  7. Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
  8. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
  9. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
  10. Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
  11. Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019).
  12. Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019).
  13. Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1'-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
  14. Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on "Pincer" Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
  15. Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
  16. Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
  17. Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  18. Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  19. Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
  20. Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389(1991).
  21. Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
  22. Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

SNS K ska LigandlarKobalt II KompleksleriTek Kristal X n DifraksiyonuElektrospray K tle SpektrometresiUV G r n r B lge SpektroskopisiElementel AnalizYava Buhar Dif zyonuYeniden Kristallenme Y ntemiKimyasal Model Kompleksler
Karaciğer Alkol Dehidrogenaz SNS Kobalt(II) Kıskaç Model Kompleksleri Hazırlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.