Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Antimikrobiyal direnç (AMR) dünya çapında insan sağlığı için büyük bir tehdit oluşturan yükselen bir krizdir. Antibiyotiklerin çoğuna direnç bildirilmiştir ve klinik olarak mevcut tüm ilaçlara dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlar ortaya çıkmaktadır. AMR'nin yükselişiyle mücadele etmek için, bu çok yönlü fenomeni ve antibiyotikler ve bakteriler arasındaki temel mekanizmaları ve etkileşimleri anlamamızı artırmamız gerekir. Tarihsel olarak kötü anlaşılmış bir yönü bakteri içine antibiyotik geçirmasyon, birikimi ve efflux olayları ile birlikte. Bu bilgi, yeni ilaçların tasarlanmasında ve direnç mekanizmalarının anlaşılmasında çok önemlidir. Bu nedenle, bu AMR araştırmakritik bir rol oynar.

Antibiyotik konsantrasyonu ölçmek için alınabilecek iki ana yaklaşım vardır: doğrudan ilacın ölçülmesi veya sayısallaştırmayı kolaylaştırmak için tasarlanmış bir moiety ile etiketleme. Antibiyotik etiketleme algılama geliştirir rağmen, Bu ilacın biyolojik aktivitesi perturb olabilir, antimikrobiyal aktivite ve geçirgenlik gibi. Bu, etiketlenmemiş yöntemler için bir sorun değildir; ancak, algılama zor olabilir. Son birkaç yıl içinde, teknolojik gelişmeler doğrudan bakteri¹antibiyotik konsantrasyonu ölçmek için kütle spektrometresi (MS) kullanarak araştırma bir patlamayol açmıştır^{1 ,2,3,5,5,6,7}. Bu çalışmalar, gram-negatif bakterilerin en çok incelediği çeşitli bakterilerde hücre içi birikimiincelemenin mümkün olduğunu göstermiştir. Molekül geçirgenliğinin nicelemesi daha sonra aktiviteile bağlantılı olmuştur ve ilaç gelişimini bilgilendirmek için kullanılır^2,3,4, ancak doğrudan birikimi ve hedef aktivitesi 5 şişirme zaman dikkatli alınmalıdır . MS gelişiminden önce, konsantrasyonu doğrudan ölçülebilen tek antibiyotikler tetrasiksin ve kinolonlar 8,^9,10,11gibi içsel floresan sahip olanlardı. Kapsamı açıkça sınırlı olmasına rağmen, birikim ve efflux incelenmiş ve ölçülen, floresan tabanlı nicelik yararlılığını gösteren.

Tagged antibiyotikler radyoaktif ve floresan etiketleri yaygın olan, dağılımları, eylem modları ve direnç çalışma için uzun yıllar kullanılmıştır. Radyo etiketli problar ana bileşik le hemen hemen aynı olma avantajına sahiptir, bu nedenle biyolojik aktivitenin önemli ölçüde farklı olması olası değildir. 3 ^{H, 14}C ve ¹⁵N gibi izotoplar sık antibiyotiklerde bu elementlerin önemi nedeniyle kullanılmıştır, ve antibiyotik iskeleler çeşitli incelenmiştir 1^,10,12,13. Radyo-probların tespiti basit olmakla birlikte, bu yaklaşımın kullanımını sınırlandıran bir dizi lojistik kaygı (örneğin, güvenlik, izotop yarı ömrü) vardır. Başka bir strateji floresan etiketli antibiyotikler. Bu problar, MS'den daha basit bir teknoloji kullanarak ve^radyasyonunlojistik sorunları olmadan ana ilacın dağılımını ve eylem ve direncini incelemek için kullanılabilir 8 . Bu yaklaşımın ana dezavantajı antibiyotikler genellikle nispeten küçük moleküller olmasıdır, dolayısıyla bir floresan moiety giriş önemli bir kimyasal değişiklik teşkil eder. Bu değişiklik fizyokimyasal özellikleri ve antibakteriyel aktiviteyi etkileyebilir. Bu nedenle, ana antibiyotik temsilcisi sonuç üretmek için bu faktörleri değerlendirmek için dikkatli olunmalıdır.

Bu çalışmada, bir yöntem sentezlemek için tarif edilir, değerlendirmek, ve floresan antibiyotik kullanmak, Bizim önceki yayınlarda olduğu gibi^14,15,16. Önceki çalışmalar sayesinde, floresan antibiyotikler bir dizi hazırlanmış ve çeşitli amaçlar için kullanılmıştır (Stone ve ark.⁸bakınız). Bu çalışmada azotoksadiazol (NBD, yeşil) ve 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl (DMACA, mavi) gibi biyolojik aktiviteyi etkileme olasılığını en aza indirmek için çok küçük floropororlar kullanılmaktadır. Ayrıca, mikrobroth seyreltme minimum inhibisyon konsantrasyonu (MIC) tsay kullanarak antibakteriyel aktivitenin değerlendirilmesi açıklanmıştır, böylece aktivite üzerindeki değişikliklerin etkisi ölçülebilir. Bu floresan etiketli problar spektrofotometrik tahliller, akış sitometrisi ve mikroskopide kullanılabilir. Olası uygulamaların aralığı floresan antibiyotiklerin avantajı yatıyor. Hücresel birikim tek başına MS kullanılarak mümkün olmayan bir şey, ölçülebilir, kategorize ve görselleştirilmiş olabilir. Floresan antibiyotik kullanımı ile edinilen bilginin direnç anlayışımıza ve AMR ile mücadelemize yardımcı olacağı umulmaktadır.

1. Alkyne-floroforların sentezi

1. NBD-alkyne sentezi (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amin)
   1. Çözün 1,031 mg 4-kloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) 60 mL tetrahidrofuran (THF). CsCO 1.857 mg ekleyin₃ (5.696 mmol), sonra 0.39 mL propargillamin (6.1 mmol). Tepkimi 50 °C'ye, kahverengiden yeşile, ardından oda sıcaklığına (RT) soğutacak olan 2 saat boyunca ısıtın.
   2. Reaksiyonu bir filtreleme yardımı kullanarak filtreleyin (Bkz. Malzeme Tablosu),ve etil asetat (EA) ile yıkayın. Filtrasyonu azaltılmış basınç altında yoğunlaştırın, sonra kalıntıyı 150 mL EA'da çözün ve 500 mL'lik ayrıştırıcı bir huniye geçin.
   3. EA çözeltisini sırasıyla 100 mL su ve salamura ile yıkayın. Daha sonra sulu fazları birleştirin ve 100 mL EA ile 2x yıkayın.
   4. Kuru susuz magnezyum sülfat üzerinde kombine organik aşamaları, sonra filtre ve azaltılmış basınç altında konsantre.
   5. Ham ürünü silika jelüzerinde flaş kromatografisi ile arındırın (petrol eterinde %20-30 EA [PE]), sıvı kromatografi kütle spektrometresi (LCMS, [M+H]⁺ = 219.1) ve/veya nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, kimyasal değişimler aşağıdaki gibi kontrol edilmiştir:
      ^1.1.2 H NMR (CD₃OD, 600 MHz) δ 8.54 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.7 Hz, J = 2.5 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 2.5 Hz, 1H); ^13.000 C NMR (CD₃OD, 150 MHz) δ 144.3, 143.7, 142.2, 135.8, 125.7, 100.0, 76.5, 74.2, 33.4.
      NOT: Silika jel kromatografisi ile saflaştırma yaparken, listelenen çözücülerin daha az polar kullanarak kolon hazırlayın. Ham bileşik ya konsantre bir çözelti olarak yüklenebilir ya da çözünürlüğü izin vermezse silika üzerine adsorbe edilebilir. Bileşik silikanın üst kısmına eklendikten sonra, silika ıslatma için kullanılan aynı çözücünün 1-2 sütun hacmiboyunca çalıştırın. Daha sonra, her çözücünün en az 1 sütun hacminde çalışan ve solvent bileşiminde büyük sıçramalar yapmamayı başararak listelenen çözücü oranıyla başlayın. Kesirleri toplayın ve Saflığı/kimliği LCMS veya TLC (ince tabaka kromatografisi) ile kontrol edin. Saf fraksiyonları birleştirin ve döner buharlaşma ile azaltılmış basınç altında konsantre.
2. DMACA-alkyne sentezi (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-kromn-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)asetamid).
   1. 3-(dimethylamino)fenol (36,6 mmol) 30 mL etanol içinde 5.02 g çözün, sonra diethyl 1,3-asetondikarboksilat 6.7 mL ekleyin (36 mmol). ZnCl₂ (77,2 mmol) 10,5 g ekleyin, sonra reflü kırmızı çözelti için 42 h. Ek bir ekleyin 9.20 G ZnCl₂ (67.6 mmol), sonra reflü için 8 saat.
   2. Reaksiyonu soğutun ve azaltılmış basınç altında konsantre olun. Elde edilen kırmızı katıyı 200 mL EA'da dağıtın, filtreleyin ve 500 mL'lik bir ayırma hunisine aktarın.
   3. 200 mL su ve salamura her eA ile yıkayın, sonra susuz magnezyum sülfat üzerinde kuru. Kurutulmuş organik fazı filtreleyin ve azaltılmış basınç altında konsantre olun.
   4. Kırmızı katı (etil 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)asetat) silika jel üzerinde flaş kromatografisi (0-100% EA IN PE), LCMS ([M+H]⁺ = 275.1) ve/veya NMR ile saflığı kontrol ederek arındırın:
      ^1.1.2 H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.30 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J = 8,9 Hz, J = 2,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J = 1,2 Hz, 3H).
   5. 488 mg etil 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)asetat (1.18 mmol) THF'nin 10 mL'sinde çözün, sonra 157 mg LiOH· çözeltisi ekleyin. H₂O (3.74 mmol) 15 mL suda. RT'de reaksiyonu 3 saat karıştırın, ardından ayrıştırıcı bir huniye geçin ve 50 mL su ile seyreltin.
   6. Reaksiyon karışımını 50 mL dietil eter (Et₂O) ile yıkayın, ardından 25 mL su ile kombine organik faz 2x yıkayın. Organik tabaka ile herhangi bir sarı çökelti alın. Organik fazı, döner buharlaştırıcı kullanarak azaltılmış basınç altında yoğunlaştırın.
   7. Sulu fazı konsantre HCl ile pH = 2'ye asitve bir gecede 4 °C'ye kadar soğutun. Asitli sulu fazı filtreleyin ve sarı katıyı konsantre organik faza ekleyin.
      NOT: 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)asetik asit daha fazla saflaştırma olmadan kullanılabilir, ancak bu LCMS ([M+H]⁺ = 247.1) ve/veya NMR, kimyasal değişimler aşağıdaki gibi kontrol edilebilir:
      ^1.1.2 H NMR (CDCl₃, 600 MHz) δ 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 9.2 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.98 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H), 2.35 (d, J = 0.9 Hz, 2H); ^13.000 C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ 162.2, 155.7, 152.9, 152.8, 125.3, 109.7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
   8. Çözün 466 mg 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)asetik asit (1.89 mmol) kuru N7 mL içinde ,N-dimethylformamide (DMF) ve azot atmosferi altında yer.
   9. Azot altında kuru DMF 7 mL propargylamin (5,1 mmol) 0,33 mL çözünür. Boya çözeltisine 1.30 mL di-izopropiletil amin (DIPEA, 7.50 mmol) ekleyin, ardından 535 mg O-(1H-6-klorobenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametilüronyum hekzafloropfosfat (HCTU, 1.29 mmol). RT 15 dakika için aktif boya çözeltisi karıştırın, sonra amine çözeltisi damla ekinde ekleyin ve bir gecede karıştırmak için bırakın.
   10. Ertesi gün, 35 mL su ile reaksiyon seyreltmek sonra azaltılmış basınç altında konsantre.
   11. Elde edilen turuncu katıyı EA ve salamura (her biri 100 mL) arasında 250 mL'lik bir bölme bölme. Katmanları ayırın (iki katmanı farklı şişelere çalıştırın) ve sulu fazı 100 mL EA ile yıkayın.
   12. Azaltılmış basınç altında kombine organik aşamaları konsantre, sonra 1:1 asetonitril 3 mL turuncu katı yeniden eritin (ACN)/su (v /v). C18 kartuş kolonu (çözücü A: su, çözücü B: ACN) ile donatılmış ters fazlı orta basınçlı sıvı kromatografi (MPLC) sistemine enjekte ederek ham ürünü arındırın.
   13. LCMS ([M+H]⁺ = 284.1, NMR kimyasal vardiya aşağıda verilen saflık için kesirleri kontrol edin, sonra birleştirmek ve 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)asetamid, NMR kimyasal vardiya aşağıdaki gibi vermek için uygun kesirleri birleştirmek ve lyophilize:
       ^1.1.2 H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ 8.65 (t, J = 5.4Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.0Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 3.88-3.87 (m, 2H), 3.62 (s, 2H), 3.13 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 3.01 (s, 6H); ^13.000 C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 167.7, 160.7, 155.4, 152.9, 151.0, 126.0, 109.4, 109.1, 97.5, 80.9, 73.3, 39.7, 38.4, 28.2.

2. Floresan Antibiyotik Sentezi

1. Daha önce açıklandığı gibi bir antibiyotik bir azide türevi hazırlayın^14,15,16.
   NOT: İşlem her antibiyotiğe özgüdür ve fonksiyonel antibiyotikin ana molekülle karşılaştırılabilir aktiviteyi koruduğundan emin olmak için ana molekülün yapı aktivitesi ilişkisinin (SAR) dikkatli bir şekilde incelenmesini gerektirir. (örneğin, siprofloksasin¹⁶, linezolid¹⁴, ve trimetoprim¹⁵). Yayınlanan floresan antibiyotik örnekleri ve genel sentez şeması için Şekil 1'e bakınız.
2. Tıklama reaksiyon uyşu A
   NOT: Antibiyotiklerin çoğu için bakır katalize Huisgen [2+3] azide sikloaddition (adım 2.1) ve floresan alkine (adım 1'de hazırlanan) için burada ayrıntılı prosedürü uygulayın.
   1. Yuvarlak bir alt şişe azide-antibiyotik yerleştirin ve tertekleyin -butanol^(tBuOH) ve su (1:1 v/v, mmol azide başına 25 mL her).
   2. Adım 1.1 (3 eq.) hazırlanan florofor-alkyne ekleyin ve 50 °C'ye kadar reaksiyon ısıtın. Daha sonra reaksiyona bakır sülfat (suda 100 mM, 0.6 eq.) ekleyin ve ardından askorbik asit (suda 500 mM, 2.4 eq.).
   3. Reaksiyonu 50 °C'de 1 saat boyunca veya reaksiyonun tamamlanması (başlangıç azidinin tam tüketimi) göstergesi üzerine LCMS tarafından analiz edilene kadar karıştırın.
   4. Reaksiyonu soğutun ve antibiyotik iskelesine uygun şekilde arındırın ve 2.3 veya 2.4 adımla arınmaya devam edin.
      NOT: İskelenin polaritesine ve stabilitesine bağlı olarak birkaç farklı arıtma yöntemi mümkündür.
3. Tıklama reaksiyon prosedürü B
   NOT: Daha güçlü reaksiyon koşulları sağlamak için peptit bazlı antibiyotikler için bu prosedürü uygulayın (yayınlanmamış çalışma, Phetsang, 2019).
   1. Yuvarlak bir alt şişe peptid azit-antibiyotik yerleştirin ve erimeye yeterli DMF (750 mL/mmol azide) ekleyin.
   2. Adım 1 (5 eq.) hazırlanan florofor-alkyne ekleyin ve 1 saat için 50 °C reaksiyon ısı.
   3. Bakır (I) iyodür (20 eq.), sonra DIPEA (120 eq.), sonra asetik asit (240 eq.) ekleyin.
   4. Reaksiyonu 50 °C'de 1 saat boyunca veya LCMS tarafından yapılan analiz reaksiyonun tamamlaşTını gösterene kadar (yani, başlangıç azidinin tam tüketimi) karıştırın. Reaksiyonu soğutun ve 1.
4. Arıtma yöntemi 1 (siprofloksasin, trimetoprim ve linezolid için kullanılır)
   1. Soğutulmuş tıklama reaksiyonu'nu doğrudan Bir MPLC C18 kartuş sütununa enjekte edin.
   2. Koşunun başlangıcında uzun bir yıkama fazı (yaklaşık 10 dakika) (%100 çözücü A) dahil edin, ardından %100'e kadar çözücü B degradesi çalıştırın ve ardından Çözücü A'ya geri dönün.
      NOT: Çözücü A su, 0.05-0.1% formik asit (FA) suda, 0.05-0.1% trifloroasetik asit (TFA) suda, çözünürlük, stabilite ve zirvelerin en iyi çözünürlüğü bağlı olarak seçilebilir. Solvent B asetonitril (ACN), ACN'de %0.05-0.1 FA, ACN'de %0.05-0.1 TFA'dan seçilebilir. Elüsasyon zor çıkarsa, metanol ACN yerine kullanılabilir.
   3. LCMS ve renk (görülen doğru kütle, tekil tepe) tarafından belirtildiği gibi, uygun kesirleri toplamak ve birleştirmek, sonra (yarı) saf floresan antibiyotik vermek için lyophilize.
   4. Gerekirse ürünü daha da arındırın. Saflığı, iskeleye uygun bir kolon ve yöntem kullanarak NMR ve/veya LCMS ve yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile değerlendirin.
5. Arınma yöntemi 2
   NOT: Çözünürlük izin veriyorsa, ön arıtma sulu çalışma (makrolidler, yayınlanmamış çalışma, Taş 2019 için kullanılır) tarafından yapılabilir.
   1. Soğutulmuş tıklama reaksiyonu su ve Et₂O (1:1 v/v, ilk reaksiyon hacminden yaklaşık 10 kat seyreltme) ile seyreltin ve uygun büyüklükte bir ayırma huni aktarımı.
   2. Katmanları ayırın ve sulu fazı Et₂O ile iki kez yıkayın.
   3. Kombine organik fazları 2kat suyla yıkayın (organik fazla eşit hacimli), sonra Na₂SO₄üzerinde kurulayın.
   4. Kurutulmuş organik fazı filtreleyin ve azaltılmış basınç altında konsantre olun.
   5. Adım 2.4.4'te açıklandığı gibi ham ürünü MPLC ve/veya HPLC ile arındırın.
      NOT: Eksik, eksiksiz ve saflaştırılmış tıklama reaksiyonu LCMS izleme örnekleri için Şekil 2'ye bakın. Antibiyotik-florofor tıklama reaksiyonları için tipik saflaştırılmış verim %30-80 arasında değişmektedir.
      DİkKAT: Bu sentezlerde kullanılan kimyasalların çoğu belirli güvenlik tehlikelerine sahip. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı da dahil olmak üzere her zaman dikkatli olunmalıdır. Et₂O, ^tBuOH, FA, asetik asit, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamine ve HCTU yanıcı; ısı veya kıvılcım kaynakları ile temastan kaçının. THF, propargylamine, DIPEA, ^tBuOH, FA, DMF ve PE toksiktir; maruz kalmaktan kaçının. Propargylamin, CsCO_3,ZnCl_2,LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, asetik asit ve HCl tüm aşındırıcı; temastan kaçının ve yüzey temasından haberdar olun. ZnCl₂, CuSO₄, CuI, ve PE mevcut çevresel tehlikeler; bertaraf koşullarına dikkat edin. THF patlayıcı peroksitler oluşturabilir; depolama koşullarına dikkat edin. Organik azideler patlayıcıdır; özellikle büyük ölçekli üretim ile dikkat edin.

3. Antimikrobiyal Aktivitenin Değerlendirilmesi

NOT: Bakterileri içeren tüm çalışmalar, testin veya laboratuvarın kontaminasyonunu önlemek için steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm ortamlar kullanılmadan önce otomatik olarak otomatyapılmalı ve pipetler gibi plastik ve ekipmanlar steril tutulmalıdır. Çalışmaların bir biyo-çevreleme başlığında yapılması tavsiye edilir (tip 2).

1. Çizgili gliserol stokları bakteriyel suşları için uygun antibiyotik iskele üzerine lizoze et suyu agar (LB, üreticinin talimatları na göre hazırlanan), ve bir gecede büyümek 37 °C.
   NOT: Antibakteriyel aktiviteyi test etmek için bakteri seçimi kullanılan antibiyotik iskeleye göre yapılmalıdır. Laboratuvarın lojistik yetenekleri göz önünde bulundurularak, antibiyotiğe duyarlı olduğu bilinen türlerden 5-10 bakteriden oluşan temsili bir aralık seçilmelidir. Mümkünse dirençli bakteriler de test edilmelidir. Aşağıda verilen protokol çoğu bakteri üzerinde çalışacaktır, ancak özel koşulların gerekli olup olmadığını kontrol edin (örneğin, CO₂, özel ortam) ve gerektiğinde değişiklikler yapın. Bu koşullar kullanılarak başarılı bir şekilde kontrol edilen bakteriler arasında Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecium sayılabilir.
2. 37 °C'de 5 mL katyon ayarlı Mueller-Hinton Suyu 'nda (CAMHB, üreticinin talimatlarına göre hazırlanan CAMHB) tabaktan tek bir koloni seçin ve bir gecede kültür seçin.
3. CAMHB'de gecelik kültürleri ~40 kat seyreltin ve orta günlük fazına, optik yoğunluğu 600 nm (OD₆₀₀₎= 0,4-0,8, hacim 5 mL'ye kadar büyüyün.
4. Steril suda 1,28 mg/mL ve 96 kuyu plakasının ilk sütununa 10 μL antibiyotik içeren her floresan antibiyotik için stok çözeltileri hazırlayın.
5. İlk sütuna 90 μL, diğer tüm kuyulara 50 l EKLEYIN. Daha sonra, plaka boyunca seri 2 kat seyreltme gerçekleştirin.
6. Iyice karıştırın, sonra ~ 10⁶ koloni oluşturan birimleri (CFU)/mL orta günlük faz kültürleri seyreltmek ve tüm kuyulara 50 μL ekleyin, ~ 5 x 10⁵ CFU / mL son konsantrasyonsağlamak için.
   
   kültür hacmi (mL) = (mL ortam hacmi)/(OD₆₀₀ x 1.000)
   
   örneğin, 12 mL istenilen ortam hacminde bir OD₆₀₀ = 0,5 kültür için, (12/(0,5 x 1.000) = 0,024 mL kültür den 12 mL ortama
7. Plakaları kapaklarla kapatın ve 37 °C'de 18-24 saat boyunca sallamadan kuluçkaya yatın.
8. Mİk'in görünür büyüme olmadan en düşük konsantrasyon olduğu plakaları görsel olarak inceleyin.
   NOT: Aktif ve inaktif floresan antibiyotik örnekleri için Tablo 1'e bakınız.

4. Spektrofotometri ve Akış Sitometrisi ile Prob Birikiminin Analizi

NOT: Bu santrifüj süreleri E. coliiçin optimize edilmiştir, bu nedenle diğer türler için hafif değişiklikler gerekebilir. NBD etiketli siprofloksasin probu için prob birikimine ait temsili veriler raporedilir.

1. LB agar üzerine bakteriyel suşların Streak gliserol stokları ve 37 ° C gecede büyür.
2. 37 °C'de lb'de bir gecede plaka ve kültürden tek bir koloni seçin.
3. Gecede kültürleri medyada ~50 kat seyreltin ve orta günlük aşamasına kadar büyüyün (OD₆₀₀ = 0.4-0.8).
4. 25 dk için 1.470 x g kültürleri santrifüj ve medya decant.
5. 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile bakterileri yeniden askıya alın, sonra 15 dakika boyunca 1.470 x g'de santrifüj.
6. Ortamı decant ve PBS'deki yıkanmış peletleri son bir OD₆₀₀ = 2'ye geri alın.
7. İstenirse 10,1 μL karbonil siyanür 3-klorofenilhididon (CCCP, PBS 10 mM) ila 1 mL bakteri (son konsantrasyon 100 μM) ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   NOT: CCCP bir efflux pompa inhibitörüdür. CCCP eklenmesi efflux etkisinin incelenmesine olanak sağlayacaktır.
8. Kültürleri 18.000 x g'de 20 °C'de 4 dk'da santrifüj edin ve medyayı ayırın.
9. Pelete 1 mL floresan antibiyotik çözeltisi (PBS'de 10-100 μM) ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
10. 4 °C'de 7 dk için 18.000 x g'de kültürleri santrifüj edin ve ortamı dekant.
11. Bakterileri 1 mL soğuk PBS'de yeniden askıya alın ve 4.9 adımını tekrarlayın.
12. Adımı 4.10 toplam 4x tekrarlayın.
13. İstenirse 180 μL lysis tampon (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 2 mM sodyum EDTA) sonra 70 μL lysozyme (H₂O'nda 72 mg/mL) ekleyerek bakterileri lyse.
14. 37°C'de 30 dakika, daha sonra 30 dakika donma-çözülme (−78 °C 5 dk, sonra 34 °C 15 dakika boyunca).
15. Örnekleri 20 dk sonicate, sonra 30 dakika için 65 °C ısı.
16. Lysed numuneleri (18.000 x g, 8 dk) santrifüj edin, ardından 10 kDa filtre membranından süzün.
17. Filtreyi 4x 100 μL su ile yıkayın.
18. Lysate'yi düz alt siyah 96 kuyu plakasına aktarın ve florofora uygun uyarma ve emisyon dalga boyları ile bir plaka okuyucudaki floresan yoğunluğunu ölçün (yani, DMACA: λ_ex = 400 nm, λ_em = 490 nm; NBD: λ_ex = 475 nm, λ_em = 545 nm).
    NOT: Floresan NBD etiketli siprofloksasin antibiyotik kullanan bakterilerin spektrofotometrik analizörnekleri için Şekil 3'e bakınız.
19. Akış sitometrisi ile analiz için, aynı büyüme ve boyama koşulları (adım 4.1-4.17), değişiklikler sadece son hazırlık kullanılabilir.
    1. Toplam hacmi 1 mL PBS'ye getirin.
    2. Veri toplama için logaritmik amplifikasyon (F1 uyarma = 488 nm; emisyon = 525/20 nm) kullanarak, yaklaşık 60 μL/dk akış hızında bir akış sitometresi üzerindeki örnekleri okuyun.
    3. Toplam 10.000 olay kaydedin ve verileri uygun yazılımı kullanarak analiz edin.
    4. F1'in floresan yoğunluğunu olay sayısı sayısına göre çizin ve bakteri lekelendikten sonra histogram tepelerinden gelen ortanca floresan yoğunluğunu tahmin edin.
       NOT: NBD etiketli siprofloksasin antibiyotik kullanan bakterilerin akış sitometri analizleri örnekleri için Şekil 4'e bakınız.

5. Mikroskobik Analize Hazırlık

1. Mic değerlendirmesinde olduğu gibi alt kültürleri OD₆₀₀ = 0,4'e büyütün, sonra 1 mL aliquots'a bölün ve 3-5 dk için 18.000 x g'de santrifüj e bölün.
2. Ortamları çıkarın ve atın, ardından 500 μL HBSS'de bakteriyel peleti yeniden askıya alın.
3. 3 dk için 18.000 x g santrifüj, sonra decant ve medya atın.
4. HBSS'de 1-100 μM konsantrasyonlarda antibiyotik problarının çözümlerini hazırlayın.
5. Yıkanmış bakterileri prob çözeltisinin 500 μL'sinde yeniden askıya alın ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
6. Adımı 5.3'te tekrarlayın. Birden fazla etiketleme deneyi için, ortogonal renkli nükleik asit boyasının 500°L'sinde peleti yeniden askıya alın. Yeşil için Syto9 (HBSS'de 5 μM); mavi için Hoechst 33342 (HBSS'de 20 g/mL) kullanın. 15-30 dakika RT inkübate.
7. 5.3 adımını tekrarlayın, ardından 500 μL FM4-64FX (HBSS'de 5 μg/mL) ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
8. 5.3 adımını tekrarlayın, sonra HBSS'nin 500 μL'sinde tekrarlayın ve 5.3 adımını bir kez daha tekrarlayın.
9. 5.8 adımını tekrarlayın, ardından sonunda yıkanmış, boyanmış bakterileri 15 μL montaj ortamında askıya alın (Bkz. Malzeme Tablosu).
10. Pipet bir mikroskop slayt ve yüksek performanslı kapak kayma ile üst üzerine montaj orta, sonra net oje ile kenarları mühür.
    NOT: NBD etiketli siprofloksasin ve trimetoprim antibiyotiklerle alınan konfokal mikroskopi görüntüleri örnekleri için Şekil 5'e ve DMACA etiketli oksazolidinon (linezolid) antibiyotik için Şekil 6'ya bakınız.

Şekil 1 Floresan antibiyotiklerin hazırlanması için anahtar tıklama kimya reaksiyonu(A)gösterir, ve ile (B) siprofloksasin dayalı bizim yayınlanan floresan antibiyotik yapıları örnekleri (cipro), trimetoprim (TMP), ve linezolid. Bu probların hepsi bir azit ara yoluyla ilgili antibiyotikler sentezlendi. Daha sonra NBD ve DMACA floropores, her bir alkine ile fonksiyonel birleştiğinde.

Şekil 2 örnek LCMS izleri bir siprofloksasin-N3 ve NBD-alkyne tıklama reaksiyonu, nerede azide 3.2 dk ve ürün 3.8 dk. karşılaştırarak 1 ve 2 azide tepe (UV veya MS dedektörü) ortadan kaybolması takip olabilir gösterir. Spectra 3 arınmanın etkisini gösterir, hatalı zirveler MS ve UV izlerinden kaybolur. Hem saflık hem de reaksiyon ilerlemesi, ürün zirvesinin ve herhangi bir safsızlık zirvelerinin entegrasyonuyla ölçülebilir.

Şekil 3, hücre içi birikimin efflux varlığında ve yokluğunda floresan spektroskopi ile değerlendirilmesinden elde edilen tipik sonuçları göstermektedir. Bu deneyde, E. coli Proton güdü kuvvetini (PMF) çökerten CCCP ile veya eklemeden TMP-NBD ile tedavi edildi. Bakterilerin hücre içi floresansı CCCP ile önlanda tedavi edildiğinde önemli ölçüde daha yüksekti, bu da efflux'ün bu bakterilerdeki birikimi azalttığını gösteriyor. Bu deney tolcbakteri eksikliği kullanılarak tekrarlandı , bireysel efflux pompa bileşenlerinin etkisini incelemek için bu tetkik kapasitesini gösteren. Bu durumda, yabani tip bakterilere göre hücre içi floresansında artış olmasına rağmen, CCCP birikimi hala artmıştır. Bu bulgular tolC inTMP efflux yer alır ama dahil tek PMF sürücü pompa olmadığını göstermektedir.

Şekil 4, Şekil 2ile aynı deneyin sonucunu gösterir, ancak spektroskopi yerine akış sitometrisi ile ölçülen birikim ile. Aynı veri eğilimleri gözlendi ve her iki tekniğin de efflux aracılı hücre içi birikim olgusunun incelenmesinde kullanılabileceğini gösterdi.

Şekil 5,gram-pozitif(S. aureus)ve gram-negatif bakterilerin(E. coli)TMP-NBD (1) ve cipro-NBD (2 + 3) floresan problarla etiketlenmiş temsili konfokal mikroskopi görüntülerini göstermektedir. Her iki durumda da eş lokalizasyonu karşılaştırmak için kırmızı membran boyası FM4-64FX eklendi. TMP-NBD için mavi nükleik asit boyası Hoechst-33342 de kullanıldı. Bu görüntüler inşilerek, bakterilerdeki antibiyotiğin lokalizasyonu görselleştirildi. Paneller 2 ve 3 karşılaştırıldığında efflux etkisinin nasıl incelendiği gösterilmektedir, efflux inhibitörü CCCP ile kullanılan 2, hücre içi birikimi ile sonuçlanan. Panel 3'e,hiçbir CCCP eklenmedi. Bu nedenle efflux aktiftir ve sonda birikimi görülmedi.

Şekil 6, DMACA etiketli oksazolidinone probu Lz-NBD ile etiketlenmiş Gram-pozitif(S. aureus)bakterilerin intemsili konfokal mikroskopi görüntülerini göstermektedir. Co-lokalizasyonu karşılaştırmak için kırmızı membran boyası FM4-64FX eklendi ve yeşil nükleik asit boyası Hoechst-33342 de kullanıldı. Bu görüntüler inşilerek, bakterilerdeki antibiyotiğin lokalizasyonu görselleştirilerek membran ve nükleik asitten farklı iç lokalizasyon görüldü.

Tablo 1 floresan antibiyotik, siprofloksasin, trimetoprim (TMP) ve linezolid (Lz) üç dizi için MIC değerleri gösterir, her biri ebeveyn antibiyotik, NBD ve DMACA türevleri için sunulan veriler. Her bir antibiyotik için temsili türler seçildi, hem gram-pozitif hem de gram-negatif dahil. Siprofloksasin serisi için, her iki floresan problar ana ilaca göre antibiyotik aktivitesi kaybetti, ancak tüm türlere karşı bazı aktivite korudu. Benzer şekilde, linezolid problar bazı aktivite kaybetti, ancak zayıf antibiyotik orta kaldı. TMP probları yabani tip bakterilere karşı hemen hemen tüm aktivite kaybetti, ancak efflux eksikliği E. colikarşı aktif , antibakteriyel aktivite kaybı birikimi eksikliği nedeniyle olduğunu belirten.

Şekil 1: Antibiyotik kaynaklı probların sentezi ve yapıları. (A) Azide-antibiyotik ve alkine-floroporlardan floresan antibiyotik problarının sentezi için genel reaksiyon şeması. (B) Yayınlanan problarımızın yapıları siprofloksasin, trimetoprim ve linezolid dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Antibiyotik kaynaklı prob saflık larının LCMS ile ölçülmesi. Analitik LCMS izleri (1) eksik, (2) tam, ve (3) HPLC saflaştırılmış siprofloksasin-N3 + NBD-alkyne tıklama reaksiyonları reaksiyon tamamlandıktan sonra başlangıç materyalinin kaybolması gösteren, ve arıtma üzerinde çeşitli zirveler. A = UV-Vis izi (250 nm'de absorbe), B = MS izi (pozitif ve negatif mod). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Antibiyotik kaynaklı prob birikiminin plaka okuyucu ölçümü. TMP-NBD (50 μM) hücresel birikiminin vahşi tipte (1, ATCC 25922) ve ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli'nin (A)ile ve (B) CCCP (100 μM) eklenmeden inkübe edilmiş hücresel birikiminin floresan spektroskopik ölçümü. İstatistiksel anlamlılık (**p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001) CCCP'nin yokluğu veya varlığı ile yabani tip ile ΔtolCE. coliarasında gösterilir. Rapor edilen veriler üç deney için ortalama ± SD'dir. Bu rakam önceki yayınımız15'tenuyarlanmıştır ve hücre içi birikimde efflux'ün rolünü açıklamak için spektroskopi nin kullanımını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Antibiyotik kaynaklı prob birikiminin akış sitometri ölçümü. TMP-NBD kullanılarak vahşi tipte (1, ATCC 25922) ve ΔtolC (2, ATCC 25922) E. coli ile ve CCCP (100 μM) ilavesi olmadan hücre birikiminin akış sitometriölçümü. Ortanca floresan aktivitesi 10.000 bakteriyel olaydan, İstatistiksel anlamlılık (***, p ≤ 0.001; ****, p ≤ 0.0001) cccp'nin yokluğu ve varlığı ile yabani tip ile ΔtolCE. coliarasında gösterilir. Rapor edilen veriler üç deney için ortalama ± SD'dir. Bu rakam önceki yayınımız15'tenuyarlanmıştır ve hücre içi birikimde efflux'ün rolünü açıklamak için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: NBD-probu lokalizasyonunun konfokal mikroskopi görselizasyonu. Konfokal mikroskopi görüntüleri 1) canlı S. aureus Hoechst-33342 (mavi, nükleik asit), TMP-NBD (yeşil), FM4-64FX (kırmızı, membran) ve overlaid ile etiketlenmiş; 2) canlı E. coli CCCP ile tedavi (efflux inhibitörü) cipro-NBD (yeşil), FM4-64FX (kırmızı, membran) ile etiketlenmiş ve overlaid; 3) canlı E. coli cipro-NBD (yeşil), FM4-64FX (kırmızı, membran) ile etiketlenmiş ve overlaid. Bu rakam önceki yayınlarımızdan uyarlanmıştır15,16, ve efflux etkisi de dahil olmak üzere prob lokalizasyonu incelemek için mikroskopi kullanımını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: DMACA-probu lokalizasyonunun konfokal mikroskopi görselizasyonu. Oxazolidinone probu Lz-DMACA (mavi), Sytox green (yeşil, nükleik asit) ve FM4-64FX (kırmızı, membran) ile etiketlenmiş canlı S. aureus'un konfokal mikroskopi görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Siprofloksasin dayalı floresan antibiyotik probların antibiyotik faaliyetleri, trimetoprim, ve linezolid uygun klinik olarak ilgili bakteriyel suşları karşı, et suyu mikroseyreltme MIC tahlilleri ile ölçülen. Çoğu durumda, problar ana ilaca göre bazı aktivite kaybetti, ancak bazı ölçülebilir antibiyotik potens korudu (daha ileri çalışmalarda yararlı olmak için yeterli).

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.