Method Article

Koşullu Cas9 Stabilizasyonunu Kullanarak Gen fonksiyonlarını değerlendirmek için Yeni Bir Araç Seti

DOI:

10.3791/60685

⸱

September 2nd, 2021

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, shield-1 adlı küçük molekül altında düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9'un (Cas9) zamansal ve koşullu stabilizasyonuna dayanan bir genom düzenleme aracı tarif ediyoruz. Yöntem kültürlü hücreler ve hayvan modelleri için kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar- (CRISPR-) ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) teknolojisi, genomda doğru ve hedefli modifikasyonlar yapmak için yaygın bir laboratuvar aracı haline gelmiştir. Muazzam popülaritesi ve hızlı yayılımı, öncekilere kıyasla kolay kullanımına ve doğruluğuna atfedilmektedir. Ancak, sistemin constitutive aktivasyonu sınırlı uygulamalara sahiptir. Bu yazıda, CAS9 proteininin koşullu stabilizasyonuna dayalı CRISPR/Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin veren yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Rapamycin bağlayıcı protein FKBP12'nin mühendislikteki bir mutantını Cas9'a (DD-Cas9) eritmek, Cas9'un hızlı bir şekilde bozulmasını sağlar ve bu da bir FKBP12 sentetik ligandının (Shield-1) varlığıyla stabilize edilebilir. Diğer indüklenebilir yöntemlerin aksine, bu sistem, ikinci genin koşullu düzenlenmesi olmadan, DD-Cas9'u başka bir ilgi geni ile birlikte ifade etmek için bi-cistronic sistemler üretmek için kolayca uyarlanabilir. Bu yöntem, izlenebilir sistemlerin üretilmesinin yanı sıra Cas9 çekirdeği tarafından hedeflenen alellerin paralel, bağımsız manipülasyonunu sağlar. Bu yöntemin platformu, temel genlerin sistematik olarak tanımlanması ve karakterizasyonu ve in vitro ve in vivo ortamlarda genlerin fonksiyonel etkileşimlerinin sorgulanması için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlarla ilişkili protein 9" anlamına gelen CRISPR-Cas9 ilk olarak bakteri adaptif bağışıklık 1,2üzerine yapılan çalışmaların bir parçası olarak keşfedilmiştir. Bugün CRISPR/Cas9 programlanabilir gen düzenleme için en tanınmış araç haline gelmiştir ve transkripsiyonel ve epigenetik modülasyonlara izin vermek için sistemin farklı yinelemeleri geliştirilmiştir3. Bu teknoloji, DNA4'ünhemen hemen her dizisinin son derece hassas genetik manipülasyonu sağlar.

Herhangi bir CRISPR gen düzenlemesinin temel bileşenleri özelleştirilebilir bir kılavuz RNA dizisi ve Cas9 çekirdeği5'tir. RNA kılavuzu, DNA'daki hedef tamamlayıcı diziye bağlanır ve Cas9 çekirdeğini genom3,4'tebelirli bir noktada çift iplikçik kırılması gerçekleştirmeye yönlendirir. Elde edilen bölünme bölgesi daha sonra homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) ile onarılır ve bunun sonucunda hedeflenen DNA dizisi5'tekideğişikliklerin tanıtılması .

CRISPR/Cas9 tabanlı gen düzenlemenin kullanımı kolaydır ve önceki gen düzenleme tekniklerine kıyasla nispeten ucuzdurve2,4,5sistemlerinin çokluğunda hem verimli hem de sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Yine de, sistem bazı sınırlamalar sunar. Cas9'un constitutive ifadesinin genellikle hedef dışı sayısı ve yüksek hücre toksisitesi4, 6,7,8ile sonuç olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, temel ve hücre sağkalım genlerinin Cas9 tarafından eşgüdümlü olarak hedeflleştirilmesi, hücre ölümünün kinetik çalışmaları gibi belirli türde fonksiyonel çalışmaları yapma yeteneğinden uzaklaştırır7.

Tet-ON ve Tet-Off9gibi6sorunlarını gidermek için farklı indükleyici veya koşullu kontrollü CRISPR-Cas9 araçları geliştirilmiştir; bölgeye özgü rekombinasyon10; kimyasal nedenli yakınlık11; intein bağımlı birleştirme3; ve 4-Hidroksikomoxifen Östrojen Reseptörü (ER) bazlı nükleer lokalizasyon sistemleri12. Genel olarak, bu prosedürlerin çoğu (intein birleştirme ve kimyasal olarak indüklenen yakınlık bölme sistemleri) geri dönüşümlü kontrol sunmaz, ilaç tedavisine (Tet-On/Off sistemi) çok yavaş bir kinetik yanıt sunmaz veya yüksek verimli manipülasyona uygun değildir6.

Bu sınırlamaları gidermek için sadece hızlı ve sağlam zamansal kontrollü gen düzenleme sağlamakla kalmayıp aynı zamanda yüksek verimli gen manipülasyonu için izlenebilirlik, ayarlanabilirlik ve amenability sağlayan yeni bir araç seti geliştirdik. Bu yeni teknoloji hücre hatlarında, organoidlerde ve hayvan modellerinde kullanılabilir. Sistemimiz, Cas9 ile kaynaştığında, hızlı bozulmasına neden olan tasarlanmış bir etki alanına dayanmaktadır. Bununla birlikte, son derece seçici, toksik olmayan, hücre geçirgen küçük bir molekülle hızla stabilize edilebilir. Daha spesifik olarak, insan FKBP12 mutantını Cas9'a "istikrarsızlaştırıcı etki alanı" (DD) olarak tasarladık, memeli hücrelerinde ifade edildiğinde Cas9'u her yerde bulunan-proteazom sistemi aracılığıyla hızlı ve konsutif bozulma için işaretledik13. DD sentetik ligand, Shield-1 DD konformasyonunu stabilize edebilir, böylece DD'ye (Cas9 gibi) kaynaşmış proteinlerin çok verimli bir şekilde bozulmasını önleyebilir ve hızlı bir kinetik yanıt14,15. Not olarak, Shield-1 mutant FKBP12'ye vahşi tip muadilinden daha sıkı üç büyüklük sırasına bağlanır14.

DD-Cas9/Shield-1 çifti, mitokondri metabolizmasında önemli bir rol oynayan CypD genini koşullu olarak hedef alarak daha önce gösterdiğimiz gibi, kültürlü hücrelerde ve hayvan modellerinde temel genlerin sistematik olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu incelemek için kullanılabilir; EGFR, onkojenik dönüşümde önemli bir oyuncu; ve Tp53, DNA hasar tepkisinde merkezi bir gen. Zamansal ve şartlı kontrollü gen düzenlemeye ek olarak, yöntemin bir başka avantajı DD-Cas9'un stabilizasyonunun transkripsiyondan bağımsız olmasıdır. Bu özellik, aynı promotör altında, izlenebilir belirteçlerin yanı sıra östrojen reseptörüne bağımlı rekombinaz, CREERgibi rekombinazların birlikte ifadesini sağlar. Bu çalışmada, yöntemimizin tüp bebek olarak nasıl başarıyla kullanılabileceğini gösteriyoruz, örneğin DNA replikasyon geni RPA3'ü koşullu olarak hedeflemek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DD-Cas9 vektör

  1. Addgene'den DD-Cas9 vektörü (dolgu sırası ve Venüs (EDCPV), Plasmid 90085 ile DD-Cas9 vektörü edinin.
    NOT: Bu, EFS organizatörü DD-Cas9 transkripsiyonunu sürerken tek kılavuz RNA (sgRNA) transkripsiyonunu yönlendiren bir U6 promotörüne sahip bir lentiviral DD-Cas9 plazmididir. DYKDDDDK dizisi (bayrak etiketi), Cas9'un C terminalsinde ve ardından DD-Cas9 ve modifiye floresan protein Venüs'ü (mVenus) ayıran 2A kendinden yarıklı peptitte (P2A) bulunur.

2. Küçük kılavuz RNA (sgRNA) tasarımı

  1. Belirli bir genomik bölgeyi hedef alan birkaç algoritmadan birini kullanarak DD-Cas9 vektörüne klonlanacak küçük kılavuz RNA (sgRNA) tasarlayın.
    NOT: Hedef dışı efektleri azaltmak için web sitesini kullanarak en yüksek puana sahip sgRNA dizilerini seçin: http://crispr.mit.edu.
  2. Tam bir sgRNA yapmak için sgRNA dizisi başına iki oligonükleotid tasarlayın ve sipariş edin.
    NOT: Plazmid BsmBI enzimi tarafından sindirileceğinden, sgRNA dizisine BsmBI sindirim çıkıntıları ekleyerek ileriyi ve ters oligonükleotidleri tasarlayın. Tablo 1'denşablonu kullanın.

3. sgRNA'nın lentiviral DD-Cas9 vektörüne klonlanması

  1. Kısıtlama enzim sindirim reaksiyonunda alkali fosfataz (FastAP) kullanarak DD-Cas9 plazmidinin 5′-uçlarını defosforille edin.
    NOT: Vektörler ligasyon sırasında özellikle tek bir kısıtlama enzimi tarafından doğrusallaştırıldıklarında yeniden daireselleştirebilirler. Vektörün yeniden daireselleşmemesini sağlamak için, doğrudan sindirim reaksiyonuna fosfataz ekleyerek plazmidi de-fosforilize edin.
    1. 5 μg DD-Cas9 plazmid karışımı hazırlayarak plazmidi BsmBI enzimi ile defosforilize edin ve sindirin, 6 μL sindirme tamponu (10x), 0,6 μL DTT (100 mM), 3 μL BsmBI, 3 μL FastAP, 60 μL'yi toplam reaksiyon hacmi yapmak için 60 μL'ye kadar çekirdeksiz su ekleyin.
      NOT: Sonunda karışıma BsmBI enzimini ve FastAP'ı ekleyin.
    2. Karışımı 37 °C ısı bloğunda veya termositte 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  2. Sindirilmiş DD-Cas9 plazmidini arındırın.
    1. Eksik sindirilmiş plazmid ve enzim izlerini gidermek için% 0.8 DNA agarose jeli hazırlayın. Daha iyi ayırma için daha geniş bir jel tarak kullanın ve jeli 90 V'ta çalıştırın.
    2. 360-365 nm UV ışığı altındaki bantları görselleştirin ve daha büyük plazmid bandını jelden kesin. Dolguya karşılık gelen 2 kb'lık parçayı atın.
    3. Ticari jel temizleme kiti kullanarak büyük kesim jel bandını arındırın ve üreticinin talimatlarına uyun.
  3. Sindirilmiş DD-Cas9 plazmid ile ligat tavlanmış oligolar.
    1. Fosforilit ve tavlama sgRNA oligos.
      1. 1 μL T4 Ligasyon Tamponu (10x), 1 μL Oligo 1 (100 μM), 1 μL Oligo 2 (100 μM), 6,5 μL çekirdeksiz su karışımını hazırlayın. Son olarak, 0,5 μL T4 PNK ekleyin. Bu reaksiyonun toplam hacmi 10 μL'dir.
      2. Reaksiyon karışımını termosikle aşağıdaki koşullarla ekleyin: 30 dakika için 37 °C, 5 dakika için 95 °C ve ardından 5 °C/ dk hızıyla 25 °C'ye kadar rampa.
        NOT: Oligonükleotidler ligasyona konulmadan önce PNK ısı inaktive edilmelidir, aksi takdirde PNK vektörü fosforilize eder. Fosforilasyon adımı ve tavlama adımı bir termosikler içinde birlikte gerçekleştirilir. Ligasyonun gerçekleşmesi için sgRNA oligonükleotidlerine 5' fosfatın eklendiği fosforilasyon adımı gereklidir.
    2. Ligate DD-Cas9 sindirilmiş plazmid ve sgRNA oligos.
      1. Tavlanmış oligoları çekirdeksiz suda 1:200'e kadar seyreltin ve ligasyon reaksiyonunda 50 ng plazmid DNA kullanın.
        NOT: Kesici uç entegrasyonunu teşvik etmek için 6 kesici ucun molar oranını kullanın: 1 vektör veya molar oranını hesaplamak için bir ligasyon hesaplayıcısı kullanın: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Ligasyon reaksiyon karışımını hazırlayın: 50 ng sindirilmiş ve saflaştırılmış DD-Cas9 vektörü, uygun hacimde seyreltilmiş tavlanmış oligo, 1 μL T4 Ligasyon Tamponu (10x), 1 μL T4 DNA Ligaz, 10 μL'ye kadar nükleaz içermeyen su reaksiyonun toplam hacmini elde etmek için 10 μL μL.
      3. "Yüksek konsantrasyon" ligase kullanıyorsanız, reaksiyonu oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Aksi takdirde, oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya ya da daha yüksek bir ligasyon verimi elde etmek için bir gecede 16 °C'de kuluçkaya yatırın.
        NOT: 65 °C'deki standart T4 DNA Ligase'i 20 dakika kullanıyorsanız ısı devre dışı bırakın. Ligase master karışımları kullanıyorsanız ısı inaktive etmeyin.

4. Bakteriyel dönüşüm

  1. Oda sıcaklığında önceden ılık 10 cm LB-ampisilin agar plakaları.
  2. Buz üzerinde 50 μL "One shot Stbl3" yetkin bakteri hücrelerini çözün.
  3. 50 μL yetkin bakteri hücrelerine 2-3 μL ligasyon karışımı ekleyin ve tüpün altını 4 kez parmakla vurarak hafifçe karıştırın. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
  4. Bir zamanlayıcı kullanarak hücreleri tam olarak 42 °C'de 40 saniye boyunca ısı şokuna alın. Buz üzerindeki bakteri hücrelerini 5 dakika soğutun.
  5. Bakteri hücrelerine antibiyotiksiz 500 μL SOC ortam ekleyin ve 45 dakika boyunca 250 rpm'de, 37 °C'de sallanan inkübatörde yetiştirin.
  6. 100 μL dönüştürülmüş bakteriyi önceden ılık LB-ampisilin plakalara yayın ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yayın.

5. Ligated plazmid mini / maxi-prep

  1. Maxi/mini hazırlık başlangıç kültürü hazırlayın.
    1. Ertesi gün tek bir bakteri klonu seçin ve ampisilin içeren 8 mL LB ortam ile bir başlangıç kültürünü aşıla.
    2. Titreyen inkübatördeki bakterileri 250 rpm, 37 °C'de 10-12 saat boyunca büyütün.
    3. Mini hazırlık için 3-5 mL bakteri kullanın veya maxi-prep için başlangıç kültürü olarak kullanın. Bakteri kültürü oranında % 100 gliserol ekleyerek bakterilerin geri kalanını bakteriyel gliserol stoku olarak kullanın:gliserol 1:1'dir.
      NOT: Burada, mini hazırlık prosedürünü açıklayacağız.
  2. Mini hazırlık prosedürü
    1. 1 dakika boyunca 12.000 x g'da 3-5 mL bakteri hücresi ve santrifüj hasat edin.
    2. Bakteri hücrelerinin peletini RNase A içeren ve 4 °C'de depolanan 200 μL P1 tamponu ile yeniden depolar.
    3. 200 μL tampon P2 ekleyin ve sıvı netleşene kadar tüpü 10 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
    4. 300 μL tampon P3 ekleyin ve tüpü 10 kez ters çevirerek karıştırın. Sıvı bulanıklaşacak. Numuneleri 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleme ile hemen devam edin.
    5. 1 dakika boyunca 12.000 x g'da spin sütununa ve santrifüje net bir süpernatant aktarın.
      Akışa geç.
      NOT: Süpernatantın açıklığa kavuştukğından emin olun. Parçacıklar spin sütununu tıkayabilir ve sütun etkinliğini azaltabilir.
    6. 1 dakika boyunca 12.000 x g'da 400 μL PD tampon ve santrifüj ekleyin. Akışa geç.
    7. Spin sütununu ve santrifüjü 1 dakika boyunca 12.000 x g'da yıkamak için 600 μL PW tampon ekleyin. Akışa geç.
    8. Tampon kalıntılarını gidermek için spin sütununu 3 dakika boyunca en yüksek hızda tekrar santrifüjlayın. Akışı atın ve 2 dakika bekletin.
    9. Spin sütununu yeni bir tüpe yerleştirin ve 50 μL elution tamponu ekleyin. 5 dakika kuluçkaya yatır ve 2 dakika en yüksek hızda santrifüj.
    10. SgRNA kesici uç (ng/μL) ile saflaştırılmış DD-Cas9 plazmid konsantrasyonunu ölçmek için nanodrop cihazını kullanın.
  3. SgRNA klonlamayı DD-Cas9 plazmidinin DNA dizilimi ile doğrulayın. Tablo 2'dekiU6 astar sırasını kullanın.

6. Lentiviral hazırlık

  1. HEK293T ambalaj hücrelerini transfection için hazırlayın.
    1. 10.geçişe kadar sağlıklı HEK293T kullanın ve 10 cm doku kültürü plakası başına 1-2 x10 6 hücre yoğunluğunda eşit olarak tohumlayın. %10 filtreli Fetal Sığır Serumu (FBS) ile 10 mL Glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) kullanın. Doku kültürü inkübatöründeki hücreleri20 saat boyunca% 5 CO 2 ve 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    2. Ertesi gün, hücrelerin brightfield mikroskopisi ile% 70 izdiah ulaştığından ve plaka boyunca eşit olarak dağıldıklarını onaylayın. Son hacmi 10 mL olan transfectiondan 1 saat önce ortamları hücrelere değiştirin.
      NOT: Medyada antibiyotik ve antimycotics bulunmamalıdır.
    3. 2 tüpün karışımını 500 μL sıcak ortamla hazırlayın (örneğin, OptiMEM).
      1. Sıcak 500 μL ortam içeren tüp 1'e 25 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. Bu arada, klonlanmış sgRNA içeren 3,5 μg DD-Cas9, ambalaj plazmidi (psPAX2) içeren 6 μg ve zarf plazmidinin (pMD2.G) 3 μg'sını içeren tüp 2'ye 500 μL ortama plazmid karışımı hazırlayın.
      3. Bir transfeksiyon karışımı oluşturmak için tüp 1'i tüp 2 ile karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
      4. Kan nakli karışımını HEK293T hücrelerine bırakın ve doku kültürü inkübatöründe bir gecede% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübatör plakası.
      5. 18 saat sonra, transfeksiyon reaktifini çıkarmak için ortamı %10 FBS ile 10 mL taze DMEM'e dikkatlice değiştirin. Sonraki 48 saat kuluçkaya yatır.
      6. 48 saat sonra, süpernatantı 10 mL şırıng ile toplayın ve 0,45 μm filtreden geçirin.
      7. Aliquot ve virüs süpernatant -80 °C saklayın.

7. Akış sitometrisi ile virüs titresinin ve transdüksiyon etkinliğinin belirlenmesi

  1. HEK293T hücrelerini 5 x 105 hücreli/ kuyulu 6 kuyulu bir tabağa tohumla. İki 6 kuyu plakasına tohum hücreleri. Ertesi gün saymak için bir tabak kullanın.
  2. İnkübatördeki plakaları 37 °C, %95 nem, %5 CO2'de bir gecede kuluçkaya yatırarak ertesi gün %50-60 izdiah eder.
  3. Ertesi gün, 6 kuyudaki hücreleri saymak için 6 kuyu plakalarından birini kullanın.
  4. Seri seyreltmeyi gerçekleştirmek için kullanılacak virüs aliquotunu çözün ve 8 μg / mL polibren reaktif ekleyin.
  5. Virüsün seri seyreltilmesi için %10 FBS ile DMEM hazırlayın ve 8 μg/mL polibren reaktif ekleyin.
  6. Polibren içeren ortamda lentivirüs 1 x 10 -1 ila 1 x10 -4 arasında 2 mL on kat seri seyreltme hazırlayın.
  7. Medyayı 6 kuyu plakasından çıkarın ve kuyulara 1 mL viral seyreltme ekleyin. Bir kuyuda medya ile negatif kontrol olarak, bir kuyuda ise %100 virüs bırakın.
  8. 24 saat boyunca inkübatörde virüsle hücreleri kuluçkaya yatırın.
  9. Ertesi gün, virüslü medyayı 6 kuyu plakalarından çıkarın ve% 10 FBS ile 2 mL taze DMEM için değiştirin. Hücreleri 48-72 saat kuluçkaya yatır. Her gün floresan mikroskop kullanarak GFP'ye dikkat edin.
  10. 48-72 saat sonra hücreleri ayırın ve MACS arabelleğine yeniden biriktirin.
  11. GFP ifadesinin yüzdesini belirlemek için bir akış sayacı kullanın.
  12. Aşağıdaki formülü kullanarak virüs titresini hesaplayın: TU/mL = (Dönüştürülen hücre sayısı x Yüzde floresan x Seyreltme Faktörü)/(mL'de Transdüksiyon Hacmi)

8. Hedef hücrelerin lentiviral transdüksiyon

  1. İlgi çekici hücre hattını 10 cm'lik bir plakaya plakala ve ertesi gün% 50-60 izdiah ulaşmak için gece boyunca kuluçkaya yatırın.
    NOT: DD-Cas9 ve iki bağımsız RPA3 gen sgRNA'yı ifade eden A549 hücre hattını kullandık. Renilla kontrolü ile vektörü ifade eden A549 hücre hattını da kullandık. Bu hücreleri 2 x 103hücre/cm2 yoğunluğunda tohumladık ve ertesi gün % 50-60 izdiah etmek için bir gecede 37 °C, %95 nem, %5 CO2'de kuluçkaya yatırdık. %10 filtrelenmiş FBS ile RPMI ortam kullandık. Aşağıdaki gibi sonraki adımlarla devam ettik:
  2. Ertesi gün, hücrelere 10 mL toplam kültür ortamında 500-2000 μL virüs partikülleri bulaştırın. Viral medyayı 24 saat kuluçkaya yatır.
  3. Ertesi gün, viral ortamı kültür ortamına değiştirin ve akış sitometrisi kullanarak GFP pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
  4. GFP pozitif hücrelerini FACS hücre sıralama veya bleomiscin seçimi kullanarak seçin.
  5. Pozitif olarak seçilen hücreleri genişletin ve bir stoğu dondurun.

9. Cas9 aracılı gen düzenlemesinin koşullu indüksiyonu

  1. Plaka pozitif olarak seçilen hücreler enfeksiyondan 24 saat sonra ve çevrilmemiş hücreler ayrı ayrı 12 kuyu plakasına. Hücreler takılana kadar bekleyin ve ortamı 200 nM Shield-1 içeren hücre kültürü ortamına değiştirin. Plakalardaki ortamı transdüklenmiş ve çevrilmemiş hücrelerle değiştirin ve plaka başına 2 kuyuyu negatif kontrol olarak normal ortamla bırakın.
  2. Shield-1'i kuyulara ekledikten sonra her kuyudan farklı zaman noktalarında proteinleri kuluçkaya yatırın ve çıkarın: zaman 0, 2 saat, 6 saat, 12 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saat.
  3. Ardından Shield-1 ile medyayı kuyuların geri kalanından çıkarın ve normal hücre ortamı için değiştirin.
  4. Ortamı değiştirdikten sonra proteinleri 2 saat, 6 saat ve 12 saat bu kuyulardan toplayın.
  5. Batı blot analizi ile dengelenmiş DD-Cas9 protein regülasyonunun geri döndürülebilirliğini ve hızlılığını ligandının eklenmesinden ve geri çekilmesinden sonra görselleştirin, Shield-1. Proteinleri görselleştirmek için DYKDDDDK Etiketine yönelik antikor ve örneğin beta-tubulin için bir kontrol antikor hedeflemesi kullanın.
  6. Batı Blot analizi tarafından gözlenen doz-tepki eğrisi ile En uygun Shield-1 dozunu belirleyin.

10. Gen düzenlemenin doğrulanması

NOT: Akış sitometri analizi ve bleomisin seçim işaretçisi gibi GFP ifade tahlilleri yalnızca başarılı CRISPR reaktif iletimini onaylar, ancak istenen sıranın başarıyla hedef olup olmadığını belirlemez. CRISPR deneyi ile başarılı gen hedeflemesini doğrulamak için en yaygın tahliller Sanger DNA dizilimi, Yeni nesil dizileme, Surveyor Nuclease Tahlil, Ayrışma (TIDE) Testi ile Indels'in İzi veya batı leke analizi16,17,18 'dir.

  1. Pozitif olarak seçilen hücreleri plakala ve ortamı ortam içeren 200 nM Shield-1'e değiştirin. Hücreleri 5 gün boyunca kuluçkaya yatırarak, her 3 günde bir Shield-1 ile ortamları değiştirir.
  2. Shield-1 tarafından DD-Cas9 indüksiyondan 5 gün sonra yukarıda belirtilen doğrulama tekniklerini kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cas9'un koşullu ifadesini etkinleştirmek için, sgRNA'yı kurucu olarak ifade etmek için U6 tahrikli bir promotörden ve DD-Cas9 füzyon proteininin ekspresyonunu yönlendirmek için bir EF-1α çekirdek promotöründen oluşan çift lentiviral vektör yapısı geliştirdik (Şekil 1A)19. Sistemin sağlamlığını ve verimliliğini göstermek için bir paradigma olarak, akciğer karsinomatöz A549 hücre hattını lentiviral yapı ile transdükledik. Ligand Shield-1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9 teknolojisi, genomları işlevsel olarak sorgulama yeteneğinde devrim yaptı2. Bununla birlikte, genlerin inaktivasyonu genellikle hücre öldürücülüğü, fonksiyonel eksiklikler ve gelişimsel kusurlarla sonuçlanır ve gen fonksiyonlarını incelemek için bu tür yaklaşımların yararını sınırlar7. Ayrıca, Cas9'un kesin ifadesi toksisiteye ve hedef dışı etkilerin üretilmesine neden olabilir6. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme teknolojilerini zamansa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarımızın önceki üyelerine ve bilim insanı Serif Şentürk'e önceki çalışmalarından dolayı teşekkür ediyoruz. Danilo Segovia'ya bu makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma Swim Across America ve National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center programı tarafından mümkün ve desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100mM DTTThermosfisher
10X FastDigest tamponThermosfisherB64
10X T4 Ligasyon TamponuNEBM0202S
kolorimetrik BCA kitiPierce23225
DMEM, yüksek glikoz, glutaMaxThermo Fisher10566024
FastAPThermosfisherEF0654
FastDigest BsmBIThermosfisherFD0454
Bayrak [M2] fare mAbSigmaF1804-50UG
Genomik DNA ekstraksiyon kitiMacherey Nagel740952.1
lipofektamin 2000Invitrogen11668019
Phusion Yüksek Sadakatli DNA PolimerazNEBM0530S
oligonükleotidlerSigma Aldrich
pMD2.GAddgene12259
polibrenSigma AldrichTR-1003-G
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR & Jel Temizleme KitiQiagen28506
ikincil antikorlarLICOR
Shield-1Cheminpharma
Stbl3 yetkin bakteri hücreleriThermofisherC737303
SURVEYOR Mutasyon Tespit KitiTransgenomik/IDT
T4 PNKNEBM0201S
Taq DNA PolimerazNEBM0273S
&alfa;-tübülin [DM1A] fare mAbMilliporeCP06-100UG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149(2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569(2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888(2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370(2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113(2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297(2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269(2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Conditional Cas9 StabilizationCRISPR Cas9 Gene EditingShield 1 Inducible SystemDD Cas9 DestabilizationBicistronic Vector DesignFlow Cytometry AnalysisLentivirus Titer DeterminationHEK293T Cell CultureEssential Gene CharacterizationTumor Survival Gene Study

Related Articles