LarvaSPA, Uzun Süreli Hızlandırılmış Görüntüleme için Drosophila Larva Montajı Için Bir Yöntem

Hızlandırılmış canlı görüntüleme dinamik hücresel süreçleri incelemek için güçlü bir yöntemdir. Zaman atlamalı filmlerin sağladığı mekansal ve zamansal bilgiler hücre biyolojisi sorularını yanıtlamak için önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Şeffaf vücut duvarı iç yapıların noninvaziv görüntüleme için izin verir çünkü Drosophila larva canlı görüntüleme kullanarak araştırmalar için popüler bir in vivo modeli olmuştur^1,2. Buna ek olarak, çok sayıda genetik araçlar Drosophila floresanca etiket anatomik yapılar ve makromoleküller^{mevcuttur 3}. Ancak, Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi zordur. Sabit erken embriyolar veya pupa aksine, Drosophila larvaları sürekli hareket, canlı görüntüleme için immobilizasyon gerektiren. Canlı Drosophila larvaları hareketsizleştirmenin etkili yolları arasında kloroform⁴ile halokarbon yağımontajı, izofluran veya Dichlorvos solüsyonu^{kullanılarak}anestezi 5 , ve kapak kaymave mikroskop slayt ı arasında sıkıştırma⁶. Bu yöntemlerden bazıları mikroskopi için kullanılmış olsa da, bunların hiçbiri uzun süreli canlı görüntüleme de etkili değildir. Konvansiyonel konfokal mikroskopi veya ışık sayfası mikroskobu^7,8,9kullanılarak tarama larvalarında vücut duvarı nöronlarının görüntülenmesi için başka yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, bu yöntemler larvaların hareketi nedeniyle hücresel dinamikleri izlemek için ideal değildir.

Drosophila larvalarının uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesini sağlamak için yeni yöntemler geliştirilmiştir. Bir polidimethylsiloxane kullanarak (PDMS) "larva çipi", Drosophila larva etkili anestezi olmadan özel bir mikrohazret vakum üretilen emme yoluyla immobilize edilebilir. Ancak, bu yöntem hücre biyolojisi çalışmaları için yüksek zamansal çözünürlük sunmuyor ve hayvan boyutu üzerinde sıkı sınırlamalar vardır¹⁰. Bir anestezi cihazı kullanarak başka bir yöntem birden fazla zaman noktalarında Drosophila larvacanlı görüntüleme elde ve nöromüsküler kavşaklar 11 çalışma için uygulanmıştır^{11,12,13,14,15,16}. Ancak, bu yöntem aynı zamanda 30 dakikadan daha uzun süre sürekli görüntüleme için izin vermez ve tekrar tekrar desfluran kullanarak gerektirir, hangi nöral aktiviteyi inhibe edebilir ve biyolojik süreci etkileyebilir^17,18. Son zamanlarda, mikroakışkan cihaz ve kriyoanestezi birleştiren yeni bir yöntem kısa süreler için çeşitli boyutlarda larvaları hareketsiz leştirmek için kullanılmıştır (dakika)¹⁹. Ancak, bu yöntem bir soğutma sistemi ve immobilizasyon uzun süre lervalar tekrarlanan soğutma gerektirir gibi özel cihazlar gerektirir.

Burada 10 saatten daha uzun süre kesintisiz zaman atlamalı görüntüleme ile uyumlu Drosophila larvaları hareketsiz hale getirmenin çok yönlü bir yöntemini salıyoruz. "Kısmi Bağlanmaya Göre Larva Stabilizasyonu" (LarvaSPA) dediğimiz bu yöntem, larva miğanınözel olarak yapılmış bir görüntüleme odasında görüntüleme için bir kapak kaymasına yapıştırılmasını içerir. Bu protokol, görüntüleme odasının nasıl yapılacağını ve larvaların çeşitli gelişim evrelerinde nasıl monte edilebildiğini açıklar. LarvaSPA yönteminde, istenilen gövde segmentleri UV-reaktif tutkal kullanılarak kapak kaymasına yapıştırılır. Bir PDMS kübik ayrıca larvalara basınç uygulayarak kaçışı önler. Görüntüleme odasındaki hava ve nem, görüntüleme sırasında kısmen hareketsiz olan larvaların hayatta kalmasını sağlar. LarvaSPA'nın diğer tekniklere göre avantajları şunlardır: (1) Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip, bozulmamış Drosophila larvalarının saatlerce sürekli canlı görüntülenmesine olanak sağlayan ilk yöntemdir; (2) Yöntemin larva boyutu üzerinde daha az sınırlaması vardır; (3) Görüntüleme odası ve PDMS kübikler en az maliyetle imal edilebilir ve yeniden kullanılabilir.

Larva montaj yöntemini tanımlamanın yanı sıra, Drosophila dendritik arborization (da) nöronlarının dendritgelişimi ve dendriter dejenerasyonu için uygulamanın birkaç örneğini savuruyoruz.

1. Görüntüleme odasının yapılması

1. Metal çerçeve tipik bir makine mağazasında bir alüminyum blok inşa edilebilir. Çerçevenin özellikleri Şekil 1A'dagösterilmiştir.
2. Görüntüleme odasını oluşturmak için metal çerçevenin altını uzun bir kapak kayması (22 mm x 50 mm) ve UV tutkal(Şekil 1A)kullanarak kapatın. Uv tutkalını el yapımı uv lambası kullanarak tedavi edin.

2. PDMS kübik yapma

1. PDMS kübikler için kalıp hazırlayın.
   1. Ambalaj bandı katmanlarını dikdörtgen (80 mm x 55 mm) Petri kabının veya yuvarlak hücre kültür plakasının iç yüzeyine takın. İkinci instar larvaları için bir tabaka (0,063 mm kalınlığında), erken üçüncü yıldız larvaları için 2 kat (0,126 mm kalınlığında) veya geç üçüncü yıldız larvaları için üç kat (0,189 mm kalınlığında) kullanın (Şekil 1B).
   2. Bandı jiletle belirli genişlikte şeritler halinde kesin: 1 katmanlı bant için 1,5 mm ve 2 katmanlı veya 3 katmanlı bant için 2 mm. Şeridin genişliği ve kalınlığı, son PDMS kübikinin tutabileceği larvaların boyutunu belirler. İki şerit arasında en az 5 mm boşluk bırakın. Alanı kaplayan bant katmanlarını çıkarın (Şekil 1B).
   3. Yapışkan bant kullanarak plakanın iç yüzeyindeki tozu çıkarın. Kalıp kullanıma hazırdır.
2. PDMS karışımını hazırlayın.
   1. Küçük bir kapta 7 g PDMS tabanını ve 0,7 g kür leme maddesini (10:1 oranı) iyice karıştırın.
   2. Karışımdan havayı çıkarmak için kabı en az 15 dakika vakum lu bir kurutucuya yerleştirin.
   3. Yavaş yavaş 1-2 mm kalınlığı(Şekil 1B)ulaşmak için kalıp üzerine PDMS karışımı yaklaşık 5,5 g dökün.
   4. PdMS karışımını, karışımdan kalan hava kabarcıklarını temizlemek için en az 15 dakika boyunca tekrar vakum kurutucuya yerleştirin. Bir pipet ucu ile son birkaç kabarcıklar break.
   5. PDMS'yi 65 °C'de bir ısı kuluçka makinesinde düz bir yüzeyde 2 saat boyunca tedavi edin.
   6. Küfün kenarı boyunca kürlenmiş PDMS gevşetmek ve kalıptan ayırmak için bir jilet kullanın. PDMS'yi oda sıcaklığında iki parça büyük yapışkan bant arasında saklayın.
   7. Erken ve geç üçüncü instar larvaları için PDMS'yi küboidin uzun tarafının ortasına bant şeridi (adım 2.1.2) tarafından oluşturulan oluk konumlandırarak 8 mm x 2 mmx 1 mm kübik küboidler (Şekil 1B'dekinoktalı çizgiler boyunca) kesin. İkinci yıldız larvaları için küboidi 8 mm x 1 mm x 1 mm'ye kesin.

3. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için larva montajı

1. Montaj için üst kapak kaymasını hazırlayın.
   1. Larvaların boyutlarına uyan oluklara sahip altı PDMS kübik seçin. 2.1.1, 2.1.2 ve 2.2.7 adımlarını temel alan önerilen PDMS ritmini ve boyutunu izleyin.
   2. PDMS'nin yüzeyindeki tozu yapışkan bantla çıkarın.
   3. Daha sonra PDMS kübiklerini sabitlemek için uzun bir kapak kaymasına (22 mm x 50 mm) dört adet çift taraflı bant (12 mm x 5 mm) takın. Çift taraflı teyp iki adet arasındaki boşluklar PDMS oluk genişliği ile aynı olmalıdır.
   4. Her PDMS cuboid oluk içine UV tutkal küçük bir damla (~ 1.2 μL) uygulayın ve coverslip üzerinde çift taraflı bant arasındaki boşluğa UV tutkal altı küçük damla ekleyin.
2. Larvaları montaja hazırlayın.
   1. Bir çift forceps kullanarak, vücut yüzeyinden gıda kaldırmak için su daki larvaları temizleyin.
   2. Bir kapak olmadan küçük bir (35 mm) Petri çanak nemlendirilmiş kağıt küçük bir parça üzerinde temiz larvayerleştirin. Küçük Petri kabını kuru mendil kağıdı içeren büyük (60 mm) petri kabına yerleştirin. Kimyasal bir başlıkta, plastik transfer pipet kullanarak kuru mendil kağıdına 8-12 damla (160-240 μL) uygulayın ve büyük Petri kabının kapağını kapatın.
   3. Larvaları izlerken 2-3 dk bekleyin. Ağız kancaları hareket etmeyi bıraktıktan sonra büyük Petri kabından larvaları çıkar.
3. Hayvanları dağın.
   1. Hayvanın sırt tarafındaki yapıları görüntülemek için, hareketsiz edilmiş larvaları kapak kaymasına bakan dorsal mite ile kapak taki çift taraflı bant arasındaki UV tutkalının üzerine yerleştirin.
   2. Her larvayı bir PDMS bloğuyla kapatın ve larvanın gövdesini PDMS'nin oluğuna sığdırın. Larvanın başını ve kuyruğunu PDMS oluğunun dışında bırakın. Larvanın spiracles'ini tutkalla engellemekten kaçının.
   3. PDMS bloğunun uçlarına, oluk üzerinde kuvvet uygulamadan çift taraflı banda bastırın. PDMS altında miğde düzleştirmek için larva kuyruğunu yavaşça çekin.
   4. Yüksek ayarda (yaklaşık 0,07 mW/mm²⁾bir el UV lambası kullanarak 4 dakika boyunca UV tutkal Cure.
      DİkKAT: UV lambasını kullanırken gözleri güvenlik gözlükleri ile koruyun.
   5. Kapağı ters çevirin ve 3.3.4 adımını tekrarlayın.
   6. 20 μL-30 μL su ile küçük bir mercek kağıdını (15 mm x 30 mm) nemlendirin. Nemlendirilmiş mercek kağıdını görüntüleme odasının altına yerleştirin(Şekil 1A,D).
   7. Larvalar odanın içine bakacak şekilde kapak fişini odaya yerleştirin. Kapağın her iki ucunu da UV tutkal kullanarak metal yüzeye yapıştırın(Şekil 1A,D). Larvaların dorsal tarafı konfokal mikroskop altında görüntülemeye hazırdır (Şekil 1E).

4. Görüntüleme

1. Uygun bir mikroskop ile görüntü larvaları. Bu protokolde gösterilen tüm sonuçlar(Şekil 2, Şekil 3, Video S2, Video S3, ve Video S4) 40x (1.30 NA) yağ hedefine sahip bir konfokal sistem kullanılarak elde edildi.

5. Görüntüleme odası ve PDMS kübiklerinin iyileşmesi

1. Görüntülemeden sonra, bir lens kağıdı kullanarak üst kapak üzerinde yağ çıkarın. Üst kapağı metal çerçeveden ayırarak kapak ve metal çerçeve arasındaki boşluğu bir jiletle ayırın. Görüntüleme odası yeniden kullanıma hazır.
2. PDMS kübiklerini üst kapaktan forceps ile ayırın. Tutkal kalıntısı ve toz kaldırmak için yapışkan bant üzerinde PDMS cuboids rulo. PDMS kübikleri yeniden kullanıma hazır.

Larva görüntüleme odası, özel yapım metal çerçeve ve iki kapak birbirine yapıştırılarak oluşturulur. Metal çerçevenin tasarımı Şekil 1A'dabelirtilmiştir. Oda içinde Drosophila larvaları UV tutkal ve PDMS kübikler yardımı ile üst coverslip yapıştırılır. PDMS kübik üzerindeki oluk ve kübik bant, larvaları tutmak için boşluk oluşturmak için bağlanır (Şekil 1B,C). PDMS ayrıca larva gövde duvarını düzleştirmek ve larva hareketini fiziksel olarak kısıtlamak için hafif basınç uygular. Son olarak, ıslak lens kağıt küçük bir parça nem sağlamak için odanın altına yerleştirilir. Bu kurulum drosophila larvaları sürekli görüntüleme için 10 saatten daha uzun süre hareketsiz hale getirebilir. Hayvanların çoğu 10 saat sonra canlı ve pupal aşamasına büyümek için kurtarılabilir. Görüntüleme odası aynı anda dokuz larvayı barındırabilir. Şekil 1D, odaya monte edilmiş altı geç üçüncü yıldız larvası gösteriyor. Larvaların gövdeleri, başları ve kuyrukları hareket etmek için serbestken sabitlenir (Şekil 1E ve Video S1). Bu yöntem, 15 saate kadar sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile üçüncü instar larvaları gezinmek için ikinci instar görüntü başarıyla kullanılmıştır. Oda dik mikroskoplar kullanarak görüntüleme için tasarlanmıştır, ama kurulum da sadece oda çevirerek ters mikroskoplar için çalışır.

Burada larvaSPA'nın nöronal dendrite dinamiği ve dendrite dejenerasyonu ile sınıf IV da (C4 da) nöronlarını bir model olarak incelemede uygulamalarını gösteriyoruz (Şekil 2, Şekil 3, Videolar S2–S4). C4 da nöronlar larva vücut duvarında bulunan somatosensoriyel nosiceptors vardır, olan dendritler larva epidermis innerve1,20,21,22. C4 da dendrites larva gelişimi boyunca son derece dinamik büyüme davranışları sergilemek, vücut yüzeyinin tam kapsama veya boşluk doldurma sonuçlanan23. C4 da nöronlarda başarıyla fiziksel yaralanma24,25,26,27sonra dendrite dejenerasyon ve rejenerasyon çalışması için kullanılmıştır.

Görüntüleme dendrit dinamiği için, ikinci instarda 48 saat ile ikinci instarda 120 saat AEL arasında değişen larvalar, nokta taramalı konfokal mikroskopi kullanılarak zaman atlamalı görüntüleme için görüntüleme odasına monte edildi. Zaman atlamalı filmler ppk-CD4-tdTom veya UAS-CD4-tdTom tarafından etiketlenen C4 da dendrites büyüme davranışlarını yakalamak için 3 dakika aralığı ile alınmıştır ppk-Gal46tahrik . Görüntüleme dönemi boyunca (12 saate kadar), C4 da nöronların yüksek sıralı dendrit dalları, uzatma, geri çekme, dal oluşumu ve dal eliminasyonu(Şekil 2A–2F)dahil olmak üzere, nöronların sağlığını gösteren karmaşık büyüme davranışları sergiledi. Filmlerimiz de diğer dendritlerle temasa geçtikten sonra dendrit uçlarının geri çekildiği homotipik dendro-dendrit itmeleri yakalamıştı (Şekil 2F). Genel olarak, bu sonuçlar LarvaSPA kullanarak zaman atlamalı görüntüleme nörogelişim çalışmada etkili olduğunu göstermektedir.

Dendrit dejenerasyonu görüntülemek için, C4 da nöronal hücre cisimlerinin yakınında birincil dendritleri ayırmak için Bir MaiTai lazeri kullandık. Larvalar kurtarıldı ve yaralanmadan sonra 1.5 saatten başlayarak görüntüleme odasına monte edildi (AI)(Şekil 3, Video S4). Filmler dendrite dejenerasyonu sırasında önemli olaylar kaydedildi, dendrite şişmesi de dahil olmak üzere, dendrite parçalanma, ve dendrite enkaz temizliği. Aynı deneyde, larva yağ gövdesi de Annexin V-GFP (AV-GFP), hücre yüzeyinde dışsalfosfatidilserin (PS) etiketleri bir sensör salgılamak için tasarlandı27. Biz AV-GFP tarafından dejeneratif dendritlerin özel etiketleme gözlendi (Şekil 3), PS fagositositler tarafından sonraki açıklık için bir yeme-me sinyali olarak hizmet vermek için dejeneratif dendritlerin yüzeyinde maruz olduğunu düşündüren27.

Şekil 1: LarvaSPA montajı için görüntüleme odası. (A) Görüntüleme odasının hem üst görünümü hem de yan görünümü gösteren ayrıntılı özelliklere sahip diyagramları. Üst görünümdeki açık mavi gölgeleme, nemlendirilmiş lens kağıdını gösterir. Oda bir üst kapak ve bir alt kapak kayma ile mühürlü. Monte edilmiş larvanın konumu gösterilmiştir. (B) PDMS kalıbının diyagramları (üst görünüm) ve PDMS karışımı (yan görünüm) ile dolduruldıktan sonra kalıp. Gri şeritler sırasıyla iki 1 katmanlı, iki 2 katmanlı ve iki 3 katmanlı bant şeritleri gösterir. Yan görünümdeki sarı gölgeleme, kalıptaki PDMS karışımını gösterir. Noktalı çizgiler, tedavi edilen PDMS'nin nerede kesilen nerede kesişeceklerini gösterir. Diyagramın yan görünümü ölçekle çizilmez. (C) PdMS kübik bir üst görünümü ve yan görünümünü gösteren fotoğraflar. Ölçek çubuğu = 1 mm. (D) Montajdan önce bir görüntüleme odasını gösteren fotoğraflar ve altı immobilize üçüncü instar Drosophila larvası ile bir görüntüleme odası dorsal tarafı yukarı monte edilmiştir. Ölçek çubuğu = 10 mm. (E) Bir larvanın daha yakın görünümü (D). Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dendrit dinamiğinin hızlandırılmış görüntülemesi. (A-F) Görüntüleme başladıktan sonra belirli zaman noktalarında sınıf IV da nöron dendrites zaman atlamalı filmlerden seçilen kareler. Larvagörüntüleri 48 h AEL (A ve F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C), ve 120 h AEL (D) alınmıştır. Nöronlar ppk>CD4-tdTom (A, D, E, ve F) veya ppk >CD4-tdTom (B ve C) ile etiketlenir. Mavi oklar bir önceki zaman noktasına göre dendrite geri çekilmelerini gösterir. Sarı oklar önceki zaman noktasına göre dendrite uzantıları gösterir. (E) Görüntüleme 12 saat sonunda dendrit morfolojisi. (F) Bir filmde, ikinci bir instar larvasında bir dendrite dalının nasıl uzatıldığını (sarı oklar) ve daha sonra başka bir denditle temas ettikten sonra (mavi oklar) nasıl geri çekildiklerini gösteren ardışık kareler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dendrit dejenerasyonunun hızlandırılmış görüntülemesi ve yeme-me sinyalinin maruz ilerlemesi. Lazer yaralanması sonrası bir sınıf IV da nöron dejeneratif dendritler bir zaman atlamalı film seçilen kareler. Dendritler ppk>CD4-tdTometiketiyle etiketlendi. Dejeneratif dendritler üzerinde eat-me sinyal PS Annexin-GFP (AV-GFP), hangi yağ vücut tarafından salgılanır tarafından tespit edildi. Sarı oklar AV-GFP etiketini gösteren dalları gösterir. Mavi oklar parçalanma geçiren dendritleri işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video S1: Üçüncü bir yıldız larvası bir PDMS kübik çentik içinde hareketsiz. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video S2: Dendritler ikinci bir yıldız larvasında dinamik olarak uzatır ve geri çekilir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video S3: Dendrites genişletmek ve bir gezgin üçüncü yıldız larva dinamik olarak geri çekmek. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Video S4: Dendritler dejenere ve üçüncü bir instar larva lazer yaralanması sonrası fosfatidilserin maruz. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.