Label-Free Empedans Tabanlı GPCR Denemelerinde Artırılmış İş İlerletme Protokolü

Summary

Bu protokol, etiketsiz empedans ölçümleri kullanılarak tek bir mikroelektrot üzerinde yetiştirilen tek bir hücre tabakasından agonist kaynaklı GPCR aktivasyonu için tam doz-yanıt ilişkilerinin gerçek zamanlı kaydını göstermektedir. Yeni dosing şeması, zaman çözümlü zaman kaybı olmadan iş buzunu önemli ölçüde artırır.

Abstract

Etiketsiz empedans bazlı tahliller, hücre kültürü deneylerinde ligand kaynaklı GPCR aktivasyonunu invaziv olmayan olarak incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, aygıta bağlı zaman çözünürlüğü yle gerçek zamanlı hücre izleme sağlar ve bu durum çok yüksek derecede otomatiktir. Ancak, örnek sayıları nidik aldığında (örneğin, çeşitli ligandlar için doz-yanıt çalışmaları), tek kullanımlık elektrot dizilerinin maliyeti ve sıralı iyi kuyu kayıtları için kullanılabilir zaman çözünürlüğü sınırlayıcı hale gelebilir. Bu nedenle, burada önemli ölçüde etiket içermeyen GPCR tahlilçıktısını artırmak için potansiyele sahip bir seri agonist ek protokolü sıyoruz. Seri agonist ekleme protokolü kullanılarak, bir GPCR agonist sürekli örnek empedans (agonist modu) izlerken tek bir hücre katmanına artan konsantrasyonları artarda eklenir. Bu seri yaklaşım ile, artık sadece tek bir hücre tabakasından bir GPCR agonist için tam doz-yanıt eğrisi kurmak mümkündür. Seri agonist ekleme protokolü farklı GPCR kaplin tipleri, G_q G_i/0 veya G_s için geçerlidir ve çalışma altındaki reseptörün rekombinant ve endojen ekspresyon düzeyleri ile uyumludur. GPCR antagonistleri tarafından reseptör blokesi de değerlendirilebilir (antagonist mod).

Introduction

Bu rapor, bağlı olarak yetiştirilen hücrelerde ligand kaynaklı G protein-çiftreseptör (GPCR) aktivasyonunun etiketsiz empedans ölçümleri ile ölçülmesi için geliştirilmiş seri ek protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. G protein-coupled reseptörleri (PcF) fizyolojik fonksiyonlar ve insan hastalıkları¹çok sayıda yer almaktadır. Bu ve hücre yüzeyinde ki iyi erişilebilirlik nedeniyle, GPCR en önemli uyuşturucu hedeflerinden biridir. Bu değerlendirme, tüm pazarlanan ilaçlar²~% 35 paya eşdeğer, GPCR hedefleyen ~ 700 onaylı ilaçların tahmini sayısı yansıtılır.

Yeni ilaçların geliştirilme....

Protocol

1. Elektrot dizileri üzerinde hücre tohumlama

NOT: Elektrot düzeninin seçimi, hassaslık ve çalışıldaki hücre sayısı arasında bir dengedir. Elektrot ne kadar küçükse, ölçüm o kadar hassastır, ancak çalışıldaki hücre sayısı da o kadar küçüktür. Temel koşullar altında zaman içinde güçlü empedans dalgalanmaları gösteren hücreler için, daha büyük veya interdigitated elektrotlar tercih edilir.

1. 37 °C'lik bir su banyosunda standart hücre geçişi ve tohumlama için gerekli tüm çözeltiler önceden ısıtın. İnsan U-373 MG hücreleri ile tahliller için alır: kalsiyum ve magnezyum olmadan fosfat tamponlu salin (PBS), %0.05 (w/v) tripsin, hücre kült....

Results

Çeşitli agonist çözümleri hazırlamak için tipik bir şema Tablolar 1-4agonist olarak histamin ile 8-iyi elektrot dizileri kullanarak bir deney için gösterilir. Tablo 1 ve Tablo 2, ek modu 1 (cf., Şekil 1)kullanılarak bir deney için mevcut hacimleri ve konsantrasyonları bulunurken, Tablo 3 ve Tablo 4 ek modu 2'yi izleyen bir deney için hacimleri ve konsantrasyonları sunar (cf........

Discussion

Bu protokol, aynı reseptör için özel antagonistlerin yokluğunda veya varlığında agonist indüklenen GPCR aktivasyonunun doz-yanıt ilişkisini belirlemek için etiketsiz empedans ölçümleri için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntemin kavramının kanıtı yeni bir yayında^{sunulmuştur 12}. Bilgimiz için in vitro tek bir hücre tabakası kullanarak agonist aracılı GPCR aktivasyonu tam doz-yanıt eğrisi kurulması açıklayan ilk çalışmadır. Bu yaklaşım kaçınılmaz olarak etiketsiz hücre izleme yaklaşımlarının kullan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bü rker sayma odası	Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Almanya)	640210
hücre kültürü şişeleri 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Almanya)	690175
Hücre inkübatörü (Heraeus Fonksiyon Hattı BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Almanya)	\
Santrifüj (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Almanya)	\
Difenhidramin hidroklorür	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Almanya)	D3630
4.5 g/L D-Glikoz ve 2.2 g/L NaHCO içeren Eagle'ın Minimum Temel Ortamı3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Almanya)	D5671
Empedans Cihazı (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, ABD)	\
8 kuyulu elektrot Dizileri (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, ABD)	\	PET tabanı ile 0,049 mm2 çalışma elektrodu ve ~50 mm2 karşı elektrot (altın
)96 oyuklu elektrot dizileri (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, ABD)	\	0,256 mm 2 toplam elektrot alanına sahip iki elektrotlu (altın) PET taban
Fetal buzağı serumu (FCS)	Biochrom (Berlin, Almanya)	S0615
Histamin dihidroklorür	Carl Roth (Karlsruhe, Almanya)	4017.1
Laminer akış başlığı (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Almanya)	51022515	sınıf II güvenlik kabini
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Almanya)	21083-027
L-glutamin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Almanya)	G7513
Mikropipet büyük (100 - 1000 & mikro; L)	Brandt (Wertheim, Almanya)	704780
Mikropipet büyük (20 - 200 & mikro; L)	Brandt (Wertheim, Almanya)	704778
Mikroskop (faz kontrastı, Nikon Diaphot)	Nikon (Dü sseldorf, Almanya)
Penisilin/streptomisin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Almanya)	P0781
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Almanya)	D8537
Pipet, serolojik	Greiner bio-one (Frickenhausen, Almanya)	607 180
Pipetleyici (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Almanya)	26300
1 mM EDTA Tüplü PBS'de	Tripsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Almanya)	T4174
, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Almanya)	188 271
Tüp, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Almanya)	210 261
U-373 MG hücre	ATCC (Rockville, MD, ABD)	ATCC HTB-17
su banyosu (TW21)	Julabo (Seelbach, Almanya)	\