Biyobelirteç Analizi için Klinik Çalışma Alanlarında Tek Bir Kan Çekiminden Periferik Kan Mononükleer Hücre Peletleri ve Plazma Hazırlanması

Özet

Bu protokol, çevirisel biyobelirteç analizi için kullanılabilecek klinik çalışma alanında yüksek kaliteli PBMC ve plazma biyosampllerinin klinik olarak uygulanabilir hazırlanmasını detaylandırır.

Özet

Periferik kandaki biyobelirteçlerin analizi, tedavinin etkilerini değerlendirmek için mekanizma kanıtı oluşturmak ve terapötiklerin doz ve program ayarını yönlendirmeye yardımcı olmak için klinik çalışmalarda giderek daha önemli hale gelmektedir. Tek bir kan çekiminden periferik kan mononükleer hücreleri izole edilebilir ve protein belirteçlerini analiz etmek ve ölçmek için işlenebilir ve dolaşımdaki tümör DNA'larının, sitokinlerin ve plazma metabolomiklerinin analizi için plazma örnekleri kullanılabilir. Bir tedaviden alınan uzunlamasına örnekler, belirli bir protein belirtecinin evrimi, mutasyon durumu ve hastanın immünolojik manzarası hakkında bilgi sağlar. Bu, ancak periferik kanın işlenmesi klinik bölgelerde etkili bir şekilde gerçekleştirilirse ve numuneler başucundan tezgaha uygun şekilde korunursa elde edilebilir. Burada, çok merkezli klinik çalışmalarda PBMC peletleri ve plazma örnekleri elde etmek için klinik sahalarda uygulanabilecek, hastane laboratuvarlarındaki klinik profesyonellerin teknik uzmanlık düzeylerine bakılmaksızın yüksek kaliteli örnekleri başarıyla sağlamalarını sağlayacak optimize edilmiş bir genel amaçlı protokol sunuyoruz. Daha spesifik aşağı akış analitik yöntemleri için optimize edilmiş alternatif protokol varyasyonları da sunulmaktadır. DDR ilaçlarının ve/veya radyoterapinin uygulandığı onkoloji ortamlarında ve mekanistik hipotez testinin gerekli olduğu preklinik aşamalarda yaklaşımın uygunluğunu göstermek için X-ışını ışınlanmış kandaki DNA hasar yanıtına (DDR) karşı protein biyobelirteçlerinin incelenmesi için bu protokolü uyguluyoruz.

Giriş

İlaç geliştirme, karşılanmamış tıbbi ihtiyaçları ve daha hedefli, kişiselleştirilmiş tıbbı ele alan yeni terapötikler sunmayı amaçlamaktadır. Kinaz¹, proteaz 2 veya poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörleri³, protein düşürücüler⁴, terapötik antikorlar⁵ve antikor konjuge ilaçlar (ADC'ler)⁶gibi enzymatic inhibisyon dahil olmak üzere birden fazla ilaç mekanizması aktif olarak araştırmaktadır. Onkolojide daha iyi tedaviler elde etme çabalarına bir örnek, kanserli hücrelerin çoğalmasını sağlayan sinyal basamaklarını durdurmak amacıyla kinaz inhibitörlerinin kullanılmasıdır^1,7. Bu kinazlara özgü substrat fosforilasyon seviyelerini ölçmek, bu inhibitörlerin etki mekanizmasını ölçmek için en iyi farmakodinamik biyobelirteçtir⁸. Diğer ilaçlar belirli bir proteinin ekspresyonunun modüle edilebilir ve bu durumda tedavi boyunca hedef proteinlerinin konsantrasyonundaki değişiklikleri uzunlamasına ölçebilmek çok önemlidir. Bu nedenle, bir ilacın veya patolojinin özelliklerinden bağımsız olarak, ilaç maruziyeti ve hedef modülasyon arasındaki farmakokinetik (PK)/ farmakodinamik (PD) ilişkisini kurmak için biyobelirteçlerin değerlendirilmesi erken klinik gelişimde en iyi uygulamadır ve güvenli ve tolere edilen farmakolojik olarak aktif bir doz / program belirlenmesini sağlar⁹.

Onkoloji klinik gelişiminde, biyopsilerde biyobelirteç analizi bir ilacın mekanizmasının kanıtını oluşturmak için en iyi ayar olabilir, bir denemede mevcut biyopsilerin sayısı genellikle oldukça sınırlıdır^10,11. Alternatif olarak, periferik kan örnekleri klinik çalışmalar için oldukça değerlidir, çünkü minimal invaziv bir prosedür içerirler, kolaylaşan boyuna analiz elde etmek hızlı ve kolaydır, biyopsilerden daha ucuzdur ve bir tedavinin sonucunun gerçek zamanlı izlenmesi için geniş bilgi sağlar. Periferik kandaki PD biyobelirteçlerini değerlendirmenin ek bir yararı, PK/ PD nicel ilişkilerinin belirlenmesinde kesinlik sağlayan PK'yı ve sonraki PK / PD modellemesini ölçmek için biyosample kullanma kapasitesidir^12,13. Tüm kandan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC' ler), ifade düzeylerinde veya çeviri sonrası modifikasyonlarında değişiklikler yaşayan protein belirteçlerini incelemek için izole edilebilir. Ek olarak, PBMC'ler immünofenotiping amacıyla kullanılabilir^14,15, antikora bağımlı hücresel sitotoksisiteyi (ADCC) değerlendirmek gibi immün işlevsellik tahlilleri (ADCC)¹⁶ ve RNA izolasyonu yoluyla epigenetik analiz. Aynı şekilde, tam kandan alınan plazma, bir hastanın immünolojik yanıtını karakterize etmek, metabolik çalışmalar yapmak ve ayrıca terapötik ajandan seçilen hastalığın klonal evrimini izlemek için dolaşımdaki tümör DNA'sını (ctDNA) izole etmek ve dizilemek için sitokinleri ölçmek için kullanılabilir, genellikle tedavi direnci için mekanistik bir temel sağlar^17,18,19 sonraki terapötik nesillerin gelişmesini sağlar²⁰. Son olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC' ler) periferik kandan izolasyonu, uzunlamasına numaralandırma, DNA/ RNA dizilimi ve protein-biyobelirteç analizi ile hastalığın ilerlemesinin değerlendirilmesini sağlar²¹. Bu izolasyon burada açıklanan protokol ile uyumlu olmasına rağmen²²Birçok kanser türünde ve hastalığın erken evrelerinde CTC'lerin düşük bolluğu, CTC bozulmasını en aza indirmek için özel tüplerin kullanımını daha uygun hale getirir²³.

Son yıllarda, sıvı biyopsilerinin kullanımı klinik çalışmalarda elde edilen bilgileri geliştirmiştir ve PBMC koleksiyonları, bazı hematolojik malignite türleri için doğrudan tümör hücrelerinde veya PBMC'lerin kendilerinde tümör hücrelerinin PD taşıyıcıları olarak hedef katılımını ve mekanizma kanıtını izlemek için birçok çalışmaya dahil edilmiştir^24,25,26. Yüksek kaliteli örneklerin hazırlanması, belirli bir patoloji için en güvenli ve en etkili tedaviyi belirlemeyi olumlu yönde etkiler, ancak deneyimlerimize göre, farklı klinik bölgelerden elde edilen PBMC preparatlarının kalitesi, aşağı akış analizi amacına uygun olmayan örneklerle sonuçlanan kalitede geniş değişkenliğe maruz kalmıştır. Bu, bu çalışmalardan toplanabilecek PD verilerinin miktarını etkilemıştır.

Burada, hem PBMC'lerin hem de plazma örneklerinin klinik bir ortamda tek bir kan çekiminden nasıl verimli bir şekilde izole edileceğini gösteren takip etmesi kolay bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Protokol, gerçek dünya deneyiminin klinik siteler tarafından bildirilen santrifüjleme sorunları, işlem gecikmeleri ve cryovials'a örnek aktarımı gibi protokol yürütmede zorlukları vurguladığı modifikasyonları içeren mononükleer hücre hazırlama tüplerinin üreticisi tarafından sağlanan talimatlara dayanmaktadır. Çözeltiyi kandan ayıran bir bariyerli veya bariyersiz polisakkarit çözeltileri kullanarak yoğunluk gradyan ayrımına dayanan mononükleer hücre hazırlama tüplerinin kullanımına alternatif ticari olarak mevcut yöntemler vardır²⁷. İlgili klinik site bu alternatif metodolojilerde zaten deneyimliyse, bu protokol kabul edilebilir bir şekilde bunlarla ikame edilebilir. Bu gibi durumlarda, iki faktör düşünülebilir: bazı alternatif yöntemler, bir toplama tüpünden, insan birincil biyolojik materyalinin ek bir transferinin biraz daha artan bir güvenlik riski sunabileceği ayrı bir hazırlık tüpüne tam kan transferini gerektirir ve kanı polisakkarit çözeltisinden ayıran bariyersiz yöntemlerin başarısı, kan örneğini her zaman bir hastane laboratuvar ortamında bulunmayan rafine bir teknik uzmanlık seviyesinin geliştirilmesini gerektiren yoğunluk gradyan ortamına katmanlamak gibi kritik adımlara dayanır. Yukarıdaki noktalara rağmen, genel canlılık ve hücre iyileşmesi bu teknikler arasında karşılaştırılabilir^15,28. Bu nedenle, metodolojinin seçimi, biraz önceki teknik deneyime bağlıdır, ancak elimizde, mononükleer hücre hazırlama tüpleri geniş bir klinik bağlamda başarıyla kullanılabilir ve aksi takdirde önerimizdir.

Bu protokolün bir uç noktası, lysates içine daha fazla işlem için PBMC peletleri üretmek olsa da, PBMC koleksiyonunun nükleik asitlerin izolasyonu veya immünofiztokimya (IHC) yöntemlerine uygun PBMC smearları veya PBMC blokları üretme gibi diğer son uygulamaları uygulanabilir. Daha da önemlisi, hastalardan alınan her biyosample en azından bir düzeyde invaziv bir prosedürü temsil ettiği için, bu protokol sitokin analizleri, metabolomik çalışmalar veya ctDNA dizilimi için kullanılabilecek plazmayı izole ederek her örnekten faydalı malzemeyi en üst düzeye çıkarır.

Onkoloji denemelerinde periferik biyobelirteçlerin analizi PBMC lysates'in birçok uygulamasından biridir. Bir örnek, kemoterapi, radyoterapi veya fosfatidiylinositol-3 kinaz ile ilişkili kinazlar (PIKKs)⁷ ve^PARP3^,13gibi DDR'de yer alan enzimlerin inhibitörlerinin kullanımı gibi tedavilerde DNA hasar yanıtının (DDR) değerlendirilmesidir. Bu tedavilerin amacı çoğalan hücrelerde DNA hasarını artırmaktır, bu da DDR mekanizmaları bozulmuş hücrelerde ve kanser hücreleri gibi hücre döngüsü kontrol noktalarında yüksek toksisite oluşturur. Burada, röntgen ışınlarına maruz kalan periferik kandaki DDR biyobelirteçlerinin bir çalışması ile bir örnek sunuyoruz.

Protokol

Bilgilendirilmiş hasta onayı ve her yargı alanındaki ilgili ulusal etik gerekliliklerine tam uyum, örneğin, İnsan Dokuları Yasası (HTA - Birleşik Krallık, 2004) ve Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Hesap Verebilirlik Yasası (HIPAA - Amerika Birleşik Devletleri, 1996) zorunludur. İnsan kaynaklı materyaller üzerinde herhangi bir çalışmaya başlamadan önce etik onayı tam olarak belgelemiş olduğundan emin olun. Bu protokolün optimizasyonunda kullanılan kan, Ulusal Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (NIHR) Cambridge Biyomedikal Araştırma Merkezi ile yapılan İnsan Biyolojik Örnekleri tedarik anlaşması kapsamında NIHR Cambridge Klinik Araştırma Tesisi, Cambridge, Birleşik Krallık tarafından yürütülen Gönüllüler İlerleyen Tıp Paneli'nden (VAMP) (etik referans 16/EE/0459, çalışma CRF494, alt çalışma 001) uygun onay ile sağlanmıştır. İngiltere'deki AstraZeneca Biyobankası, İnsan Doku Kurumu (Lisans No. 12109) tarafından lisanslanmıştır ve Araştırma Doku Bankası (RTB) (REC No 17/NW/0207) olarak Ulusal Araştırma Etiği Hizmet Komitesi (NREC) Onayına sahiptir.

1. Genel hazırlık rehberliği

NOT: Bu protokoldeki kan, plazma ve PBMC'ler gibi düzeltilmemiş insan materyali ile yapılan tüm çalışmalar, bu malzemelerin potansiyel olarak bulaşıcı ajanlar taşıyabileceği varsayımıyla çalışmalı ve bu nedenle uygun biyogüvenlik önlemleri altında yapılmalıdır. Bilinen patojenler için negatif olarak test edilmiş hastalar için, örneklerin bulaşıcı olmadığını varsaymayın ve bu nedenle uygun güvenlik önlemleri hala uygulanmalıdır. Bu malzemelerden üretilen atık ürünler de aynı biyogüvenlik önlemleri ile arıtılmalı ve yerel kurallara göre bertaraf edilmelidir.

1. Antikoagülan olarak sodyum sitrat veya sodyum heparin kullanan iki tür mononükleer hücre hazırlama tüpü arasında seçim yapın. Birçok aşağı akış uygulaması için bu iki antikoagülan birbirinin yerine kullanılabilir, ancak deneme için birini seçmeden önce her iki pıhtı önleyici test edilmelidir.
2. Hastanın kodlanmış kimliği ile kan toplanması için kullanılacak bir adet 8 mL mononükleer hücre hazırlama tüpünü etiketle.
3. 1x PBS'i oda sıcaklığında (18-25 °C) saklayın. Hazırlık başına 30 mL kullanın.
4. Ayrı plazma örnekleri için tüplerin ve PBMC örneğinin cryovial'ının laboratuvar kılavuzunun uygun bölümünde belirtildiği gibi benzersiz tanımlayıcılarla doğru bir şekilde etiketlendiğini unutmayın.
5. FOSFORİlLİ PROTEINLerİ İzlemeK için PBMC'ler kullanılacaksa, fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş PBS hazırlayın: 5 mL PBS'yi 50 μL fosfataz inhibitörü kokteyli 2 + 50 μL fosfataz inhibitörü kokteyli ile karıştırın 3. Taze hazırlayın ve kullanıma kadar buzda tutun.

1. 4. 
      

Sonuçlar

Klinik çalışmalarımızda PBMC preparatlarının kalitesini artırmak için, moleküler biyoloji geçmişinden ve laboratuvar becerilerinden bağımsız olarak hastane laboratuvar profesyonelleri tarafından takip edilebilecek özlü, net adımlarla bir protokol oluşturduk. Çeşitli çok merkezli klinik çalışmalarda yer alan klinik sitelerden yürütme sorunlarının tespit edildiği veya raporlandığı adımlarla ilgili değişiklikleri içeren üretici protokolünü uyarladık. Bununla birlikte, protokol klinik sitedeki zaman kısıtlamaları veya aşağı akış analizlerinin türü gibi belirli gereksinimleri karşılamak için daha da optimize edilebilir (bkz. DDR'nin PBMC'lerde radyasyonun neden olduğu DNA hasarı üzerine belirli biyobelirteçlere bakarak analiz edilebileceğini gösteriyoruz.

Klinik sitelerden aldığımız en yaygın sorgular, PBMC'leri başarıyla izole edebilmeyi ve son PBMC peletini elde edebilmeyi doğrudan etkileyen santrifüjleme adımlarıyla ilgilidir. Uygun tip baş rotor santrifüjü(Şekil 1B,C)kullanmak protokolün başarısının anahtarıdır. Bununla birlikte, klinik alanda sadece sabit açılı bir rotor santrifüj mevcut olduğunda, adım 2.4'ü bir baş rotorla aynı RCF'de sabit açılı bir rotorda, ancak sadece 10 dakika boyunca gerçekleştirmeyi öneririz. Bu, pbmc katmanının plazmadan ayrılmasını sağlar (bkz. Şekil 2B,C). Bir yoğunluk gradyan ayırma ortamında kanın tabakalanması frenleme santrifüjleme gerektirirken, mononükleer hücre hazırlama tüplerindeki kan, tüpte daha yoğun kan bileşenlerinden ayrılmış PBMC tabakasının korunmasını sağlayan bir jel bariyerinin varlığı nedeniyle frenlerle santrifüjlenebilir^27,28.

Kanın 8 mL tüp formatında santrifüjlenmesinden en az 4 mL yüksek kaliteli, seyreltilmemiş plazma elde edildi, bu da ctDNA dizileme veya metabolomik çalışmalar 29^,30 (isteğe bağlı adımlar 4.1.1-4.1.4) gibi özel analizlerde kullanımı için daha da netleştirilebilir. İzole PBMC'lerin miktarı, peletlerin büyüklüğü ve hemoliz veya kırmızı kan hücresi kontaminasyonu klinik bölgelerden gelen diğer endişeler ve örnekleri analiz etme deneyimi olmuştur. 8 mL kandan elde edilen hücre sayısı hasta ve hastalık ayarına bağlı olarak değişkendi, ancak genel olarak elde edilen pelet küçük boyutludur ve şeffaf / beyaz renklendirme (Şekil 3A,B). Bu özellikler nedeniyle, yıkama adımları sırasında (2.5 ve 3.3) yanlışlıkla aspirasyonunu önlemek için peletin karanlık bir arka plana karşı görselleştirilmesi önemlidir. Bazen peletler kırmızı kan hücresi kirlenmesi nedeniyle bir miktar kırmızı renklenme olabilir (Şekil 3C) ve bu preparatın kalitesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahiptir. Şekil 3'tegösterilenler gibi küçük peletlerin kaybedilmemesi için PBMC peletinin bir cryovial'a aktarılması, PBMC peletinin 50 μL PBS'de yeniden depolandığı 3.7.

Bu tüpleri ve sağlıklı bireylerden gelen kanı kullanırken tipik verim 8 mL için 7 ila 21 x 10⁶ hücre ve deneyimlerimiz olduğu için ve daha önce gösterildiği gibi% 70 ila 80 arasında bir hücre iyileşmesi arasında^{değişmektedir.} Bu hem bireysel hücre sayılarına hem de operatöre bağlıdır ve yoğunluk gradyanı (ayırma bariyerli tüpleri kullanan sistemler dahil) kullanılarak diğer yöntemlerle elde edilen hücre sayıları ve hücre kurtarma değerleri ile karşılaştırılabilir^15,27,28. Kronik lenfositik lösemi (KLL) hastalarında hastalık ayarına bağlı olarak bu yöntemle izole edilen PBMC sayısındaki varyasyonun açıklayıcı bir örneğidir. Bu protokol uygulanırken 8 mL mononükleer hücre hazırlama tüpünden kurtarılan hücre sayısı, NCT03328273³¹ (Tablo1) çalışmasında 7 hastadan elde edilen 45 örnekte 1,62 x 10 4 ila^{1,99 x 10 9} arasında değişmektedir. İlgili bir parametre, bu yöntemle elde edilen PBMC lysates'in protein konsantrasyonudur ve bu, izole edilen hücrelerin sayısına ve protein ekstraksiyonunun verimliliğine bağlıdır. Bölüm 6'da bulunan hücre peletleri RIPA tamponu ve sonication (adım 6.6) ile oluşturulmuştır. Hücre peletlerinin aynı lizis tampon hacminde resüspensiyonu genellikle 3 ila 10 mg/mL arasında bir konsantrasyon aralığına neden olur ve bu özel örnekte lizat konsantrasyonları sırasıyla 0, 0.2 ve 7 Gy için 6.8, 8.3 ve 8.6 mg/mL'dir. Bununla birlikte, bu, klinik bölgelerden en iyi şekilde hazırlanmamış örnekler alırken, hastanın hastalığı ve kırmızı kan hücresi kontaminasyonundan hemoglobin varlığı alındığında yüksek bir değişkenliğe maruz kalır. Örneğin, çok küçük peletlerin hem protein konsantrasyon ölçümüne hem de aşağı akış biyobelirteç analizine izin vermek için hücre pelet hacminden daha büyük bir lizis tampon hacminde yeniden nünmesi gerekir, bu da daha seyreltilmiş numunelerle sonuçlanır. Bu durumda, bir örnek konsantrasyonu 1 mg / mL'nin altındaysa, bu yüksek seyreltme faktörü nedeniyle batı lekesi gibi tahlilleri yapmak için bir zorluk oluşturabilir. Buna karşılık, daha önce bahsedilen CLL örneklerinde, hücre peletlerini yeniden harcamak için eklenen lizis tamponunun hacmi 50 ila 500 μL arasında değişmektedir ve protein konsantrasyonu 1,62 ila 19,77 mg/mL arasında değişmektedir (Tablo 1).

Örnekler kırmızı kan hücresi kontaminasyonu veya hemoliz (Şekil 3C) sunduğunda, PBMC lizatının protein konsantrasyonu eritrositlerden hemoglobin dahil edilmesi nedeniyle fazla tahmin edilir. Bu nedenle, protokolün 6.7. Aşırı yükleme numunesi, bir yükleme kontrolü teste dahil edildiğinde biyobelirteç analizi yaparken hemoglobin varlığını telafi edebilir. Hemolizi ölçmek için 414 nm^32'deabsorbansı ölçmek gibi diğer daha nicel yöntemler uygulanabilir.

DDR, bu klinik protokol sonrasında elde edilen PBMC'lerde analiz edildi. Radyoterapi veya kemoterapi gibi KLINIK TEDAVILERE ZARAR VEREN DNA'yı taklit eden bir durumu göstermek için, sağlıklı gönüllülerden gelen tüm kan X-ışını radyasyona maruz kalmıştır (Şekil 4A). X ışınları gibi iyonlaştırıcı radyasyon (IR), DNA çift iplik kopmaları (DSB'ler) dahil olmak üzere farklı DNA hasarına neden olur. Bu lezyonların DNA hasarı algılaması, homolog rekombinasyon (HR) veya homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) gibi DNA onarım mekanizmalarını devreye sokabilen ataksi-telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM), ATM ve Rad3 ile ilişkili (ATR) ve DNA'ya bağımlı protein kinaz (DNA-PK) gibi PIKK'ları aktive eder. ATM'nin DSB'lerin varlığıyla aktivasyonu, MRN (MRE11-RAD50-NBS1) kompleksinin hasar alanlarına işe alınmasıyla ortaya çıkar ve Ser1981 de dahil olmak üzere çeşitli kalıntılarda ATM otofosforilasyonuna neden olur. Buna karşılık, aktif ATM, MRN kompleksinin bileşenlerini ve Ser139'daki histone varyantı H2AX gibi diğer proteinleri (pSer139-H2AX'ın φH2AX olarak da bilinir) diğer DDR faktörlerinin işe alımını kolaylaştıran DSB'den yayılan kromatin yapısal bir değişikliği teşvik etmek için fosforilize eder³³. PBMC'ler düşük çoğalma hızlarına rağmen iyonlaştırıcı radyasyona duyarlıdır ve kütle spektrometresi yöntemleri, RAD50'deki fosforilasyonlu Ser635'in ATM tarafından yukarı doğrulanmasının ölçülmesine izin verdi. Bu fosforilasyon ATM inhibitörlerinin varlığında azalır ve RAD50 pS635, immünohistokimi⁸ile tümörlerde klinik ATM inhibitör tedavileri için farmakodinamik biyobelirteç olarak daha da doğrulanmıştır. PBMC'lerin radyasyona tepkisini değerlendirmek için, sağlıklı gönüllülerden gelen kan farklı IR dozlarına maruz kaldı ve 37 °C'de 1 saat inkübasyondan sonra örnekler toplandı (Şekil 4A). Bu amaçla, yüksek sıcaklık nedeniyle PBMC izolasyonunun verimini düşürmemek için plastik tüplere kan aktarıldı (adım 6.2). ATM'nin nasıl etkinleştirildiğini sadece daha önce bildirilen RAD50 pS635'e değil, aynı zamanda ATM pS1981 ve φH2AX'a da bakarak analiz ettik. İncelenen üç olguda bu çeviri sonrası modifikasyonlarda daha yüksek IR dozlarında artış gözlenmiştir(Şekil 4B). İlginçtir ki, ATM ve RAD50'nin fosforilasyonu 0.2 Gy'nin düşük dozunda önemliydi, bu da çeviri sonrası bu değişikliklerin sadece tümör örneklerinde değil, periferik kanda da iyi bir dinamik aralığa sahip DNA DSB'lerin üretilmesini içeren tedaviler için PD biyobelirteçleri olarak sorgulanabileceğini göstermektedir. Bu, tedavi yoluyla uzunlamasına örnekler alarak tedaviye PD yanıtının izlenmesini sağlar. Kan çekiminden numunelerin işlenmesine kadar olan zamanlama, bu sinyal basamaklarının hala aktif olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir, çünkü işlemdeki gecikmeler bu tür basamakların kinetiğini etkileyecektir ve fosfomeransör olarak kullanılan fosforilasyon olaylarını kaçırabilir.

Şekil 4: Mevcut klinik protokolden sonra ex vivo ışınlanmış kandan izole edilen PBMC'ler, tedavinin neden olduğu DNA hasarının boyutu hakkında bilgi vermek için biyobelirteçleri görüntüler. (A) PBMC'lerin hazırlanması ve DDR'nin tam kan ışınlanması üzerine analizi için protokole şematik genel bakış. *CtDNA analizi/metabolomik için 2 ekstra santrifüjleme adımı gereklidir. (B) PBMC'lerde DDR fosfo-biyobelirteçlerin doza bağlı olarak yukarılanmasını gösteren Batı blot. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek	PBMC sayısı / 8 mL kan	Ekli RIPA tampon hacmi (μL)	Son konsantrasyon (mg/mL)
A.1	39100000	70	12.16
A.2	97400000	100	4.54
A.3	233000000	150	7.63
A.4	316000000	150	16.87
A.5	387000000	150	12.60
A.6	459000000	150	12.71
A.7	414000000	200	15.67
A.8	253000000	150	14.56
A.9	509000000	300	10.67
B.1	15200000	70	2.96
B.2	10500000	50	4.59
B.3	13200000	50	3.99
B.4	34800000	100	10.41
B.5	1620000	70	7.11
B.6	70200000	100	9.26
B.7	65400000	100	12.10
B.8	91100000	150	11.82
C.1	6330000	70	4.04
C.2	4400000	150	19.77
C.3	68000000	100	8.96
C.4	35100000	50	9.30
C.5	35400000	70	10.55
C.6	99200000	100	16.19
D.1	402000000	70	7.23
D.2	826000000	300	16.95
D.3	1990000000	300	14.87
D.4	1000000000	300	18.34
D.5	1160000000	400	16.13
D.6	806000000	400	19.40
E.1	302000000	300	13.86
E.2	990000000	500	19.04
E.3	1200000000	400	17.13
F.1	4010000	50	1.62
F.2	5170000	50	2.84
F.3	2810000	50	3.69
F.4	3700000	75	3.62
F.5	3460000	70	4.03
F.6	7060000	50	3.32
G.1	60700000	70	6.57
G.2	82100000	150	7.78
G.3	30500000	70	8.28
G.4	134000000	100	15.14
G.5	91900000	100	8.61
G.6	372000000	150	15.88
G.7	574000000	200	15.01
7 hastaya karşılık gelen boyuna PBMC örnekleri

Tablo 1: Kronik lenfositik lösemi hastalarından (KLL) PBMC peletlerinin hücre sayısı ve protein konsantrasyonu. Bu tabloda sunulan veriler mononükleer hücre hazırlama tüplerinde toplanan NCT03328273 çalışmasına katılan 7 CLL hastasından alınan 45 PBMC örneğine karşılık gelmektedir. Bunlar, atıf yapılan çalışma^31'denörnekler kullanılarak oluşturulan orijinal verilerdir.

Tamamlayıcı Dosya: Alternatif protokol seçenekleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

PBMC'lerin ve plazmanın klinik çalışma alanlarında sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde hazırlanabilen yüksek kaliteli preparatları, klinik çalışma periferik tahmine dayalı ve farmakodinamik çevirisel biyobelirteç uç noktalarını bilgilendirmek için paha biçilemez. Burada, klinik bir çalışma ortamında yürütme hatalarına karşı savunmasız olan tipik sorunlu adımları ele alan kısa ve net bir protokol sağladık. Bununla birlikte, protokol klinik sahadaki zaman kısıtlamaları veya aşağı akış analizlerinin türü gibi belirli gereksinimleri karşılamak için daha da optimize edilebilir (bkz.

Bu amaçla, çeşitli aşağı akış analizleri için uygun dondurulmuş PBMC peletleri ve dondurulmuş plazma üretmek için mononükleer hücre hazırlama tüpleri kullanarak hem PBMC'lerin hem de plazmanın tam kandan nasıl izole edilmesi gerektiğini gösterdik. 2.5. adımda PBMC katmanının santrifüjlenmesi ve tanımlanmasını ve 3.3 ve 3.6 adımlarında PBMC peletlerini içeren özellikle kritik protokol adımlarına dikkat çektik. Tarihsel olarak, klinik sitelerin sıklıkla yanlış gittiği yer, santrifüjü doğru birimlere ayarlamaktır (bir RCF veya x g değerini RPM değeriyle karıştırmak), kan örneklerinin işlenmesini, sıcaklığı ve donmuş hücre peletinin üzerinde büyük hacimlerde PBS varlığını geciktirmektir. Çoğu santrifüj rotorunda yanlışlıkla RPM ayarı olarak x g değeri girilmesi, sonuçta kötü tanımlanmış veya eksik pbmc katmanı ile önemli ölçüde santrifüj altı santrifüjleme ve verimsiz hücre peletleme nedeniyle yıkama adımları sırasında potansiyel yanlışlıkla PBMC atılması ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, hasta lökopeni geliştirmişse, doğru santrifüj ayarlarını ve rotor adaptörunu kullanmasına rağmen pbmc tabakasının görünmeme olasılığı vardır. Bu durum kemoterapi veya radyasyon tedavisi nedeniyle onkoloji denemelerinde kayıtlı hastaları etkileyebilir ve düşünülmelidir. Protokolde açıkça ortaya konulmuş bir diğer kritik nokta ise hemolizin protokolü olumsuz etkileme olasılığını azaltmak için numunelerin kan çekiminden itibaren 1-2 saat içinde işlenmesi gerektiğidir. Ayrıca, kan çekiminin ilk saatinde örnekleri işlemeyi hedeflemek, farmakokinetik okumalarda ve Şekil 4'tegösterilen durum gibi kan koruma veya aktif sinyal yollarından etkilenen biyobelirteçlerde büyük bir etkiye sahip olabilecek ex vivo değişkenliğini azaltır. Numune işlemedeki gecikmeler, hücreler kriyoprezserved olacaksa hücre canlılığında zararlı bir etkiye de sahip olabilir³⁴. Hem verimi hem de kırmızı kan hücresi kirlenmesini etkileyebilecek bir diğer faktör, oda sıcaklığında (18-25 °C) tutulması gereken depolama ve santrifüj sıcaklığıdır. Daha düşük sıcaklıklar yoğunluk gradyan ortamının yoğunluğunu arttırır, bu da bu hücreler de bir araya toplanmadığı için daha yüksek derecede kırmızı kan hücresi ve granülosit kirlenmesine neden olur. Öte yandan, daha yüksek sıcaklıklar, agrega eritrositler arasında sıkışan PBMC'lere yol açar, böylece preparatın verimini azaltır^15,27,28. Ve son olarak, bu PBMC preparatlarının aşağı akış işlemesinde elde edilen protein lysates konsantrasyonunu olumsuz yönde etkilediğinden, cryovial hücre peletinde en fazla 50-100 μL sıvı bulunması çok önemlidir. Fazla miktarda sıvı, örnekleri aşırıya düşürerek biyobelirteç analizi için uygun olmayan çok düşük protein konsantrasyonuna sahip lisatlara yol açacaktır. Ek olarak, çeviri sonrası değişikliklerin korunması bozulacak ve lizizin verimliliği de büyük ölçüde azaltılacaktır.

Mononükleer hücre hazırlama tüpleri, deneyimlerimize göre mükemmel tekrarlanabilirlik ile klinik çalışmalar için hem PBMC'leri hem de plazmayı tek bir kan çekiminde izole etmenin en basit yolunu sundukları için seçildi. Kan işleme yüksek eğitimli operatörler gerektirmez ve tek bir tüpün kullanılması, kanın seyreltilmesi ve farklı bir tüpe aktarılması ihtiyacını ortadan kaldırarak tehlike riskini azaltır; frenler açıkken santrifüj adımlarını gerçekleştirmesi nedeniyle protokolü kısaltır; ve tüm reaktifler tüptedir, bu da değişkenliği azaltır. Deneyimlerimize göre, bu faydalar sadece yoğunluk gradyan ayırma ortamının kullanımını içeren diğer klasik yöntemlere kıyasla bu tüplerin daha yüksek maliyetinden daha ağır basmaktadır^27,28 (60 birim başına 410 £ iken 66 50 mL preparatlar için lenfoprep ortamı £ 215'tir). Her ikisi de izole PBMC^35'inişlevselliğini korumada karşılaştırılabilir olan heparin ve sitrat olmak üzere iki tür antikoagülanda mevcuttur, bu nedenle, bir antikoagülanın diğerine göre seçimi, aşağı akış biyobelirteç çalışmalarında heparin veya sitratın olası etkisine dayanacaktır. EDTA tüplerinin heparin veya sitrat¹³ile karşılaştırıldığında en yüksek PBMC izolasyon verimini sağladığı gösterilmiş olsa da, tek tüplü manipülasyonun kullanım kolaylığının yararı bu hususu dengeler. Sitokinler analiz edilecekse, pıhtı önleyiciler plazmada tespit edilen seviyelerin bir etkisine sahip olabilir, bu nedenle klinik çalışma için birini seçmeden önce her iki antikoagülan test edilmelidir³⁶. Plazma metabolomik çalışmalar için kullanılacaksa, antikoagülan olarak heparin kullanılması tercih edilecektir³⁷. Bu nedenle, son kullanıcıya veya klinik deney çeviri bilimcisine kalan tek nokta, maliyetler değerlendirildikten sonra sitrat veya heparinin amaçlarına daha uygun olup olmayacağıdır.

Hücre hazırlama tüplerini kullanmanın yararları, oluşturdukları sınırlamalara kıyasla çok sayıda olsa da (kısıtlı bir antikoagülan aralığının daha yüksek maliyeti ve kullanılabilirliği), klinik çalışmalarda, özellikle onkolojide PD biyobelirteçleri elde etmek için PBMC'lerin veya plazma kullanımının ana sınırlaması izolasyon yöntemiyle ilgisiz olabilir. Tümörün periferik kandan doğrudan örneklendiği hematolojik kanserler dışında, diğer kanser endikasyonları için plazma ve PBMC'ler primer tümörü taklit etmeyen taşıyıcı dokulardır. Periferik doku genom ve epigenomu primer tümörle paylaşamayabilir, bu nedenle belirli bir tümör mutasyonuna bağımlı biyobelirteçlerin periferik analizi esas olarak ctDNA analizi (plazmadan) veya CTC'lerle (PBMC tabakasının daha sonra sıralanmasıyla) sınırlıdır. Ek olarak, sinyal basamakları tümör çoğalmasına neden olur veya katkıda bulunmak periferik kanda aktif olmayabilir. Bu zorluk, alternatif biyobelirteçleri tanımlamak için kan^8'i hedefleyen biyobelirteç keşif yaklaşımları uygulanarak veya plazma³⁸ ve PBMC preparatlarının izolasyonu için ek vivo tedavileri kaplin²⁶ile aşılabilir.

Mevcut protokolde dondurulmuş PBMC peletleri, batı şişkinliği veya ELISA teknikleri ile değerlendirilebilen protein lysates vermek için klinik bölgeden kolayca işlenebilir. IHC yöntemlerini etkinleştirmek için PBMC'leri kullanmak için alternatif yöntemler de sunulmuştur (Tamamlayıcı Dosya). Buna ek olarak, bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri ve ADC'lerin klinik çalışmalarda giderek daha fazla test edildiği, onkolojide ilgili bir uygulama olan immün hücre izleme için PBPC'lerin kriyoprezervasyon olasılığını da ayrıntılı olarak açıkladık . ADCC¹⁶ ve immünofenotyping gibi bağışıklık fonksiyonlarının değerlendirilmesi, mononükleer hücre hazırlama tüplerinden izole edilmiş kriyoprezer korunmuş PBMC'lerle uyumlu uygulamalardır¹⁵. Kriyoprezervasyonla ilgili bir uyarı var. Belirli yüzey ve iç belirteçlerin aşağı regülasyonını teşvik edebileceğinden ve belirli hücre işlevlerini bozabileceğinden, PBMC kriyoprezervasyonu, birden fazla klinik siteden alınan örnekleri dış laboratuvarlarda işlemeye işlerken zaman kısıtlamaları nedeniyle bu tahlilleri gerçekleştirmenin tek yoludur^14,15ve bu zararlı etkiler iyi çözülme yöntemleri ve dinlenme süreleri³⁹ile büyük ölçüde aşılabilir.

Sonuç olarak, burada sağlanan protokol, herhangi bir klinik kurumdaki PBMC'lerin ve plazma örneklerinin ortak ekipman ve malzemelerle güvenilir bir şekilde hazırlanmasına izin verecektir, böylece periferik kandan çeviri uç noktaları küresel klinik çalışmalarda sağlam bir şekilde etkinleştirilebilir.

Son olarak, PBMC lysates analizinin, klinik gelişimi şekillendirmeye yardımcı olmak için kullanılabilecek anahtar DDR faktörlerinin doza bağımlı çeviri sonrası modifikasyonunu göstererek DNA'ya zarar veren ajanlara verilen yanıtı mekanistik olarak nasıl bilgilendirebileceğini gösteriyoruz. İleriye dönük, batı şişkinliğinden daha nicel olan yöntemlerin uygulanması (örneğin, kütle spektrometresi⁴⁰⁾ve daha az giriş malzemesi (kılcal batı şişkinliği ve ELISA gibi) gerektiren bu preklinik sonuçların PBMC hasta örneklerinin daha sağlam ve sistematik bir değerlendirmesine doğru taşınmasına yardımcı olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL kriyoviyal	Nalgene, ThermoFisher	5000-1020	PBMC peletlerini ve yeniden süspanse edilmiş PBMC'leri saklamak için
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri	VWR	525-0990	Bu bir örnektir, tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın
15 mL konik steril propilen santrifüj tüpü	Nunc, ThermoFisher	339651	Diğer markalar kullanılabilir
2 mL vidalı kapaklı tüp steril, ekli kapaklı	ThermoFisher	3463	Plazma alikotasyonu için
20X TBS Tampon	ThermoFisher Scientific	28358	Final, 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5'tir. Bu bir örnektir, kendi stoğunuzu hazırlayabilir veya farklı bir sağlayıcı kullanabilirsiniz
20X TBS Tween 20 Tampon	ThermoFisher Scientific	28360	Veya TBST tamponu hazırlamak için TBS'yi %0,05 ile takviye
Otomatik hücre sayacı veya hemositometre	ThermoScientific	AMQAX1000	Kontes cihazı ve slaytları kullanıyoruz ancak başka yöntemler de olabilir.
50 & mikro; L ölçümleri			Küçük hacimleri işlemek için (yani western blot, PBMC peletlerini 1,5 mL'lik tüplere aktarın)
BD Vacutainer CPT mononükleer hücre hazırlama tüpü (Na-sitrat veya Na-heparin) 8 mL	BD	362761, 362753	4 mL'lik tüpler vardır, ancak mümkünse tek bir kan alımından daha fazla PBMC elde etmek için 8 mL'lik tüpler önerilir
Hücre dondurma kutusu	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Bu bir örnektir, tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın.
Santrifüj ünitesi dönüştürücü	LabTools		http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/
DMSO	Sigma-Aldrich, MERK	D2438	Tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın. PBMC kriyoprezervasyon ECL
yaban turpu peroksidaz substratı	ThermoFisher	34075	Biyobelirteçinizi western blot ile tespit etmek için gereken hassasiyete göre tercih ettiğiniz reaktifi kullanın. Görüntüleme sistemleri ile IRDye sekonder antikorları gibi başka sistemler de kullanılabilir.
Faxitron MultiFocus X-ray kabini	Faxitron Bioptics		Kanı ışınlamak için. Diğer modeller/üreticiler mevcuttur
Fetal Sığır Serumu (FBS), ısıyla etkisiz hale getirilmiş	ThermoScientific	102706	Tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın. PBMC kriyoprezervasyon için Ued
İnce uçlu, steril 1,5 mL Pasteur pipetleri	VWR	414004-018	Opsiyonel
Sabit açılı rotor santrifüjü			ctDNA/metabolomik için plazma hazırlanması için isteğe bağlı
Jel doc görüntüleme sistemi	SYNGENE		HRP tarafından geliştirilen membranları görüntülemek için
Isı bloğu			Lizatları batı lekesinde çalıştırmadan önce denatüre etmek için, uygun tüp adaptörleri ile donatılmış herhangi bir üretici
Yatay rotor (açılır kafalı) santrifüj	Termobilimsel	Heraeus Megafuge 40R	Bu bir örnektir
Sıvı nitrojen/kuru buz			Numuneleri hızlı dondurmak için
Marvel kurutulmuş yağsız süt	Premier Foods		Bu bir örnektir, tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın
1-200 aralığı ve mikro için mikropipet uçları; L			Küçük hacimleri işlemek için (yani western blot, PBMC peletlerini 1,5 mL'lik tüplere aktarın)
NuPAGE %4-12 Bis-Tris protein jeli, 1 mm, 10 kuyu	ThermoFisher Scientific	NP0321BOX	Bu bir örnektir, kendinizinkini yayınlayın veya tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007	HRP tarafından geliştirilen membranları görüntülemek için
NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10X)	ThermoFisher Scientific	NP0009	Bu bir örnektir.
PBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco, ThermoFisher	14190-144	Bu genellikle klinik kitte sağlanır.
Fosfataz inhibitör kokteyli 2	Sigma-Aldrich, MERK	P5726-1ML	Adım 3.7 için isteğe bağlı
Fosfataz inhibitör kokteyli 3	Sigma-Aldrich, MERK	P0044-1ML	Adım 3.7 için isteğe bağlı
Tavşan anti GAPDH	Hücre Sinyal Teknolojisi	CST 2128	1:1000 %5 süt TBST
Tavşan anti ve gama içinde seyreltme; H2AX	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	CST 2577, lot 11	1:2000 %5 sütte seyreltme TBST
Tavşan anti pS1981 ATM	Abcam	ab81292	%5 sütte 1:2000 seyreltme TBST
Tavşan anti pS635 RAD50	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	CST 14223	%5 sütte 1:1000 seyreltme TBST
Tavşan anti toplam ATM	Abcam	ab32420	%5 sütte 1:1000 seyreltme TBST
Tavşan anti toplam RAD50	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	CST 3427, lot 2	1:1000 %5 sütte seyreltme TBST
RIPA tamponu	Sigma-Aldrich, MERK	R0278-50ML	Hücre lizisi için. Bu bir örnektir, tercih ettiğiniz sağlayıcı
Sonicator	Diagenode'u	B01060010	30 s açık / 30 s kapalı, 4 oC'de 3 döngü için kullanılır. Farklı bir cihaz kullanıyorsanız, sonikatörünüze göre döngü sayısını ve yoğunluğu ayarlayın.
Steril 1,7 mL Pasteur pipetleri	VWR	414004-030	Bu bir örnektir, tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın
Steril serolojik pipetler (5 ve 10 mL hacim)	Costar	4101, 4051	Bu bir örnektir, tercih ettiğiniz sağlayıcıyı kullanın
Tripan mavisi	ThermoScientific	T10282	Bu, yukarıda listelenen otomatik hücre sayacı içindir.
Islak buz			Plazma örneklerini ve lizatları soğuk tutmak için