Method Article

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenilasyon periferik membran bağlayıcı proteinler üzerinde önemli bir değişikliktir. Böcek hücreleri, protein-protein ve protein-lipid etkileşimlerinin biyofiziksel ölçümlerini sağlayan miktarlarda farnesile tedavüle ve karboksimetilatlanmış KRAS4b üretmek için manipüle edilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein prenilasyon hücre içi membranlara proteinleri hedeflemekten sorumlu önemli bir değişikliktir. İnsan kanserlerinin %22'sinde mutasyona uğrayan KRAS4b, C-terminusta 'CAAX' kutu motifinin varlığı nedeniyle farnesilasyon ve karboksimetilasyon ile işlenir. Böcek hücrelerinde farnesile ve karboksimetillenmiş KRAS4b'yi ifade etmek için tasarlanmış bir baculovirus sistemi kullanılmıştır ve daha önce tanımlanmıştır. Burada proteinin detaylı, pratik saflaştırma ve biyokimyasal karakterizasyonu anlatılır. Özellikle proteini homojenliğe çıkarmak için yakınlık ve iyon değişimi kromatografisi kullanılmıştır. KRAS4b'nin doğru modifikasyonunun doğrulanması ve nükleotit bağlanmasının doğrulanması için sağlam ve yerli kütle spektrometresi kullanılmıştır. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile farneslü ve karboksimetillenmiş KRAS4b'in membran ilişkisi ölçüldü.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Posttranslational değişiklikler proteinlerin fonksiyonel aktivitesinin tanımlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon ve glikozilasyon gibi modifikasyonlar iyi belirlenmiştir. Lipid modifikasyonları daha az iyi karakterize, ancak. Tüm hücresel proteinlerin %0.5'inin prenylatedolabileceğitahmin edilmektedir. Prenilasyon 15 karbonlu farnesil veya 20 karbonlu geranylgeranyl lipid zincirinin CAAXmotifi 2içeren bir kabul proteinine aktarılmasıdır. Prenylated proteinler erken yaşlanma da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarının ilerlemesi karıştığı olmuştur3, Alzheimer

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protein arınması

  1. Tablo 1'degörüldüğü gibi Arabellekleri A-H'yi hazırlayın.
Arabellek çözümüArabelleğe alma aracısı (tüm 20 mM) pH NaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2 TCEP
AHEPES7.3300-51
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki en büyük değişkenlerden biri ifade edilen hedef protein miktarıdır (His6-MBP-tev-KRAS4b). Bu protokol bir Trichoplusia ni hücre hattı bir izole kullanılarak geliştirilmiştir, Tni-FNL17, süspansiyon büyüme için uyarlanmış ve serum dan kesilmiş. Baculovirus ekspresyon sistemi ile çeşitli böcek hücre hatları arasında bildirilen sonuçların geniş göz önüne alındığında, Tni-FNL, en azından başlangıçta, KRAS4b-FMe üretilen kullanılması tavsiye edilir.

~65.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temsilci Sonuçları bölümünde belirtildiği gibi, arınma sırasında ki en kritik adım, numunenin daha düşük tuzda olduğu süre boyunca işlenmesidir. Numunenin 200 mM'den daha az NaCl'ye maruz kalma süresini sınırlamak yağışı azaltmaya ve numune verimini artırmaya yardımcı olacaktır. Profil beklentilerle uyuşmuyorsa CEX sonuçlarının yorumlanması zor olabilir (bkz. Şekil 2). Protokol rutin hale gelene kadar, ileriye götürülmeyen CEX elüs fraksiyonlarının, uygun malzemenin ileriye götürülmesini sağ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Carissa Grose, Jen Melhalko ve Matt Drew Protein İfade Laboratuvarı, Frederick Ulusal Laboratuvarı Kanser Araştırma için klonlama ve ifade desteği kabul ediyoruz. Bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsanI Hizmetler Bakanlığı'nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek de ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL Güvenli Kilitli Tüpler, DoğalEppendorf22363204
11 mm Cl SS Kilitli Uçlu Otomatik Numune Alma CihazıŞişeleri Thermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC)AVANTI POPOLAR LİPİTİNLERkloroformda sıvı stoklar olarak satın alınır
1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfo-L-serin (POPS)AVANTI POLAR LİPİT'LERkloroformdasıvı stoklar olarak
840034 satın alınır 5427R SantrifüjEppendorf
Asetonitril, HPLC SınıfıFisher ChemicalA998-1 1L
Amonyum AsetatSigma-Aldrich09689-250g
Argon gazıAirgasARUP
Test Plakası 384CORNING3544
Biacore T200 EnstrümanGE Healthcare
Blue Snap-It Contalar, T/SThermo ScientificC4011-54B
Branson Ultrasonik BanyoThermo Fisher15-336-1000
Katyon Değişim Kromatografisi (CEX) sütunuGE Healthcare Yaşam Bilimleri29018183HiPrep SP Sefaroz Yüksek Performanslı
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Plaka OkuyucuWyatt Technologies
Exactive Plus EMR Kütle SpektrometresiThermo Scientific
Formik AsitSigma-AldrichF0507-500MlReaktif Sınıfı veya daha iyisi kullanın
Gilson şişeleri 7x14 mm TüplerGE HealthcareBR-1002-12
PTFE köpük astarlıcam vida dişli şişelerBilimsel UzmanlıklarB69302
Yüksek hızlı/tezgah üstü santrifüjThermo Fischer Scientific05-112-114D4.000 xg'ye kadar kapasiteli
His6-Tütün Aşındırma Virüsü (TEV) proteazıAddgene92414Raran-Kurussi ve ark. (2017) TEV Proteaz ile Afinite Etiketlerinin Çıkarılması. İçinde: Burgess-Brown N. (eds) E.coli'de Heterolog Gen Ekspresyonu. Moleküler Biyolojide Yöntemler, vol 1586. Humana Press, New York, NY
İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi (IMAC) sütunuGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Kurum İçi Su Temini, Arium AdvanceSartorius Stedim18 M&Omega Rezistivitesi; Tutuculu 0 cm
Lipid ekstruder setiAVANTI POLAR LIPIDS
Sıvı nitrojenAirgasNI-DEWAR
M110-EH mikroakışkanlaştırıcıMikroakışkanlar
MabPac RP UHPLC Kolon, 4 um, 3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
MabPac SEC-1 Kolon, 5 um, 300 > , 2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
MagTran yazılımıThermo Scientific
Metanol, HPLC SınıfıVWR KimyasallarıBDH20864.400
NGC Kromatografi SistemiBioRad78880002NGC QuestTM 100 Kromatografi sistemi
EDTA veya diğer şelatörler içermeyen Proteaz İnhibitörü KokteyliMillipore SigmaP8849
Kauçuk Kapaklar tip 3GE HealthcareBR-1005-02
Serisi S Sensör Çipi L1GE Healthcare29104993
SpektrofotometreThermo Fischer Scientific13-400-519280nm'de Emici
Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri, 10K NMWLMilipore SigmaUFC901008PES membran
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Santrifüj FiltreleriAmiconUFC501024
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima - 100.000xg
Vanquish UHPLC (Pompa, Kolon Kalbi ve LC Sistemi)L80K Thermo Scientific Vortex
Genie 2Fisher12-812
Su, HPLC SınıfıSigma-Aldrich270733-1LŞirket içi su kaynağını kullanabilir (aşağıya bakın)
Whatman GD / XP PES 0.45 mm şırınga filtreGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificproteomik yazılımı
850457 , , 610023 kapasiteli

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles