Method Article

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenilasyon periferik membran bağlayıcı proteinler üzerinde önemli bir değişikliktir. Böcek hücreleri, protein-protein ve protein-lipid etkileşimlerinin biyofiziksel ölçümlerini sağlayan miktarlarda farnesile tedavüle ve karboksimetilatlanmış KRAS4b üretmek için manipüle edilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein prenilasyon hücre içi membranlara proteinleri hedeflemekten sorumlu önemli bir değişikliktir. İnsan kanserlerinin %22'sinde mutasyona uğrayan KRAS4b, C-terminusta 'CAAX' kutu motifinin varlığı nedeniyle farnesilasyon ve karboksimetilasyon ile işlenir. Böcek hücrelerinde farnesile ve karboksimetillenmiş KRAS4b'yi ifade etmek için tasarlanmış bir baculovirus sistemi kullanılmıştır ve daha önce tanımlanmıştır. Burada proteinin detaylı, pratik saflaştırma ve biyokimyasal karakterizasyonu anlatılır. Özellikle proteini homojenliğe çıkarmak için yakınlık ve iyon değişimi kromatografisi kullanılmıştır. KRAS4b'nin doğru modifikasyonunun doğrulanması ve nükleotit bağlanmasının doğrulanması için sağlam ve yerli kütle spektrometresi kullanılmıştır. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile farneslü ve karboksimetillenmiş KRAS4b'in membran ilişkisi ölçüldü.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Posttranslational değişiklikler proteinlerin fonksiyonel aktivitesinin tanımlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon ve glikozilasyon gibi modifikasyonlar iyi belirlenmiştir. Lipid modifikasyonları daha az iyi karakterize, ancak. Tüm hücresel proteinlerin %0.5'inin prenylatedolabileceğitahmin edilmektedir. Prenilasyon 15 karbonlu farnesil veya 20 karbonlu geranylgeranyl lipid zincirinin CAAXmotifi 2içeren bir kabul proteinine aktarılmasıdır. Prenylated proteinler erken yaşlanma da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarının ilerlemesi karıştığı olmuştur3, Alzheimer4, kardiyak disfonksiyon5, koreideremia6, ve kanser7. Küçük GTPases, HRAS, NRAS, ve KRAS1, nükleer lamininler, ve kinetochores CENP-E ve F bazal durum altında farneslü proteinlerdir. Diğer küçük GTPases, yani RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, ve RRAS geranylgeranylated8, RhoB farneslü veya geranylgeranylated olabilir ise9.

Küçük GTPase KRAS4b moleküler bir anahtar olarak işlev görür, aslında hücre içi sinyal iletim yolları sinyal yoluyla hücre içi sinyal iletim yolları, birden fazla protein-protein etkileşimleri yoluyla. KRAS4b biyokimyasının aktivitesi için gerekli olan iki temel yönü vardır. İlk olarak, protein aktif olmayan bir GSYİh ile aktif GTP bağlı durum arasında döngüler ve bu da aktif olarak efektörlerle etkileşime girer. İkinci olarak, Bir C-terminal poli-lizin bölgesi ve farnesile ve karboksimetilile sistein plazma membran protein doğrudan, işe alma ve downstream efektörleri aktivasyonu sağlayan. Mutant KRAS4b pankreas bir onkojenik sürücü, kolorektal, ve akciğer kanseri10, ve gibi, terapötik müdahale büyük bir klinik yararı olurdu. Farnesile ve karboksimetilated otantik modifiye rekombinant protein üretimi lipozomlar veya lipid nanodiskler 11 gibi membran suretleri ile birlikte KRAS4b kullanarak biyokimyasal tarama sağlayacak11,12.

Farnesyl transferaz (FNT), KRAS4b'deki CAAX motifinde farnesil pirofosfat ın C-terminal sisteinına eklenmesini katalizler. Prenilasyondan sonra protein endoplazmik retikuluma (ER) kaçırılır ve Ras dönüştürücü enzim (RCE1) üç C-terminal kalıntısını bırakır. İşleme de son adım ER membran proteini, isoprenylsistein karboksil metiltransferaz (ICMT) tarafından yeni C-terminal farnesylsistein kalıntısı metilasyon olduğunu. E. coli rekombinant KRAS4b ifadesi değiştirilmemiş bir protein üretimi ile sonuçlanır. İşlenmiş KRAS4b üretmek için önceki girişimleri yapısal veya ilaç tarama deneyleri için yetersiz verim nedeniyle sınırlı olmuştur ya da yerli tam uzunlukta olgun protein13,14recapitulate başarısız oldu. Burada sunulan protokol, hücre kültürünün 5 mg/L verimlerinde yüksek oranda saflaştırılmış, tam olarak işlenmiş KRAS4b üreten, tasarlanmış bakülovirüs tabanlı böcek hücresi ekspresyonu sistemi ve arınma yöntemini kullanmaktadır.

Yapısal biyoloji veya ilaç tarama çalışmalarına başlamadan önce rekombinant proteinlerin kalitesini doğrulamak için dikkatli protein karakterizasyonu gereklidir. Tam olarak işlenmiş KRAS4b'in iki temel parametresi doğru prenyl modifikasyonunun doğrulanması ve farnesile ve karboksimetilileli C terminusun (FMe) membran ikameleri veya lipidleri ile etkileşim için kullanılabilirliğidir. KraS4b-FMe elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) moleküler ağırlığı ölçmek ve farnesyl ve karboksimetil modifikasyonları varlığını doğrulamak için kullanılmıştır. Numunelerin nondenaturing çözücülerle püskürtüldüğü yerli kütle spektrometresi, KRAS4b-FMe'nin de GSYİh kofaktöre bağlı olduğunu göstermek için kullanıldı. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi immobilize lipozomlar ile KRAS4b-FMe doğrudan bağlanmasını ölçmek için kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protein arınması

  1. Tablo 1'degörüldüğü gibi Arabellekleri A-H'yi hazırlayın.
Arabellek çözümüArabelleğe alma aracısı (tüm 20 mM) pH NaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2 TCEP
AHEPES7.3300-51
BHEPES7.33003551
CHEPES7.330050051
DMes6.0200-51
EMes6.0--51
FMes6.0100-51
GMes6.01000-51
HHEPES7.3300-11
  1. Arıtma malzemeleri hazırlayın (Malzeme Tablosubakınız): EDTA veya diğer şelatörler olmadan proteaz inhibitör kokteyl; immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) sütun; katyon değişimi kromatografisi (CEX) sütunu; 0.45 μm şırınga filtresi; 2 M imidazol (pH = 7.5); ultracentrifuge 100.000 x gyeteneğine sahip ; 4.000 x gkapasiteli yüksek hızlı tezgah üstü santrifüj; santrifüj filtre üniteleri (10 KDa NMWL); 280 nm okuma yeteneğine sahip spektrofotometre; His6-tütün etch virüs (TEV) proteaz; ve iki arabellek çözümlerini karıştırma, sütunlara çözümler uygulayabilme, sütundan degrade elutions oluşturma ve sütunlardan kesirleri toplama yeteneğine sahip kromatografi enstrümantasyonu.
  2. Daha önce -80 °C'de depolanan böcek hücre kültürünün ~2 L'lik hücrelerini eritme veya taze hasat edilmiş hücreler kullanın. Tni.FNL böcek hücre hattı ve ifade protokolleri hakkında ayrıntılı bilgi için Gillette et 201915'e bakın. 200 mL'lik Tampon A ile hücreleri hava yıkmadan veya köpük oluşturmadan 1:200 v/v proteaz inhibitörü ile dikkatlice yeniden askıya alın.
    NOT: Adım 1.3 ve sonraki adımlar (belirtildiği gibi hariç) oda sıcaklığında (~22 °C) yapılmalıdır. Bir sonraki adımda tam bir lysis sağlamak için örnek homojen olması önemlidir.
  3. Lyse hücre peletbir mikroakışkan bir 7.000 psi iki geçiş için veya eşdeğer lizis sisteminde. Alternatif lisis metotları araştırılmadı.
  4. Böcek hücre lisatlarının netleştirilmesi, filtreleri tıkadığı bileşiklerin varlığı ndan dolayı sorunludur. Bu nedenle, ultrasantrifüj (4 °C'de 30 dk için 100.000 x g) çok önemlidir. Supernatant yüzeyinde beyaz lipid kalıntısı kaçınılmalıdır ve pamuklu bezler kullanılarak kaldırılabilir veya azaltılabilir. Decanted supernatant'ı 0,45 m PES filtreden filtreleyin. Açıklanan numuneyi hemen kullanın veya -80 °C'de saklayın.
    NOT: Kalıntı blokları hızlı bir şekilde filtreler ve birçok filtre gerekli olabilir. Bu malzemenin miktarının düşürülmemesi sonraki adımlarda yüksek kolon geri basıncına yol açacaktır.
  5. Açıklığa kavuşturulan lysate hacmini belirleyin ve 2 M imidazol stoğu ilave ederek numuneyi 35 mM imidazole ayarlayın. Numuneyi 3 mL/dk'daki 20 mL IMAC sütununa (HisPrep FF 16/10 sütun) üç sütun hacmi (CV) için Tampon B'de önceden dengelenmiş olarak yükleyin.
  6. Hedef protein genellikle sütuna kantitatif adsorbe olmasına rağmen, sonraki analiz için sütun akışını toplamak en iyisidir. Abs280, 20 mL (1 CV) için 3 mL/dk'da Tampon B ile sabit bir taban çizgisine (<100 miliabsorbance birimleri [mAU]) ulaşana kadar kolonu yıkayın, sonra yıkama adımının geri kalanı için ~3 CV için 4 mL/dk'da. Tipik olarak, 60-80 mL Tampon B temel absorbans elde etmek için gereklidir.
  7. 8 mL fraksiyonu toplarken Buffer B'den Tampon C'ye 400 mL (20 CV) degradeile proteini ete. Tipik olarak, degradenin ilk yarısında hedef protein eutes(Şekil 1A; tüm sonraki kesirler gösterilir).
  8. SDS-PAGE/Coomassie boyama kullanarak protein fraksiyonlarını analiz edin. Havuz tepe fraksiyonları ve 4 °C'de Tampon D 2 L karşı gecede havuz diyaliz.
    NOT: Düşük pH sonraki adımda protein bağlanmasını sağlamak için önemlidir. Ancak, bu diyaliz sırasında pH değişimi yavaş yavaş gerçekleşir, ve bu gece kuluçka için uygun bir adımdır. Alternatif tampon değişim stratejileri (örneğin, pH değişimini hızlandırmak için daha yüksek tampon konsantrasyonu) araştırılmamıştır. Protein yavaş yavaş düşük pH ve düşük tuz konsantrasyonlarında zaman içinde çökelmeye başlayacak ve yağış küçük bir miktar bu adım sırasında normaldir. Bu nedenle, diyaliz sırasında bir sonraki kolona bağlanmak için gerekli olan 100 mM NaCl tampon değişimi önlemek. Bunun yerine diyaliz için 200 mM NaCl konsantrasyonu kullanılır ve protein kolona uygulanmadan hemen önce 100 mM'ye seyreltilir .aşağıya bakınız. Bu yağışın KRAS4b'e özgü olup olmadığını araştırmadık, ancak çökelmeyen proteinIN KRAS4b-FMe olduğu doğrulandı. Bu nedenle, bağlayıcı tampondaki hedef proteinin stabilitesi belirlenene kadar diyaliz tamponundaki daha yüksek NaCl konsantrasyonunun herhangi bir protein için kullanılmasını öneririz.
  9. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dk için 4.000 x g diyaliz ve santrifüj gelen örnek çıkarın. Bu noktada son diyaliz, açıklık örnek hala genellikle puslu ama sonraki CEX sütun üzerine daha fazla işleme olmadan uygulanabilir.
  10. Tampon G'nin üç CV'si ile yıkayarak 20 mL katyon değişim sütunu (Bkz. Malzeme Tablosu)hazırlayın, ardından üç Adet Tampon F CV'si ile.
    NOT: Diğer reçineleri titizlikle değerlendirmemiş olsak da, birçok meslektaşımız SP Sepharose Yüksek Performanslı reçine dışındaki reçinelerle kötü çözünürlük buldu.
  11. 20 mL Tampon E ekleyerek diyaliz numunesinin 20 mL'sini 100 mM'lik son NaCl konsantrasyonuna seyreltin ve seyreltilmiş numuneyi katyon değişim sütununa uygulayın.
  12. Bir önceki seyreltme yükün sonuna yaklaşırken, yukarıda açıklandığı şekilde hazırlanan taze seyreltilmiş numuneleri yük tüpüne ekleyerek kolonu yüklemeye devam edin.
    NOT: Numunenin tamamının bir seferde 100 mM NaCl'ye seyreltilmesi yağış nedeniyle hedef proteinde önemli kayıplara yol açmıştır.
  13. Sütunu Tampon F ile abs280'e kadar yıkayın. Bu genellikle 3 CV gerektirir. Protein, Tampon F'den %65'e kadar 400 mL (20 CV) degrade sırasında sütundan eluted, 6 mL kesirlerde toplanır(Şekil 1B).
  14. Degrade tamamlandıktan sonra ek bir 1,5 CV (%65 Arabellek G) için sütunu yıkamaya devam edin. Hem SDS-PAGE/Coomassie mavi leke analizine hem de kromatogramın UV izinin incelenmesine dayalı pozitif fraksiyonları seçin.
    NOT: UV izi genellikle beş tepe içerir. Düşük tuz konsantrasyonlarından başlayarak, ilk tepe genellikle işlenmemiş ve /veya proteozize proteindir. İkinci ve üçüncü zirveler işlenmiş proteinin iki formunun bir karışımıdır: ikinci zirve öncelikle farnesile orta (FARN), üçüncüsü ise öncelikle tam işlenmiş fme proteinidir. Zirveler dört ve beş His6-MBP-KRAS4b füzyon proteinleri temsil (tüm protein bu noktada bu formatta, hiçbir TEV sindirim meydana gelmiştir gibi). Bunlar N-terminus'ta N-asetilize değildir ve C-terminus'ta farnesile (tepe dört) ve farnesile ve karboksimetilatlı (tepe beş) dir. En üst düzey iki ve en üst dört etiket çıkarıldıktan sonra aynı proteinleri üreteceği için (yani KRAS4b-FARN) istenirse bu aşamada biraraya gelebilirler. Benzer şekilde, tepe üç ve tepe beş KRAS4b-FMe tek bir sürü üretmek için kombine edilebilir (Şekil 1B, Şekil 2). Ancak, bu havuzlama sadece ayrı zirvelerde protein doğası teyit edildiğinde yapılması tavsiye edilir.
  15. His6-TEV proteaz (~ 200 μg proteaz/mL numune) ile adım 1.15'te birleştirilmiş proteini sindirin.
    NOT: Addgene(https://www.addgene.org/92414)tarafından sunulan plazmid ve protokolleri kullanarak His6-TEV proteease yapıyoruz. TEV sindirimi, oda sıcaklığında 2 saat ve gece boyunca 4 °C'de tampon A 'ya (numune başına en az 40 mL Tampon A mL ile 10 kDa MWCO diyaliz tüpü) karşı diyalize koyun.
  16. Sindirim ve diyalizden sonra proteini doğrudan 3 mL/dk'da Tampon A ile dengelenir 20 mL IMAC sütununa yükleyin.
    NOT: Hedef proteinin kolona olan yakınlığı düşük olduğundan ancak reçineye tamamen bağlı olmayabileceğinden, tüm bu kromatografi sırasında 7 mL fraksiyontoplayın. Sütunu 3 mL/dk'da Tampon A ile toplam 3 CV'ye veya temel absorbansa ulaşılına kadar yıkayın.
  17. Hedef protein% 0-10 arasında Tampon C 5 CV gradyan ile eluted, 7 mL fraksiyonları toplama. Önlem olarak, ek bağlı proteinler %100 Tampon C ile eluted olabilir. Pozitif fraksiyonları SDS-PAGE(Şekil 1C)tarafından analiz edildikten sonra tanımlanır. Tipik olarak, hedef protein düşük imidazol konsantrasyonunda (yani, %0-10 Tampon C gradyan) eutes ama bazen akış yoluyla veya sütun yıkama da eutes.
  18. Buffer H. 280 nm spektrofotometri ile protein konsantrasyonu belirlemek karşı son havuzu diyaliz.
    NOT: Bu hesaplamada kullanılacak yok olma katsayısını belirlerken nükleotitin varlığını hesaba kattığından emin olun.
  19. Protein , önemli protein kaybı olmaksızın santrifüj filtre ünitesi (10 K NMWL) kullanılarak ~2-5 mg/mL'ye konsantre edilebilir. 0,22 μM şırınga filtresi ile filtre uygulayın. Son protein konsantrasyonunu hesaplamak için çözelti emicisini A280'de ölçün(Şekil 1D). Sıvı nitrojende snap dondurma aliquots ve -80 °C dondurulmuş örnekleri saklayın.
    NOT: Saflaştırılan protein GSYİh'ya bağlıdır. KRAS4b-FMe daha önce yayınlanmış protokolleri16kullanılarak GppNHp değiştirilebilir.

2. Bozulmamış kütle analizi ve yerli kütle analizi için örnek hazırlama

  1. Bozulmamış kütle analizi için numune hazırlama
    1. Analizden önce buzüzerinde protein örneği eritin. Sağlam kütle analizi için, proteini 20 mM amonyum bikarbonatta 0.1 mg/mL'ye seyreltin (pH = ~8.4). Yerli kitle analizi için proteini 50 mM amonyum asetatta 0.1 mg/mL konsantrasyona seyreltin (pH = ~7.5). Girdap 5-10 s için her örnek, daha sonra 12.500 x g 1 dk çözeltiiçinde herhangi bir katı malzeme pelet için santrifüj. Her supernatant 10-20 μL çıkarın ve bir cam autosampler şişe aktarın. Kontaminasyon veya buharlaşmayı önlemek için her şişeyi sıkıca kaplayın.
      NOT: Bozulmamış kütle analizi veya yerli kütle analizi için, numune analizden önce 10 kDa MWCO selüloz membran filtresi kullanılarak son seyreltme tamponuna tampon değişimi için tuzdan arındırılabilir.
  2. Genişletilmiş kütle aralığının (EMR) kitle spektroskopisinin hazırlanması
    NOT: Kütle spektrometresi üzerinde herhangi bir analiz çalıştırmadan önce, yakın zamanda kalibre edildiğinden emin olun. Ayrıca, her zaman eldiven ve diğer kişisel koruyucu ekipman herhangi bir zararlı kimyasallar önlemek ve örnekleri ve çözücüler kirletici önlemek için gerekli giymek. Kalibrasyon, ticari olarak elde edilen bir kalibrasyon solüsyonu ve şirket içinde hazırlanan 2 mg/mL sezyum iyodür çözeltisi kullanılarak yapılır.
    1. Analiz yazılımını açın ve uygun enstrüman yöntemi dosyasını yükleyin. KRAS4b proteinlerinin sağlam kütle analizi için uygun başlangıç parametreleri şunlardır: pozitif algılama şekli; üç mikrosk, çözünürlük = 70.000; AGC hedefi = 3e6; maksimum entegrasyon süresi = 200 ms; ve bir tcan aralığı = 70-1.800 kütle-şarj oranı (m/z). KRAS4b proteinlerinin doğal kitle analizi için uygun başlangıç parametreleri şunlardır: pozitif algılama şekli; 10 mikroscans, çözünürlük = 17.500; kaynak içi çarpışmaya bağlı dissosiyasyon (CID) = 20 eV; AGC hedefi = 3e6; çarpışma enerjisi (CE) = 20; maksimum entegrasyon süresi = 200 ms; ve bir tbmm aralığı = 500-10.000 m/z.
  3. Kromatografik çözücülerin ve kolonun hazırlanması
    1. Sağlam kütle analizi için gerekli çözücüleri hazırlayın. Solvent A% 0.1 formik asit ile sudur. Solvent B suda %80 asetonitril ve %0.1 formik asittir.
    2. Yerel kütle analizi için gerekli çözücüleri hazırlayın. Solvent A suda 0,1 M amonyum asetat ve Solvent B sudur.
    3. Uygun çözücüler hazırlandıktan sonra, borunun uygun çözücülerle doldurulup tüm hava kabarcıklarının hatlardan silinip kaldırılması için sistemi temizle.
    4. Uygun sütunu (bozulmamış kütle analizi için bir ters faz sütunu ve yerel kütle analizi için boyut dışlama sütunu) yükleyin. Sağlam kütle analizi için akış hızı 0,5 mL/dk, kolon sıcaklığı (kolon ısıtıcısı kullanılarak) 50 °C'dir. Sütunu 15-20 dakika boyunca dengeleyin. Yerel kitle analizi için akış hızı 0,25 mL/dk'dır.
      NOT: Tıkanmış bir çizgiyi veya sütun matrisinin tehlikeye girebileceğini gösteren üst sınırın üzerine çıkmadığından emin olmak için her zaman sütun arka basıncını izleyin. Gerekirse sütunu değiştirin.
  4. Örnek analizi
    1. Hazırlanan protein numunesini cam otoörnekleyici şişeye, LC sistemlerinde uygun şişe rafına yerleştirin. İstenilen analiz için uygun enstrüman yöntemi ile yazılım programında bir örnek(ler) listesi oluşturun. Örnek liste tamamlandıktan sonra, analizi başlatmak için Oynat düğmesini tıklatın.
    2. Her numuneden önce ve sonra bir su boş, herhangi bir taşıma olmadığından emin olmak için analiz başına 1-2 μL numune enjekte edin.
      NOT: Bozulmamış kütle analizi yerli kütle analizinden çok farklıdır ve çok farklı enstrüman yöntemi ayarları gerektirir. Bozulmamış kitle analizi ile, protein organik bir çözücü varlığında "rahat" ve böylece daha fazla ücret kabul yeteneğine sahip olmasıdır. Şarj durumlarının izotopik dağılımını çözmek ve dekonvolute etmek daha kolaydır. Yerli kitle analizi protein iyonlarının dar bir yük dağılımı nı sağlar ve proteine dayalı olarak farklı voltaj ve çarpışma enerjisi ayarları gerektirir.
  5. Veri analizi ve protein dekonvoltution
    1. Numunenin spektrumu, proteinin bozulmamış kütlesini (veya yerli kütlesini) gösterecek kıvrımlı spektruma dönüştürülebileceği bir yazılıma aktarın. Sağlam kütle yüklü spektral zirvelerin yüksek bolluğu nedeniyle bir izotopik dağılıma sahip olacaktır. Yerli kütle genellikle yüklü spektral zirvelerin düşük bolluğu nedeniyle çok az tepeye sahip olacaktır(Şekil 3D).
    2. Ölçülen kütlenin öngörülen kütleyle tutarlı olduğunu doğrulamak için tepe d'nin kütle-yük oranını (m/z) genişletin. Bazen, proteine yüklerin eklenmesi nedeniyle, beklenen molekül ağırlığı (MW) ve gözlenen MW arasında hafif bir varyasyon olabilir. Ayrıca, birçok kütle spektrometresi analizinde olduğu gibi, sodyum gibi adducts dikkatle tuzsuz örnekleri bile, verilerde ek zirvelerin görünümünü katkıda bulunabilir. Beklenenden daha düşük bir m/z ile daha düşük bol zirveler bazen gözlenir. Bu büyük olasılıkla nötr bir kayıp nedeniyle, hangi iyonizasyon işlemi nedeniyle fonksiyonel bir grubun kaybıdır.
      NOT: Beklendiği gibi, bozulmamış kütle ile yerli kütle zirveleri arasında farklılıklar olacaktır. Bozulmamış kütle göstergesi proteinin beklenen MW'sini gösterir. Bu ekli nükleotit veya diğer değişiklikler ekstra MW olmayacaktır. Ancak, yerli kitle tepe herhangi bir ilave nükleotit ile protein gösterecektir.

3. Lipozomlara bağlanan KRAS4b-FMe'nin doğrulanması

  1. Membran lipozom hazırlama
    1. 20 mM HEPES (pH = 7.3), 150 mM NaCl ve 1 mM TCEP'ten oluşan bir tampon hazırlayın.
    2. Lipozom hazırlama malzemeleri 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC) ve 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) kloroform stokları içerir; bir tutucu ve ısıtma bloğu ile bir lipid ekstrüder seti; argon gazı ve sıvı nitrojen; ultrasonik banyo; PTFE köpük gömlekli cam vida iplik şişeleri; ve dinamik ışık saçılma algılama yeteneğine sahip bir plaka okuyucu.
    3. 30 dk. 1 mL 5 mM 70:30 POPC için oda sıcaklığında kloroformdaki lipid stoklarının çözülmesi: 25 mM POPC (stok) 106 μL ve 118 μL'lik 10 mM POPS (stok) ile cam bir şişeye 1mL'lik popozomlar hazırlayın.
      NOT: Kloroform bazı plastik uçları eritebilir, çünkü plastik bir ucu ile lipidler aliquot etmeyin.
    4. Sürekli argon gazı akışı altında kuru lipidler. Argon gazını uygularken cam şişeyi yavaşça döndürerek ince bir kuru film tabakası oluşturabilirsiniz.
    5. Fazla kloroform kaldırmak için bir gecede bir vakum lyophilizer altında örnekleri koyun.
    6. Kurutulmuş filme 1 mL tampon ekleyerek lipidleri yeniden oluşturun ve 5 dk. 25 °C'de 1 saat sallayarak lipid karışımlarını nemlendirin.
      NOT: Örnek lipidlerin kurutulmuş film tabakasına tampon eklenmesi üzerine çok bulanık olacaktır.
    7. Numune şişesini bir buz suyu (4 °C veya daha düşük) ve ılık su banyosu (25 °C veya daha yüksek) arasına yerleştirerek beş dondurma/çözülme döngüsü gerçekleştirin.
    8. Ultrasonik banyo içine örnek şişe yerleştirin ve yaklaşık 0,5 saat veya örnek yarı saydam hale gelene kadar örnek sonicate.
    9. Lipid ekstrüzyon setini kullanarak numuneleri dışarı çıkar. Ekstrüzyon kitini üreticinin talimatlarında gösterildiği gibi monte edin. Örnekleri 0,1 μm filtre kağıdı kullanarak ekstrüzyon. Örnekleri bir cam şırıngaya yükleyin ve ekstrüzyon aparatının bir ucuna takın. Ekstrüzyon aparatının diğer ucuna boş bir şırınga ekleyin. Numuneleriniz tamamen saydam hale gelene kadar 10-20 x ileri geri itin.
    10. Büyük agregaları çıkarmak için son numuneleri 20.000 x g'de 30 dk'ya döndürün.
    11. Lipozomların boyutunu ve homojenliğini belirlemek için dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanın (isteğe bağlı). Lipozomların 30 μL'sini 384 kuyu plakaokuyucuya yerleştirin. Plakayı 30 dk için 1.000 x g'da döndürün.
  2. Yüzey plazmon rezonans (SPR) ile lipozomlara KRAS4b-FMe bağlanmasını karakterize etme
    1. Gerekli malzemeleri bir araya getirin: bir SPR cihazı; sensör çipi L1; 7 x 14 mm şişe tüpleri; ve CHAPS.
    2. 20 mM HEPES (pH = 7.3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP içeren bir arabellek hazırlayın. Toplam 200 μL (toplam 10 titrasyon) hacminde 60 μM-0,06 μM'den 2:1 seyreltme KRAS4b-FMe serisi hazırlayın. Son seyreltilmiş numuneleri şişe tüplerine aktarın (Bkz. Malzemeler Tablosu),şişe tüplerini bir rafa yerleştirin ve örnekleri SPR aletine takın.
    3. L1 sensör çipini SPR cihazına takın. Arabelleği takın ve sistemi 7 dakika arabellekle asal.
    4. Aşağıdaki gibi otomatik bir yöntem ayarlayın:
      1. Cihaz sıcaklığını 25 °C'ye ayarlayın.
      2. Sensör çipi L1'i 30 μL/dk akış hızında suda çözünmüş 20 mM CHAPS'lik iki 1 dk enjeksiyonla durulayarak çalıştırın.
      3. Talaş yüzeyini nemlendirmek için on 1 dk çalışan tampon enjeksiyonlarının başlangıç döngülerini gerçekleştirin.
        1. Lipozomları, lipozomları 5 μL/dk'da 2 dk enjeksiyonla L1 yongasının akış hücresine (FC)-2' ye enjekte ederek sensör çipi L1'e yatırın.
          NOT: Uygun yakalama seviyesine gelene kadar enjeksiyon süresini artırın.
      4. 30 μL/dk'da 1 dk enjeksiyonla hem FC-1 hem de FC-2 üzerine üç kür tampon enjekte edin.
        1. Çeşitli KRAS4b-FMe titrasyonlarını en düşükten en yüksek konsantrasyon serisine enjekte edin. Proteinleri ilişki fazı için 1 dk enjeksiyon ve her iki IC'de de 30 μL/dk akış hızında ayrışma evresi için 2 dk enjeksiyon kullanarak enjekte edin.
        2. Sensör çipi L1'i 30 μL/dk'da 20 mM CHAPS'lik iki 1 dk enjeksiyonla durulayarak yeniler.
    5. Belirgin bağlayıcı yakınlıklar elde etmek için tek bir site bağlama modeli kullanarak SPR değerlendirme yazılımını kullanarak verileri sığdırın (veri uydurma açıklaması için Tartışma bölümüne bakın).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki en büyük değişkenlerden biri ifade edilen hedef protein miktarıdır (His6-MBP-tev-KRAS4b). Bu protokol bir Trichoplusia ni hücre hattı bir izole kullanılarak geliştirilmiştir, Tni-FNL17, süspansiyon büyüme için uyarlanmış ve serum dan kesilmiş. Baculovirus ekspresyon sistemi ile çeşitli böcek hücre hatları arasında bildirilen sonuçların geniş göz önüne alındığında, Tni-FNL, en azından başlangıçta, KRAS4b-FMe üretilen kullanılması tavsiye edilir.

~65...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temsilci Sonuçları bölümünde belirtildiği gibi, arınma sırasında ki en kritik adım, numunenin daha düşük tuzda olduğu süre boyunca işlenmesidir. Numunenin 200 mM'den daha az NaCl'ye maruz kalma süresini sınırlamak yağışı azaltmaya ve numune verimini artırmaya yardımcı olacaktır. Profil beklentilerle uyuşmuyorsa CEX sonuçlarının yorumlanması zor olabilir (bkz. Şekil 2). Protokol rutin hale gelene kadar, ileriye götürülmeyen CEX elüs fraksiyonlarının, uygun malzemenin ileriye götürülmesini sağ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Carissa Grose, Jen Melhalko ve Matt Drew Protein İfade Laboratuvarı, Frederick Ulusal Laboratuvarı Kanser Araştırma için klonlama ve ifade desteği kabul ediyoruz. Bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsanI Hizmetler Bakanlığı'nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek de ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL Güvenli Kilitli Tüpler, DoğalEppendorf22363204
11 mm Cl SS Kilitli Uçlu Otomatik Numune Alma CihazıŞişeleri Thermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC)AVANTI POPOLAR LİPİTİNLERkloroformda sıvı stoklar olarak satın alınır
1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfo-L-serin (POPS)AVANTI POLAR LİPİT'LERkloroformdasıvı stoklar olarak
840034 satın alınır 5427R SantrifüjEppendorf
Asetonitril, HPLC SınıfıFisher ChemicalA998-1 1L
Amonyum AsetatSigma-Aldrich09689-250g
Argon gazıAirgasARUP
Test Plakası 384CORNING3544
Biacore T200 EnstrümanGE Healthcare
Blue Snap-It Contalar, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Ultrasonik BanyoThermo Fisher15-336-1000
Katyon Değişim Kromatografisi (CEX) sütunuGE Healthcare Yaşam Bilimleri29018183HiPrep SP Sefaroz Yüksek Performanslı
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Plaka OkuyucuWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Kütle SpektrometresiThermo Scientific
Formik AsitSigma-AldrichF0507-500MlReaktif Sınıfı veya daha iyisi kullanın
Gilson şişeleri 7x14 mm TüplerGE HealthcareBR-1002-12
PTFE köpük astarlıcam vida dişli şişelerBilimsel UzmanlıklarB69302
Yüksek hızlı/tezgah üstü santrifüjThermo Fischer Scientific05-112-114D4.000 xg'ye kadar kapasiteli
His6-Tütün Aşındırma Virüsü (TEV) proteazıAddgene92414Raran-Kurussi ve ark. (2017) TEV Proteaz ile Afinite Etiketlerinin Çıkarılması. İçinde: Burgess-Brown N. (eds) E.coli'de Heterolog Gen Ekspresyonu. Moleküler Biyolojide Yöntemler, vol 1586. Humana Press, New York, NY
İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC) sütunuGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Kurum İçi Su Temini, Arium AdvanceSartorius Stedim18 M&Omega Rezistivitesi; Tutuculu 0 cm
Lipid ekstruder setiAVANTI POLAR LIPIDS
Sıvı nitrojenAirgasNI-DEWAR
M110-EH mikroakışkanlaştırıcıMikroakışkanlar
MabPac RP UHPLC Kolon, 4 um, 3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Kolon, 5 um, 300 > , 2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
MagTran yazılımıThermo Scientific
Metanol, HPLC SınıfıVWR KimyasallarıBDH20864.400
NGC Kromatografi SistemiBioRad78880002NGC QuestTM 100 Kromatografi sistemi
EDTA veya diğer şelatörler içermeyen Proteaz İnhibitörü KokteyliMillipore SigmaP8849
Kauçuk Kapaklar tip 3GE HealthcareBR-1005-02
Serisi S Sensör Çipi L1GE Healthcare29104993
SpektrofotometreThermo Fischer Scientific13-400-519280nm'de Emici
Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri, 10K NMWLMilipore SigmaUFC901008PES membran
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Santrifüj FiltreleriAmiconUFC501024
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima - 100.000xg
Vanquish UHPLC (Pompa, Kolon Kalbi ve LC Sistemi)L80K Thermo Scientific Vortex
Genie 2Fisher12-812
Su, HPLC SınıfıSigma-Aldrich270733-1LŞirket içi su kaynağını kullanabilir (aşağıya bakın)
Whatman GD / XP PES 0.45 mm şırınga filtreGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificproteomik yazılımı
850457 , , 610023 kapasiteli

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles