İntravital Mikroskopi ile Zebrabalığı Embriyolarında Mikobakteriyel Enfeksiyon Sırasında Makrofaj Litik Hücre Ölümünün Görüntülenmesi

Mikobakteriyel enfeksiyon konak bağışıklık hücresi ölümüne neden olduğu gösterilmiştir¹. Örneğin, zayıflatılmış bir suş makrofajlarda apoptosis tetikler ve enfeksiyon içerir. Ancak, öldürücü bir suş litik hücre ölümü tetikleyecek, bakteriyel yayılmasına neden^1,2. Bu farklı hücre ölümü türlerinin konak anti-mikobakteriyel yanıt üzerindeki etkisi göz önüne alındığında, in vivo mikobakteriyel enfeksiyon sırasında makrofaj hücre ölümünün ayrıntılı bir gözlemine ihtiyaç vardır.

Hücre ölümünü ölçmek için geleneksel yöntemler ölü hücre lekeleri kullanmak için, Annnexin V gibi, TUNEL, veya acridine turuncu / propidium iyodür boyama^3,4,5. Ancak, bu yöntemler in vivo hücre ölümü dinamik sürecine ışık tutmak mümkün değildir. Hücre ölümünün in vitro gözlemi zaten canlı görüntüleme⁶ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, sonuçların fizyolojik koşulları doğru bir şekilde taklit edip etmediği belirsizliğini koruyor.

Zebra balığı konak anti-micobacterium yanıtları incelemek için mükemmel bir model olmuştur. Bu insanların benzer bir son derece korunmuş bağışıklık sistemi vardır, kolayca manipüle genom, ve erken embriyolar şeffaf, hangi canlı görüntüleme sağlar^7,8,9. M. marinum enfeksiyonu ndan sonra, yetişkin zebra balıkları tipik olgun granülom yapıları oluşturur, ve embriyonik zebrabalık yapıları gibi erken granülom formu^9,10. Doğuştan gelen bağışıklık hücre-bakteri etkileşiminin dinamik süreci daha önce zebra balığı M. marinum enfeksiyonu modeli^11,12araştırılmıştır. Ancak, yüksek mekansal-zamansal çözünürlük gereksinimi nedeniyle, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin ölümü çevreleyen ayrıntılar büyük ölçüde tanımsız kalır.

Burada in vivo mikobakteriyel enfeksiyonun tetiklediği makrofaj litik hücre ölümü sürecini nasıl görselleştirebileceğimizi anlatıyoruz. Bu protokol aynı zamanda geliştirme ve inflamasyon sırasında in vivo hücresel davranışı görselleştirmek için de uygulanabilir.

Zebra balıkları, hayvan refahının etik olarak gözden geçirilmesi için laboratuvar hayvanı yönergelerine uygun olarak standart koşullar altında yetiştirilmiştir (GB/T 35823-2018). Bu çalışmadaki tüm zebra balığı deneyleri onaylandı (2019-A016-01) ve Fudan Üniversitesi Şangay Halk Sağlığı Klinik Merkezi'nde gerçekleştirildi.

1. M. marinum Tek Hücreli Inokül Hazırlama (Şekil 1)

1. -80 °C'den gelen eritme Cerulean-floresan M. marinum gliserol stokve % 10 (v /v) OADC, %0.25 gliserol ve 50 μg/mL higromisin ile 7H10 agar plakayı inoküle edin. Plakayı yaklaşık 10 gün boyunca 32 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. Pozitif floresans ifade eden bir koloni seçin ve % 10 OADC, %0.5 gliserol ve 50 μg/mL higromisin ile 7H9 orta 3 mL aşılamak.
   1. Kültür logaritmik faza ulaşana kadar (OD₆₀₀ = 0.6-1.0) dakikada 32 °C ve dakikada 100 devir (rpm) aşıkuluçka.
   2. Subkültür (1:100) 30 mL taze 7H9 orta% 10 OADC, 0.5% gliserol, 0.05% Tween-80 ve 50 μg/mL kadar OD₆₀₀ ~ 1.0 ulaşır.
      NOT: En yüksek kültür kalitesi için bu noktada bir alt kültür adımı önerilir. Deneyimlerimize göre, klonu doğrudan büyük bir ortam hacmine eklemek bakteriyel kümelerin oluşmasına yol açacaktır.
3. Aşağıda açıklandığı gibi M. marinum hücrelerini toplayın.
   1. Bir pelet olarak M. marinum toplamak için 10 dakika için 3.000 x g santrifüj. Supernatant'ın 300 μL'si hariç hepsini atın ve peleti yeniden susumak için kullanın.
   2. Pelet daha fazla askıya almak için% 10 gliserol ile 7H9 orta 3 mL ekleyin, sonra 100 W bir su banyosunda süspansiyon sonicate 15 s ON, 15 toplam 2 dakika OFF.
      NOT: Sonication amacı inokül için tek bir hücre homojen elde etmektir, hangi mikroenjeksiyon iğnetıkanıklığı önleyecektir.
4. Bakteriyel süspansiyonu 10 mL şırıngaya aktarın, ardından bakteri kümelerini temizlemek için 5 m'lik bir filtreden geçirin.
5. Süspansiyonun optik yoğunluğunu (OD) bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve %10 gliserol içeren 7H9 ortamla OD₆₀₀ = 1.0'a seyreltin. Süspansiyonu 10°L'lik dereceye bölün ve ileride kullanılmak üzere -80 °C'lik dondurucuda saklayın.
6. OADC'nin %10'u (v/v) içeren 7H10 agar plakasında, gliserol %0.5'i ve higromisinin 50 g/mL'si içeren bakteri stokunun seri seyreltme ve kaplama ile inokülün (cfu/mL) bakteri konsantrasyonunun doğrula.

2. Zebrabalığı Embriyo Hazırlama

1. Yumurtlamadan bir gün önce üreme odasında zebra balığı üreme çiftleri kurduk.
   NOT: Her üreme odasına sadece bir çift ekleyin.
2. 1 saat sonrası döllenme (hpf) içinde ertesi sabah embriyoları toplamak. Embriyoları damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın ve 100 embriyoyu 30 mL E3 orta içeren 100 mm Petri kabına aktarın. 28.5 °C'de kuluçka ya.
3. 12 saat sonra, bir mikroskop altında gözlemlemek ve döllenmemiş veya hasarlı yumurta atın.
4. 24 hpf'de, pigment gelişimini önlemek için ortamı N-phenylthiourea (PTU, 0.2 nM son konsantrasyonu) ile taze E3 ortamına çevirin. Embriyolar mikroenjeksiyon alanına kadar 28.5 °C'de embriyoları kuluçkaya yatırın.

3. Bakteriyel Mikroenjeksiyon ile Enfeksiyon

1. Daha önce referans¹³açıklandığı gibi borosilikat cam mikrocapiller enjeksiyon iğneleri hazırlayın.
2. Zebra balığı embriyoları enfeksiyon için montaj
   1. Mikrodalga 100 mL% 1 (w / v) ve 100 mL 0.5% (w / v) düşük erime agarose bir otoklavlı E3 ortamda agarose tamamen eriyene kadar. 1 mL aliquot tüplere bölün ve ileride kullanılmak üzere 4 °C'de saklayın.
   2. Kullanmadan önce agarose'u 95 °C'lik bir ısıtma bloğunda tamamen eriyene kadar ısıtın. Agarose'u 45 °C'lik bir ısıtma bloğuna yerleştirerek sıvı halde muhafaza edin (Şekil 2).
   3. Gövde bölgesinde kas içi enfeksiyon için montaj
      1. 0,5 mL%1 (w/v) agarose'u cam bir kaydıra eşit olarak dökerek alt agarose tabakasını oluşturun. Katılaşmak için 3 dakika boyunca bir buz kutusu veya soğuk yüzeye yerleştirin.
      2. Zebra balığı embriyolarını (48-72 hpf) yumurta suyunda tricaine (200 μg/mL) ve PTU'yu montajdan önce 5 dakika süreyle anestezi edin. Alt agarose tabakasına 60 zebra balığı embriyosu yerleştirin ve bunları dikkatlice iki sıra halinde yerleştirin(Şekil 2B).
      3. Üst tabaka oluşturmak için 0.3 mL% 0.5 (w / v) agarose eklemeden önce doku kağıt ile alt agarose tabakası üzerinde kalan su çıkarın. Embriyoların agarose'a tamamen gömülü olduğundan emin olun. Agarose katılaşmak ve dehidratasyon önlemek için tekrar buz kutusuna cam slayt dönün.
      4. Ekstra E3 yumurta suyu ile yüzeyi kaplayarak agarose üst tabakası nemli tutun.
   4. Orta beyin enfeksiyonu için montaj
      1. Tek bir konkavite cam mikroskopi slaytının oluğunu %1 (w/v) agarose ile kaplayın ve sonra 4-6 triain-anestezili embriyoları agarose'a aktarın.
      2. Her embriyonun başını 10 G iğneyle dikkatlice yukarı doğru yerleştirin(Şekil 2C).
      3. Tüm embriyoların pozisyonları sabit olduktan sonra, agarose katılaşmak için bir buz kutusu veya soğuk yüzey için cam slayt aktarın.
         NOT: Embriyolar ile yumurta suyu transferi hacmini en aza indirerek düşük erime agarose seyreltme kaçının.
3. Enfeksiyon için bakteri hazırlığı
   1. 1 μL steril filtrelenmiş fenol kırmızısını (10x) 10 μL'lik bakteriyel stoka ekleyin (adım 1'de üretilir) ve kısa bir süre girdap yaparak karıştırın.
      NOT: Son konsantrasyon steril PBS kullanılarak ayarlanabilir.
   2. 10 s ON 100 W kullanarak hazırlık Sonicate,¹⁴oluşmuş olabilir herhangi bir kümeleri kırmak için 1 dk için 10 s OFF .
4. Mikroenjeksiyon ile enfeksiyon
   1. Mikroenjektör ve mikromanipülörü daha önce¹³olarak bildirilen mikroenjeksiyon için uygun konuma ve ayarına ayarlayın.
   2. Hazırlanan iğneye mikro yükleyici kullanarak bakteri preparatının 3 μL'sini aktarın (bkz. adım 3.1). Pipet yavaş ve dikkatli hava kabarcıkları oluşturan önlemek için.
   3. Gövde bölgesi enfeksiyonu için gövde bölgesine 100 cfu enjekte edin (Şekil 3A). Notochord içine bakteri enjekte kaçının.
      NOT: Enjeksiyon için cfu formülü cfu = bakteriyel stok konsantrasyonu x seyreltme faktörü x enjeksiyon damlacık hacmi ile tahmin edilmektedir. Gerçek cfu oadc% 10 (v / v) içeren bir 7H10 agar plaka üzerinde bakteriyel inokül bir damla kaplama ile doğrulanır, gliserol% 0.5, ve higromisin 50 g/mL.
   4. Orta beyin enfeksiyonu için, orta beyin bölgesine yaklaşık 500 cfu enjekte edin (Şekil 3B).
   5. Mikroenjeksiyondan sonra zebra balığı embriyolarını plastik bir pipetle temiz yumurta suyuna dikkatlice yıkayın.
      NOT: Embriyoları cam alt çanağa monte edin ve çok erken gelen bağışıklık hücresi yanıtının gözlemini kapsayacak şekilde mümkün olan en kısa sürede.

4. Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi

1. Canlı görüntüleme için balık montajı
   1. 10 triaine anestezili embriyoyu cam dip35 mm'lik bir kabın ortasına aktarın. Ekstra E3 ortamı atın.
   2. Çanak% 1 düşük erime noktası agarose ile çanak kapak ve dikkatle 10 G iğne kullanarak zebrabalığı embriyoları yönlendirmek. Agarose katılaşmak için 10 s buz üzerinde cam alt çanak kuluçka.
      NOT: Orta beyin enjeksiyonu için embriyolar baş yukarı doğru yönlendirilmiş agarose monte edilmelidir(Şekil 4A). Gövde bölgesi intramüsküler enfeksiyon için embriyolar agarose'a yanal monte edilmelidir (Şekil 4B).
   3. Bir kez tamamen katılaşmış, yumurta suyu bir tabaka (artı 1 x tricaine ve PTU) ile agarose kapağı.
2. Üç renkli yüksek çözünürlüklü zamanlı zamanlı konfokal mikroskopi
   NOT: Aşağıdaki adımlar 63.0x 1.40 yağ UV objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskopi ile çalıştırılır.
   1. Çevre odasının sıcaklığını 28,5 °C olarak ayarlayın. Nem sağlamak ve yumurta suyunun buharlaşmasını önlemek için odanın içine ıslak mendil kağıdı yerleştirin(Ek Şekil 1).
   2. 35 mm'lik cam alt kabı zebra balığıyla çevre odasına yerleştirin.
   3. Konfokal yazılımı açın ve sahneyi açın. 63.0 x 1.40 yağ UV hedefine geçin ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) filtreile parlak alan kanalını kullanarak zebra balığını bulun.
   4. Açık 405 Diyot, Argon (%20 güç), ve DPSS 561 nm lazer. Uygun lazer güç ve spektrum ayarlarını ayarlayın.
      NOT: Cerulean (uyarma = 405 nm; emisyon = ~456-499 nm), eGFP (uyarma = 488 nm; emisyon = ~500-550 nm), DsRed2 (excitation = 561 nm; emisyon = ~575-645 nm)(Ek Şekil 2B)için spektrum ayarları aşağıdaverilmiştir.
   5. "XYZ" "Sıralı Tetkik" satın alma modunu seçin ve görüntü biçimini "512 x 512 piksel" olarak ayarlayın (Ek Şekil 2A).
   6. "Canlı Veri Modu" na geçin. İlk zebra balığının konumunu hedefleyin ve "Begin" ve "End" Z pozisyonunu işaretleyin. Kalan embriyoların her biri için bu işlemi tekrarlayın. Programın sonuna "Duraklatma" eklenebilir (Ek Şekil 2C).
   7. Programın döngüsünü ve döngüsünü tanımlayın.
   8. Dosyayı kaydedin.

5. Apoptosis ve Canlı Görüntüleme Induce Tek Hücreli UV Işınlama

1. 4.1. adımda açıklandığı gibi balık dağı.
2. 3 gün sonrası döllenme (dpf) makrofaj spesifik transgenik Tg(mfap4-eGFP) ^embriyo15 orta beyin bölgesinin görüntülenmesi
3. Tek bir floresan etiketli makrofajın ilgi bölgesini seçin ve 50 s için 400 Hz hızda ve %6 UV lazer gücüyle tarar.
   NOT: Tarama hızı ve zamanı tek tek mikroskoba göre optimize edilmelidir. Tarama süresi daha sonra hedef hücre apoptosis neden olacak geniş DNA hasarına neden olacak optimize edilmelidir, ancak tüm hücre photobleach değil.
4. Daha fazla hedef hücreışına ışınlamak için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
5. Bölüm 4'te açıklandığı gibi orta beyin bölgesinin zaman atlamalı görüntülemesini yapın.

6. Görüntü İşleme

1. Edinilen görüntüler için "Maksimum Projeksiyon" gerçekleştirin.
2. "Maksimum Projeksiyon" görünümü altında hedef hücrelerin XY konumunu ve zamanını bulun ve işaretleyin.
3. Hedef hücrelerin Z konumunu bulmak ve işaretlemek için standart görünüme geri dön.
4. Hedef hücrelerin tek katmanlı görüntüsünü kırpma.
5. Bindirme kanalını ve parlak alanı video olarak AVI formatında dışa aktarın.
6. ImageJ'deki bindirme kanalının ve parlak alanın ilgi alanını kırPın.
7. Son adımda iki videoyu dikey olarak birleştirin ve ImageJ'de bir AVI formatında video olarak kaydedin.

Mycobacterium enfeksiyonu enfeksiyon yollarına göre farklı konak yanıtları tetikleyebilir. Bu protokolde zebra balığı embriyoları orta beyne veya gövdeye floresan etiketli bakterilerin intramüsküler mikroenjeksiyonuileenfekte olmuş ve konfokal canlı görüntüleme ile gözlenmiştir. Bu iki yol üzerinden enfeksiyon yerel doğuştan gelen bağışıklık hücresi işe ve sonraki hücre ölümüne neden enfeksiyon kısıtlar.

Doğuştan gelen bağışıklık hücresi ölümünün ayrıntılarını görselleştirmek zordur. Litik hücre ölümü çok kısa bir süre içinde meydana gelir ve gözlemlemek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi gerektirir. Ayrıca, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin yüksek hareketlilik onları gözlem alanı dışına göç sağlar. Bu protokolde, birden fazla embriyoya paralel olarak gözlemleyerek bu sorunu çözüyoruz. Bir dizi zebra balığı embriyosu enfeksiyon için tek bir cam mikroskop kaydıraja monte edilebilir ve canlı görüntüleme için aynı 35 mm cam alt tabağa 10 embriyo monte edilebilir(Şekil 4). Konfokal mikroskopinin canlı veri modelinden yararlanılarak aynı anda birden fazla embriyo görülebilir. Bu canlı görüntüleme verimliliğini artırır ve büyük ölçüde tüm litik hücre ölüm sürecini yakalama olasılığını artırır.

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi mikobakteriyel enfeksiyona karşı ilk savunma hattıdır ve iki temel bileşen makrofaj ve nötrofildir. Burada daha önce bildirilen Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) ve Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) in vivo16, 17,18makrofajları ve nötrofilleri ayırt etmek için kullanıyoruz. Bir makrofaj ağır bakteri ile tıkanmış yuvarlak oldu ve azaltılmış hareketlilik görüntülenen, nihai sitoplazmik şişme ile, hücre zarının yırtılması, ve sitoplazmik içeriğin hızlı yayılması. Bu olaylar daha önce bildirildiği gibi litik hücre ölümünün tipik morfolojik değişimleridir (Şekil 5A)16. UV ışınlama zebrabalığı apoptosis geçmesi için hücreleri tetiklemek için kullanılmıştır20,21. Bu kavram la tutarlı olarak, UV ışınlanmış makrofajlar hücre büzülmesi, nükleer parçalanma ve kromatin yoğuşması gibi tipik apoptotik hücre fenotipleri gösterdi (Şekil 5B)22,23. Cerulean-floresan M. marinumkullanımı ile birlikte19, makrofaj arasındaki etkileşimin üç renkli canlı görüntüleme, nötrofil, ve M. marinum in vivo elde edildi. Ayrıca makrofajların aktif olarak fagosittoz ve M. marinum yayabileceğini gözlemledik (Ek Şekil 3A). Ancak nötrofillerin fagositik yeteneği sınırlıdır ve belirgin bakteriyel tıkanmadan hızlı bir şekilde litik hücre ölümü geçirmiştir (Ek Şekil 3B). Nötrofiller, Cerulean-floresan ifade etmez sadece birkaç ölü M. marinum fagositoz tarafından tetiklenebilir, ya da sadece sınırlı ölü hücre enkaz fagositoz tarafından.

Şekil 1: Tek hücreli bakteri hazırlığının şematik diyagramı. Açıklanan işlemin ardından tek hücreli Cerulean-floresan M. marinum stokları üretildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mikroenjeksiyon için monte zebra balığı embriyo diyagramı. (A) Montaj işleminin şematik diyagramı. (B) Zebra balığı embriyoları gövde bölgesinin enfeksiyonu için yanal olarak monte edildi. (C) Zebra balığı embriyoları kafalarını yukarı doğru orta beyin enfeksiyonu için yönlendirilen monte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mikroenjeksiyon için konumlandırma. (A) Kırmızı ok gövde bölgesienfeksiyon için enjeksiyon bölgesigösterir. (B) Kırmızı ok, orta beyin enfeksiyonu için enjeksiyon bölgesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Canlı görüntüleme için zebra balığı embriyolarının montajı. (A) Orta beyin enfeksiyonu için, zebra balığı embriyoları başları aşağıya doğru yönlendirilmiş olarak monte edildi. (B) Gövde bölgesi enfeksiyonu için zebra balığı embriyoları, cam alt kabın dibine yakın enjeksiyon bölgesi ile yanal olarak monte edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: M. marinum enfeksiyonunda tipik morfolojik değişiklikler makrofaj litik hücre ölümüne ve UV kaynaklı makrofaj apoptosise neden oldu. (A) Bir makrofaj (Mac) bir kez ağır M. marinumile tıkanmış bir litik hücre ölümü geçiren zaman atlamalı görüntüleme . 3 dpf Tg orta beyin (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) zebra balığı embriyomikroenjeksiyon yoluyla Cerulean-floresan M. marinum (~ 500 cfu) tarafından enfekte. Hem bindirme kanalı (üst panel) hem de DIC kanalı (alt panel) için görüntüler sağlanır. T 00:00 5 saat 20 dk sonrası enfeksiyondur. Beyaz kesik çizgiler = hücre zarının anahattı; siyah kesik çizgiler = şişme sitoplazma; siyah oklar = yırtılmış hücre zarı; kırmızı kesik çizgiler = hızla sitoplazmik içeriği kaybetti. (B) UV ışınlanmış makrofajın zaman atlamalı görüntülemesi. 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) orta beyin bölgesinde bir GFP + hücre UV tarafından ışınlanır ve zaman atlamalı görüntüleme takip. Beyaz kesik çizgiler = hücre zarının anahattı; siyah oklar = nükleer parçalanma ve kromatin yoğuşması. Ölçek çubuğu = 15 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Canlı görüntüleme için çevre odası kuruldu. (A) Sıcaklığı 28,5 °C'de tutacak dijital kumandayı ayarlayın. (B) Nem sağlamak ve yumurta suyunun buharlaşmasını önlemek için odanın içine ıslak mendiller ayarlayın. (C) Odanın kapağını kapatın ve canlı görüntülemeye başlamadan önce sıcaklık stabilizasyonu için en az 30 dakika bekleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Canlı görüntüleme için konfokal panel ayarı. (A) Satın alma paneli ayarının gösterimi. (B) Lazer gücü ve spektrum ayarlarının temsili. (C) Canlı veri modunda birden çok işin ve döngü ayarının gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Makrofajlar enfeksiyon asar ve nötrofiller M. marinum enfeksiyonu sonrası litik hücre ölümü ile geçerler. (A) Makrofaj 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) zebra balığı embriyosu Cerulean-floresan M. marinum (~ 100 cfu) tarafından enfekte gövdesinde M. marinum yayan. (B) Nötrofil (Neu) 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) zebrabalığı embriyosu cerulean-floresan M. marinum (~ 100 cfu) mikroenjeksiyon yoluyla enfekte gövde bölgesinde bariz M. marinum yüklü olmadan litik hücre ölümü geçiren. Yeşil renk LRLG atanır ve kırmızı renk litik hücre ölüm sürecinin daha iyi görselleştirilmesi için eGFP atanır. Siyan'daki oklar hedef hücreleri gösterir. Kırmızı daki oklar, bir sonraki karede sitoplazma içeriğini serbest bırakmak üzere olan hücreleri işaret eder. Yeşiloklar, sitoplazma içeriğini yeni kaybetmiş ölü hücreleri işaret ediyor. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: M. marinum ile ağır yüklü bir makrofaj Şekil 5Aile ilgili litik hücre ölümü uğrar. Hızlandırılmış görüntüleme (63x hedef) 9 dakika ve saniyede 3 kare (fps) bir 3 dpf Tg orta beyin bölgesi (fps) için 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) zebra balığı embriyoCerulean-floresan M. marinumile enfekte . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Video 2: Bir makrofaj, Şekil 5Bile ilgili UV ışınlama dan sonra apoptoz dan geçer. 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) zebra balığı embriyosu orta beyin bölgesinin 6 fps'sinde 74 dk'lık hızlandırılmış görüntüleme (63x hedefi). Embriyoların orta beyin bölgesinde bir GFP + hücre UV tarafından ışınlanır ve zaman atlamalı görüntüleme takip. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Video 3: Bir makrofaj M. marinumyayılır, Ek Şekil 3A ile ilgili. Hızlandırılmış görüntüleme (63x objektif) 2 dpf Tg gövde bölgesinin 3 fps de 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) zebra balığı embriyoCerulean-floresan M. marinumile enfekte . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Video 4: Bir nötrofil belirgin M. marinum engorgement olmadan litik hücre ölümü uğrar, Ek Şekil 3B ile ilgili. Hızlandırılmış görüntüleme (63x hedef) 7 dk 30 s gövde bölgesinin gövde bölgesinin 3 fps 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) zebra balığı embriyocerulean-floresan M. marinumile enfekte . Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.