Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Meyozis, eşeyli üreme için haploid gametler oluşturmak için gerekli olan anahtar hücresel süreçtir. Model organizmalar, meyotik profaz sırasında meydana gelen kromozom olaylarının anlaşılmasında, eşleştirme, sinaps ve uygun kromozom ayrımını sağlayan rekombinasyon olayları da dahil olmak üzere etkili olmuştur. Fare bu süreçlerin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir model olmakla birlikte, bu sistemdeki tüm meyotik olaylar insan mayoz bölünmesine benzemektedir. Yakın zamanda insan spermatogenezinin bir modeli olarak zebra balığının heyecan verici potansiyelini gösterdik. Burada, kromozom yayılımı preparatlarında meyotik kromozomları ve ilişkili proteinleri görselleştirme yöntemlerimizi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu preparatlar kromozom yapılarının yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. İlk olarak, testislerin yetişkin zebra balığından diseksiyon prosedürünü, ardından hücre ayrışması, lysis ve kromozomların yayılmasını tanımladık. Daha sonra, meyotik kromozom proteinlerinin lokalizasyonunu, immünororesans tespiti ve nükleik asit dizileri ile situ hibridizasyonda (FISH) floresan ile saptandırma prosedürünü tanımladık. Bu teknikler zebra balığı sisteminde ki meyotik kromatin mimarisinin sitolojik analizi için yararlı bir araç kümesi oluşturmaktadır. Zebra balığı topluluğundaki araştırmacılar bu tekniklerde hızlı bir şekilde ustalaşmalı ve bunları üreme fonksiyonlarının standart analizlerine dahil edebilmelidir.
Giriş
Eşeyli üreme, her biri somatik bir hücrenin kromozomunun yarısını taşıyan iki haploid gametin birleşimi ile devam eder. Meyozis DNA replikasyonu bir tur ve kromozom segregasyonu iki ardışık tur ile haploid gamet üreten özel bir hücre bölünmesidir. Profaz I'de homolog kromozomlar (homologlar) eşleştirme, rekombinasyon ve sinapstan geçmelidir, ikincisi enine filament, Sycp1(Şekil 1A,B)ile köprülenmiş iki homolog eksenden oluşan sinaptonal kompleksin oluşumu ile karakterizedir. Bu süreçlerin düzgün bir şekilde yürütülmemesi, insanlarda düşüklerin önde gelen nedenlerinden biri olan aneuploid gametlerin üretimine yol açabilir1. Eşle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Zebra balıkları içeren tüm yöntemler UC Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlar kullanılarak yapılmıştır.
1. Kromozom yayma prosedürü
NOT: Aşağıdaki protokol, slayt başına yüzlerce yayılan meyotik çekirdekiçeren 4-6 slayt oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Kullanılan testislerin sayısı balığın büyüklüğüne bağlıdır. ~60 gün sonrası döllenme (dpf) ve ~ 6 ay sonrası döllenme (mpf) 15 hayvan 20 hayvan kullanmayı bekleyin. Büyük zebra balıkları için (örn. 12 mpf) 10 hayvan yeterli olmalıdır. Bazı meiyotik mutantların testislerinin (örn. spo11-/-) biraz dah....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Zebrabalığı spermatosit yayma preparatlarını hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem belirledik. Doğru yapıldığında, prosedürümüz iyi yayılmış, üst üste binmeyen çekirdekleri verir. Bu tür çekirdekleri kurtarmak için, uygun miktarda başlangıç materyaline (yani testislere), testisleri yeterli süre için tripsin'de tedavi etmek ve yeterli sayıda DNase I tedavisine sahip olmak önemlidir. Bu spreadler daha sonra telomerler ve meyotik proteinler için profaz I. Şekil 1.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, zebra balığı testislerinden izole edilen spermatositlerden yayılan nükleer yüzey deki telomerlerin ve kromozomla ilişkili proteinlerin yerini araştırma yöntemlerini açıklıyoruz. Bu yöntemlerin diğer teleost türlerindeki spermatositlerin analizinde testislerin büyüklüğüne göre ayarlanabilecek şekilde uygulanacağını düşünüyoruz.
Zebrabalığı meiotik proteinlere sadece birkaç antikor yükseltilmiş olsa da, insan (h) veya fare (m) proteinlerine yükseltilmiş aşağıdaki antikorları kullanarak b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Biz zebrabalığı meiocytes kromozomlar yaymak ve boyama için yöntemleri optimize etmek için yardımcı olmak için el yazması ve An Nguyen hakkında yorum için Trent Newman ve Masuda Sharifi teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 GM079115 tarafından Desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL santrifüj tüpleri | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | ||
| 1,5 mL mikrosantrifüj tüp rafı | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | ||
| %16 formaldehit, metanol içermez | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | ||
| 24 x 50 mm cam lameller | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm cam lameller | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL konik santrifüj tüpleri | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Otoklav torbası | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | Plastik lamel yapmak için kullanılır. | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Steril damıtılmış suda 100 mg / ml'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. |
| Hücre Süzgeci, 100 & m | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M keçi anti-tavuk IgY (H + L), yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş | Biotium | 203775-500uL | 1:1000 |
| Tavuk anti-zfSycp1'de | /A | 1:100'de kullanın | |
| Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich | C0130-500MG | ||
| Coplin kavanozu | Birkaç ticari markalar mevcuttur | ||
| DNase I, sığır pankreasından derece II | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forseps Güzel | Bilim Araçları | 11252-30 | Testislerin diseksiyonu için iki gereklidir. |
| Eppendorf Tüpleri, 5 mL | VWR Uluslararası | 89429-308 | |
| Formamid | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Keçi anti-tavuk IgY (H + L) ikincil antikoru, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | 1: 1000'de kullanın |
| Keçi anti-tavuk IgY (H + L) ikincil antikoru, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | 1: 1000'de kullanın |
| Keçi anti-hDMC1 | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-8973 | Elimizde çalışmıyor |
| Keçi anti-tavşan IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | 1:1000'de kullanın |
| Keçi anti-tavşan IgG (H + L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | 1:1000'de kullanın |
| Keçi serumu | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodyum tuzu | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Nem odası | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hibridizasyon Fırını | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| İnkübatör Çalkalayıcı | New Brunswick Bilimsel | Model Klasik C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Nem odası için kullanılır |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Mikroskop | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | En az ~1.65X büyütme yapabilen herhangi bir standart mikroskop yeterlidir. | |
| Mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Fare anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Elimizde çalışmıyor |
| Fare anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Elimizde çalışmıyor |
| Fare anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Elimizde çalışmıyor |
| Na2HPO4 ve orta nokta; 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 çözeltisi | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 74257 | |
| Plastik transfer pipetleri | Çeşitli ticari markalar mevcuttur | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Üreticiye göre hazırlayın s talimatları. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. |
| ProLong Elmas Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ThermoFisher Scientific | P36971 | ProLong Elmas Antifade Mountant | |
| Tavşan anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | 1:300'de kullanın |
| Tavşan anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | 1:200'de kullanın |
| Tavşan anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | 1:300'de kullanın |
| Sodyum sitrat | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sükroz | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Makas, 30 derece açı, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Herhangi bir küçük makas da kullanabilir. |
| Sylgard kiti | Fisher Scientific | NC9897184 | Üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | % 20'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için steril damıtılmış suda seyreltin. Oda sıcaklığında saklayın. Triton X-100, su içinde seyreltildiğinde bir çökelti oluşturur; çökelti gece boyunca çözülür. |
| Tripsin | Worthington Biyokimyasal | LS003708 | |
| Tavuk yumurtası beyazından elde edilen tripsin inhibitörü | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | % 20 çalışan bir çözelti elde etmek için steril damıtılmış suda seyreltin. Oda sıcaklığında saklayın. |
| Vannas Yaylı Makas - 4 mm (mikro makas) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Kaynaklar
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs dur....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
