Method Article

Whitefly Dokularında Begomovirüslerin İmmünfloresan ve Kantitatif PCR ile Lokalizasyonu ve Nicel Olarak Ölçülmesi

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek dokularında begomovirüslerin lokalizasyonu ve nicelemesi için immünoresans ve nicel PCR yöntemini tanımladık. İmmünofloresan protokolü viral ve vektör proteinleri kolokalize etmek için kullanılabilir. Kantitatif PCR protokolü tüm whitefly organları ve virüs bulaşmış bitkilerde virüsleri ölçmek için uzatılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )kalıcı, dolaşımcı bir şekilde Bemisia tabaci kompleksinin whiteflies tarafından iletilir. Begomovirüslerin dünya çapında üretime verdiği büyük hasar göz önüne alındığında, begomovirüsler ve onların whitefly vektörü arasındaki etkileşimi anlamak zorunludur. Bunu yapmak için, vektör dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelleştirilmesi çok önemlidir. Burada, örnek olarak domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) kullanarak, biz whitefly midguts begomoviruses lokalize etmek için ayrıntılı bir protokol tarif, primer tükürük bezleri, ve immünororesans ile yumurtalıklar. Yöntem, bir virüs kat protein, boya etiketli ikincil antikorlar ve konfokal mikroskop karşı spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Protokol aynı zamanda begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca whitefly midguts, primer tükürük bezleri, hemolenf ve yumurtalıklarda tylcv sayısallaştırılması için bir protokol açıklar kantitatif PCR (qPCR). TYLCV için özel olarak tasarlanmış astarlar kullanılarak, nicelleştirme protokolleri, whitefly'ın farklı dokularında TYLCV miktarının karşılaştırılmasına olanak sağlar. Açıklanan protokol, bir beyaz sinek ve virüs bulaşmış bir bitkinin vücudundaki begomovirüslerin sayısallaştırılması için potansiyel olarak yararlıdır. Bu protokoller whitefly begomoviruses dolaşım yolunu analiz etmek için veya whitefly-begomovirus etkileşimleri çalışma için diğer yöntemlerin bir tamamlayıcısı olarak kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )birçok sebze üretimine ciddi zarar neden oldu, lif, ve süs bitkileri dünya çapında1. Begomoviruses whitefly Bemisia tabaci tarafından kalıcı bir şekilde iletilir (Hemiptera: Aleyrodidae), hangi üzerinde içeren karmaşık bir tür 35 şifreli türler2,3. Begomoviruses doğrudan veya dolaylı olarak whitefly fizyolojisi ve davranış etkileyebilir, fecundity4gibi , uzun ömür4, ve konaktercihi 5,6. Ayrıca, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Whitefly, Virüs, Bitkiler ve Virüs Edinimi

  1. Arka beyaz sinekler (MEAM1) pamuk(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) 14:10 ışık: karanlık döngüsü ve 60 ± % 10 bağıl nem ile 26 ± 1 °C bir serada böcek geçirmez kafeslerde.
  2. Whitefly popülasyonunun saflığını belirlemek için whitefly mitokondriyal sitokrom oksidaz I genine dayalı geleneksel PCR gerçekleştirin.
    1. 20 yetişkin beyaz sinek toplayın ve 30 μL lysis tampon (10 mM Tris, pH = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] Tween-20, 0.2% [wt/vol] jelatin, 0.45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinase K).
    2. Her PCR tüpüne 5-7 seramik boncuk (2 mm çapında) ekleyin ve doku lysis gerçekleş....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B. tabaci kompleksi ve TYLCV MEAM1 whiteflies burada prosedürleri tanımlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Bu el yazmasında açıklanan immünoresans ve viral nicelleştirme prosedürlerine genel bakış Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2, PSGs, midguts ve yumurtalıklarda TYLCV ve DAPI boyama immünofloresan tespiti temsili sonuçları gösterir, TYLCV PSGs ve midguts daha fazla birikmiş olduğunu gösteren, ve yumurtalıklarda daha az. Şe.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada immünororeskence ve qPCR ile whitefly vektördokularında bir begomovirüs lokalizasyonu ve nicelleştirme için bir protokol açıklar. Diseksiyon, whitefly dokularında virüsün lokalize ve ölçülmesiiçin ilk adımı temsil eder. Whitefly vücut dokuların son derece küçük olduğu anlamına gelir uzunluğu yaklaşık 1 mm, ve onları incelemek zordur. Ayrıca, dokular arasında güçlü bağlantılar vardır. Örneğin, yumurtalıklar sıkıca bakteriyofitler ile bağlı, onları izole etmek zor hale. Burada, farklı dokuların özellikleri ve konuml.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe numarası: 2017YFD0200600), Çin Tarım Araştırma Sistemi (hibe numarası: CARS-23-D07) ve Bill & Melinda Gates Vakfı (Yatırım Kimliği OPP1149777) için ayrılmış fon tarafından desteklenmiştir ). Prof. Jian-Xiang Wu'ya TYLCV CP antikorları sağladığı için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 4 ParaformaldehitMultiSciencesF0001
4 ', 6-diamidino-2-ph & eacute; naylindol (DAPI)Abcamab104139
Sığır Serumu Albümini (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-RAD185-5201
Konfokal mikroskopiZeissLSM800
Dylight 549 keçi anti-fareEarthoxE032310-02İkincil antikor
Monoklonal antikor (MAb 1C4)Birincil antikor
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Stereo mikroskopZeissStemi 2000-C
TB yeşil premiks Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR ana karışım
ThermocyclerThermofisherA41182
Doku ŞekillendiriciShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI yaşam bilimleri9002-93-1
Tween 20BBI yaşam bilimleri9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

Related Articles