In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

Özet

Yeni dizi özgüllüğü olan restriksiyon endokleazları kısmen dejenere olmuş bir diziyi tanıyan enzimlerden geliştirilebilir. Burada, NlaIV enziminin dizi özgüllüğünü değiştirmek için başarıyla kullandığımız ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokolün temel bileşenleri transkripsiyon/çeviri reaksiyonunun in vitro bölümleme ve yeni dizi özellikleri ile varyantların seçimidir.

Özet

Kısıtlama endokleaz (REase) özgüllük mühendisliği son derece zordur. Burada ebeveyn enziminden daha sıkı özgüllüklere sahip REase varyantları üretmeye yardımcı olan çok aşamalı bir protokolü açıklıyoruz. Protokol, DNA bağlamasını etkileme olasılığı yüksek pozisyonlarda değişkenlik ile ideal olarak REase varyantları için ifade seçim kasetleri (ESCs) bir kütüphane oluşturulmasını gerektirir. ESC, istenilen kısıtlama alanı aktivitesi için bir dizi, bir biyotin etiketi ve diğer tarafta istenmeyen aktivite için bir kısıtlama alanı ve astar lama alanı ile çevrilidir. ESC'ler, damlacık başına birden fazla DNA molekülünün varlığını olası hale getiren koşullarda, petrol de su emülsiyonuna dönüştürülür ve tercüme edilir. Bu nedenle, her kaset molekülündeki DNA sadece çevrilmiş, kodlanmış enzimin aktivitesine maruz kalmaktadır. İstenilen özgüllük REase türevleri biotin etiketi ni kaldırır, ancak astar lama sitesini kaldırmaz. Emülsiyon kırıldıktan sonra, DNA molekülleri bir biotin pulldown tabi tutulur, ve sadece supernatant olanlar korunur. Bu adım, yalnızca istenen etkinliği kaybetmemiş varyantlar için ESC'lerin korunamadığını garanti eder. Bu DNA molekülleri daha sonra ilk PCR reaksiyonuna maruz kalınır. İstenmeyen dizideki dekolte astarlardan biri için astar bağlama alanını keser. Bu nedenle, PCR istenmeyen etkinlik olmadan damlacıklardan sadece ESC'leri güçlendirir. İkinci bir PCR reaksiyonu daha sonra istenilen özgüllük ve biyotin etiketi için kısıtlama alanı yeniden tanıtmak için yapılır, böylece seçim adımı yinelenebilir. Seçilen açık okuma çerçeveleri aynı zamanda ebeveyn REase cognate metiltransferaz ifade bakteri hücrelerinde aşırı ifade edilebilir, yeni evrimleşmiş REase metiltransferaz hedef sitelerin sadece bir alt kümesi hedefleri çünkü.

Giriş

Dizi özgüllük mühendisliği sınıf II REases için son derece zordur. Bu ensonükleaz sınıfında, dizi tanıma ve kataliz yakından iç içedir, büyük olasılıkla konak DNA'sına zarar verecek olan daha geniş özgüllükte bir ensonükleaz yaratılmasına karşı evrimsel bir koruma olarak. Hücrelerdeki yeni özelliklerin yönlendirilmiş evrimi, konak DNA'sını yeni tasarlanmış endonükleaz aktivitesine karşı koruma ihtiyacı ile daha da karmaşık hale getirir. Bu nedenle, REase mühendislik bildirilen sadece birkaç başarılı girişimleri vardır ve hepsi belirli^,bir enzim^1,2,^3,,4,5,6,7benzersiz özellikleri yararlanmak .

Burada bir NlaIV enonuclease⁸bizim başarılı mühendislik dayalı bir ebeveyn enzim daha dar özgüllük var ensonükle varçları oluşturmak için kullanılabilecek özgüllük mühendisliği için ayrıntılı bir protokol sağlar. Keyfi tanıma dizisi olan bu tür bir enzim için, yanlarda bazlar için ekstra özgüllük getirilebilir. Kısmen dejenere dizileri tanıyan ebeveyn enzimleri için (GGNNCC hedefi olan NlaIV gibi), tanıma sırası içinde ek özgüllük de ortaya çıkabilir. Ekstra özgüllük muhtemelen protein-DNA temasları gerektirecektir gibi, yeni tanınan bazlar DNA üzerinde ebeveyn enonukleaz ayak izi içinde yalan olmalıdır. Prensip olarak, tanıma sırasının istenilen herhangi bir uzmanlık için seçim şemaları ayarlanabilir. Ancak, palindromik ve neredeyse palindromik hedef dizileri tanımak en REases palindrom sadece yarım site tanıyan fonksiyonel dimers vardır. Bu nedenle, protein nükleik etkileşimlerinin simetrisini ihlal eden yeni özgüllüklerin seçilmesi pek olası değildir. Dimeric NlaIV için, örneğin, GGNNCC dizisi teorik olarak GGATCC'ye daraltılabilir ancak özgüllüğü GGAACC'ye kadar daraltmanın daha zor olması beklenir. Planımız hem olumlu hem de olumsuz seçimi içerir.

Negatif seçim, tercih edilen dar özgüllük dışında tüm dizileri cleave mümkün özellikleri kaldırmak için de kullanıldığında işlem daha verimlidir. Örneğin, GGATCC seçimi GGBVCC'ye karşı antiseçimle birleştirilebilir (B'nin A'dan başka bir baz olduğu ve V'nin T'den başka bir baz olduğu). Olası hedef dizilerden bazıları ele alınmadığında, seçim deneyinin sonucu pozitif ve negatif seçimin etkinliğine bağlıdır. NlaIV çalışmamızda GGATCC için ve GGSSCC'ye karşı (S'nin G veya C olduğu yer) seçildik ve simetri kırma hedeflerini göz ardı ederek GGWWCC (W'nin A veya T olduğu yerde) olarak tanımlanabilecek bir özgüllük elde ettik ve bu özel durumda negatif seçimin daha fazla olduğunu öne sürdük. pozitif seçimden daha önemlidir.

Yaklaşımımız bir ifade seçim kaseti (ESC) oluşturulması ile başlar. ESC bölümler halinde yapılandırılmıştır. İç çekirdek bölümünde, T7 organizatörü kontrolü altında, REase açık okuma çerçevesi (ORF) türevleri vardır. ESC'nin bu çekirdek bölümü, tasarlanmış REase için herhangi bir biliş alanı içeremez. Çekirdek vahşi tip REase için iki cognate siteleri arasında sıkışmış: istenmeyen etkinlik için bir bölünme sitesi (sayaç seçilen sıra, ggSCcbu örnekte) ve istenen etkinlik için bir bölünme sitesi (seçilen sıra, ggATCC örnekte). PCR ESC hazırlanması son adım 5 'sonunda istenilen aktiviteyakın biotin ekler ve sayaç seçilen dizileri çeşitli oluşturur (örnekte GGSSCC). Seçim stratejisi, esc reamplifikasyon protokolünde dikkatle tasarlanmış astarların in vitro transkripsiyon/çeviri/seçim protokolünden sonra kullanılmasına dayanır (Şekil 1A). ESC kütüphane bir in vitro bölümlü transkripsiyon çeviri su-in-oil emülsiyon^99,10,,11ifade edilir. Her damlacık içinde, ifade edilen enzimin özgüllüğü ESC'nin durumunu etkiler(Şekil 1B, adım I). Açıklanan düzenleme için, çevrilen proteinin istenilen bölünme aktivitesi DNA'nın biyotin etiketini kaldırır, ancak sayaç seçilen sıra ile diğer ESC ucunu etkilemez. Emülsiyon kırıldığında, biyotinylated parçaları streptavidin yakınlık pulldown tarafından kaldırılır, böylece istenilen aktivite ile damlacıklardan sadece parçaları kalır(Şekil 1B, adım II). Bu adım, etkin olmayan REase türevlerini kaldırır. Çekme adımın supernatant fraksiyonu daha sonra PCR tarafından yükseltilir. İlk PCR reaksiyon astarlarında F2 ve R1 kullanılır(Şekil 1A,B,adım III). Primer F2, sayaç seçili sıra ile molekül sonu arasındaki ESC bölümüne bağlanır. Bu nedenle, sayaç seçilen sırayı ayırabilen (ve bu nedenle F2 ve R1'in bağlama alanlarını iki farklı DNA molekülü olarak ayıran) varyantları ifade eden ESC'ler yükseltilmez ve böylece kitaplıktan çıkarılır. Astar R1, seçilen sitenin bölünme durumundan etkilenmemesi için seçilen site ile ESC'nin çekirdeği arasında bağlanır ve istenilen etkinlik (GGATCC) için bölünme alanını geri yükler. Döngü, seçilen siteye yakın 5' ucuna biotin ekleyen ikinci bir PCR (F1 ve R2 ile) tarafından kapatılır ve ESC'nin karşı ucuna yakın seçilen sitede tasarlanan varyasyonu geri getirir(Şekil 1B, adım IV). Ortaya çıkan DNA karışımı başka bir seçim turu için hazırdır.

Seçim protokolünün başarısı, yeni, daha sıkı hedef tanıma dizisinin doğru seçimine ve mutagenez stratejisinin dikkatli tasarımına ve etkin uygulanmasına bağlıdır. REase'in önceden var olan küçük tercihlerini geliştirmek, bunları aşmaktan çok daha kolay olduğundan, önceden var olan tercihlerin kinetik bir çalışmasıyla başlamanızı öneririz. Dikkatli mutagenez tasarımının gerekliliği, sunulan protokol (tek bir deneyde 10⁹ klon) ile işlenebilen bir mutant kütüphanesinin sınırlı boyutundan kaynaklanmaktadır. Bu nedenle tüm 20 olası amino asit ikameleri etkili sadece birkaç pozisyonda test edilebilir (Tartışma bakınız). Alternatif bir yöntem olarak sunulan hataya meyilli PCR (EP-PCR) gibi rastgele mutagenez, mevcut karmaşıklığın derin bir şekilde örnek alınmasına yol açacaktır. DNA ile temaslarda yer alan potansiyel amino asit pozisyonları ile ilgili herhangi bir bilgi (hatta bir cognate dizisinde dejenere nükleotidlere yakın bir konumda bulunan) varsa, oligonükleotid güdümlü doygunluk mutagenezi için birkaç amino asit seçmek için kesinlikle kullanılmalıdır (protokol adımları 1.6-3.10).

Protokol

1. ESC'lerin hazırlanması

1. Düşük kopya numarası plazmid (örneğin, pACYC184 veya pACYC174 veya bunların türevleri) olarak tasarlanacak kısıtlama-modifikasyon sisteminin klonme metiltransferazı.
   NOT: Bakteriyel konak suşu klonlanmış enzim tarafından tanıtılan metilasyontore ve T7 RNA polimeraz indüklenebilir ifade sağlamak gerekir. ER2566 suş (McrA, McrBC ve Mrr mutasyonları taşıyan) kullanılması tavsiye edilir.
2. Rekombinant plazmid DNA'sının, enzim tedarikçisi tarafından 2 saat boyunca önerilen tampon ve sıcaklıkta 10 ünite cognate REase ile 0,5 g plazmid DNA'sı ile 0,5 g plazmid DNA'sı tedavi edilerek koloktate karşı korunduğunu doğrulayın.
3. Bu türün yetkin hücrelerini hazırlayın.
   NOT: Herhangi bir yöntem kullanılabilir. NlaIV mühendislik projesi basit bir kalsiyum klorür yöntemi¹²kullanılır.
4. Farklı bir dışlama grubundan T7 organizatörü kontrolü altında REase için ORF ile rekombinant plazmid ve adım 1.1 metiltrasferase geni içeren bir farklı bir seçim belirteci ile inşa. PET28 ve pET30 vektörleri kullanılabilir.
5. Sessiz mutasyonlar(Şekil 2, Tablo 1A) tanıtarak T7 organizatörü ve ORF enziminin stop kodonu arasındaki rekombinant plazmidin bölümünden mühendislik enziminin tüm tanıma bölgelerini çıkarın.
   NOT: Birden fazla bu sitenin çıkarılması gerekiyorsa, birden fazla mutasyon turu gerekecektir (adım 1.5.1-1.5.7).
   1. Astarların 5' ucunda tanıtılan tasarlanmış varyasyonlarla tam uzunlukta plazmidi güçlendiren bir iç-dış PCR reaksiyonu kullanın(Tablo 2A).
   2. PCR reaksiyonunun 50°L'ine 10 U DpnI enonukleaz ekleyerek şablon DNA'sını çıkarın ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
   3. Agarose jel elektroforez ile ürünleri çözün. Tam uzunlukta plazmid karşılık gelen bant kesip ve ticari bir kit ile arındırın.
   4. 10x ligasyon tampon (1x konsantrasyonu için) ekleyin ve ATP (1 mM) ile ek. 37 °C'de 20 dakika boyunca 10 U T4 polinükleotid kinaz ve kuluçka ekleyin. 10 dakika boyunca 70 °C'de ısıtın.
   5. PEG 4000 ila%5, ATP (1 mM) ile tekrar ek ve 5 U T4 DNA ligaz ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat (RT) kuluçka.
   6. Cognate metetiltransferaz taşıyan yetkin bir bakteri suş dönüştürün (adım 1.1).
   7. Plazmid DNA'sını küçük ölçekte izole edin ve dideoksi dizileme ile dizi değişikliklerinin girişini onaylayın.
6. Oligonükleotid güdümlü mutagenezinin hedef açtığı sekans(lar)a yakın benzersiz kısıtlama sitelerini tanıtın (Şekil 2, Tablo 1B). Her site için 1.5.1-1.5.7 adımlarını izleyin.
   NOT: Bu adım yalnızca hedeflenen mutagenez kullanıldığında gerçekleştirilir. Rasgele mutagenezi yapıyorsanız, 2-3 adımlarını atlayın ve bunun yerine bölüm 3'e ilerleyin. Sunulan örnekte tüm siteler hedeflenen bölgelerin yukarısına tanıtıldı, ancak onlar da aşağı tanıtılabilir.
7. ESC'nin (Tablo 1C) yükseltilmesi için tasarım astarları.
   1. Seçilen NlaIV dizisinin dışına bağlanan ve 5' sonunda biotin içeren, seçilen tanıma sitesini (R1) ve daha kısa sürümünü (R2) tanıtacak olan ensonüklelease ORF'nin ters astar bağlama alt akışı tasarlayın (Bkz. Şekil 1).
   2. T7 organizatörün ESC upstream'ine bağlanan bir ileri astar (F1) tasarla. Bu astar aynı zamanda orijinal tanıma dizisinin karşı seçimli varyantını(lar) tanıtmalıdır (yani, seçilen ters dizi hariç orijinal enzim tarafından tanınan en fazla dizi varyasyonları).
      NOT: Bu astarın (F2) seçili dizideki distal dizisini kapsayan daha kısa bir sürümü daha sonra seçici PCR'de (adım 5.9) kullanılacaktır.

2. Mutajenik Astarların Bölünüp Karıştırılması

NOT: Bu adım yalnızca birden fazla sitede subsatürasyon mutagenezi gerektiren projeler için kullanılır. Birden çok sentez sütunları olan bir sentezleyici gereklidir. Randomize NNS kodon üçüzlerinin ve yabani tip kodon üçlülerinin mutagenez frekanslarına göre sentezi için sütunlar atayın. Örneğin, yedi eşit hacimli sentez sütunu varsa ve belirli bir sitede 0,3 mutagenez oranı arzu ediliyorsa, ~0,3 x 7 veya iki sütunda randomize NNS kodonları ve ~0,7 x 7 veya beş sütundaki yabani tip kodonları ekleyin(Şekil 3).

1. Subsatürasyon mutagenezi için siteler hakkında karar verin. Sitelerin varsayımsal önemine göre mutagenez frekanslarını seçin (yani, site ne kadar önemlise, frekans o kadar yüksektir), genel kütüphane karmaşıklığını göz önünde bulundurun (Bkz. Tartışma).
2. Tüm kolonlarda oligonükleotidsentez, 3'-uçtan sayma ikinci subsatürasyon mutagenesis sitehemen öncesinde üçüz kadar. Son sentez döngüsünde 5'-trityl koruma grubunu çıkarmayın (synthesizer'daki trityl-on seçeneğini kullanın). Koruma grubu bir sonraki sentez döngüsünün başında kaldırılacaktır (Şekil 3'tekiadım 1).
3. Sentez sütunlarını açın. Kontrollü gözenek cam (CPG) sentez desteğikuru 1,5 mL tüp içine toplamak ve girdap tarafından karıştırın. Karışık CpG recinin yeni sentez sütunlarına bölünmesi. Genel verimi azaltacağı için nemi tanıtmaktan kaçının (Şekil 3'teki2 ve 4. adımlar).
4. Subsatürasyon mutagenez bölgesi üçüz başlayarak, sentezdevam edin. İstenilen mutagenez frekansına göre rastgele NNS üçüzlerine veya yabani tip üçüzlere sütun atayın (yukarıdaki nota bakın). Ek subsatürasyon alanları varsa, sadece bir sonraki subsatürasyon mutagenesis bölgesinden önceki üçüz bölgeye ilerleyin. Yine, sonunda bir 5'-trityl grubu bırakın (synthesizer üzerinde 5'-trityl-on seçeneği) (Şekil 3'teadım 3). Sonra adım 2.3 ile devam edin.
5. Akıntının aşağısında başka subsatürasyon alanı yoksa, sentezi tamamlayın ve sonunda 5'-trityl grubu bırakarak (synthesizer'da 5'-trityl-on seçeneği) (Şekil 3'tekiadım 5).
6. Saflaştırma kartuşunu üreticinin talimatlarına göre oligonükleotid kitaplığını koruyun ve arındırın.
   NOT: KSK'dan deprotection tarafından salınan oligonükleotidler de ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC) trityl-on ile saflaştırılabilir ve ardından manuel tritil grubu çıkarılması (RT'de %80 asetik asitle 1 saat tedavi) ve ikinci bir HPLC saflaştırması.
7. Bir üre-PAGE jel oligonükleotid kütüphane kalitesini kontrol edin.

3. Varyant Kütüphaneleri Oluşturma

NOT: Adım 1.6 rekombinant plazmid kullanın.

1. Oligonükleotid yönelimli mutagenez ile kütüphaneler oluşturun.
   NOT: Alternatif olarak, EP-PCR protokolünü (adım 3.2) kullanın.
   1. T7 promotöründen mutagenez ile hedeflenen diziyi çevreleyen benzersiz restriksiyon enzim bölgesine bir bölümü yükseltin (NlaIV durumunda: SalI, EcoRI veya Eco52I)(Tablo 1B-C, Tablo 2B, Şekil 4). İkinci bölümü benzersiz restriksiyon enzim bölgesinden ESC'nin 3' ucuna kadar yükseltin.
   2. PCR reaksiyonlarının 5 μL'sini (adım 3.1.1'den) 8°L su, 10x restriksiyon enzimtamponu 1.5 l ve uygun restriksiyon enzimlerinin (SalI, EcoRI veya Eco52I) 5 ünitesini karıştırın ve 2 saat için uygun sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.
   3. Agarose jel elektroforezkullanarak her iki reaksiyonun ürünlerini çözün. Beklenen boyut bantlarını kesin ve ticari bir kit ile arındırın.
   4. Bir agarose jel saflaştırılmış ürünlerin 1/3 kadar çalıştırın ve densitometri ile her safbant konsantrasyonu ölçmek.
   5. 1x ligaz tampon ve 1 U T4 DNA ligaz ve RT 2 saat için inkübat ile 1:1 molar oranı ESCs iki bölümünün ligasyon ayarlayın.
   6. Agarose jelreaksiyon ürünleri çözmek. Beklenen boyuttaki ürünleri kesin ve ticari bir kit ile arındırın.
   7. Arınmış ligasyon ürünlerini PCR reaksiyonunda f1 ve R2 astarları(Tablo 1C ve Tablo 2A)ile yükseltin. 20'den fazla amplifikasyon döngüsü çalıştırmayın.
   8. Bir agarose jel PCR reaksiyonları fraksiyone. Ürünleri kesip ticari bir kit ile arındırın.
   9. Agarose jel önceki adımdan saflaştırılmış kütüphane bir 5 μL aliquot çalıştırın ve densitometri ile konsantrasyonu ölçmek.
   10. Mutasyon sıklığını ve dağılımını kontrol etmek için kitaplığın küçük bir örneğini (5 μL'ye kadar) ve sıra >15 klonlar klonlar (Tablo 3). Adım 4'e geçin.
       NOT: Alternatif olarak, ESC'lerin küçük numunesinin yüksek iş elde sıralaması kullanılabilir.
2. EP-PCR gerçekleştirin.
   1. Adım 1.5.7'de elde edilen plazmidden ESC'yi F1 ve R1 astarları ile yükseltin. Taq I polimeraz(Tablo 1B)ile 20 döngü çalıştırın.
   2. Jel PCR ürün arındırmak.
   3. Önceki adımdan 2 ng saflaştırılmış PCR ürünüyle EP-PCR'yi ayarlayın ve F1 ve R1 astarlarla 15 döngü EP-PCR(Tablo 1C)çalıştırın.
   4. Jel ürünü arındırın ve jel densitometri ile ölçün.
      NOT: Saflaştırılmış EP-PCR ürününün düşük konsantrasyonu nedeniyle sayısallaştırma için yaklaşık 1/3 kullanın.
   5. Mutasyon sıklığını ve dağılımını kontrol etmek için kitaplığın küçük bir örneğini (1/5'e kadar) ve sıra >15 klonlar klonlar (Tablo 4).
      NOT: Alternatif olarak, ESC'lerin küçük örneğinin yüksek iş yapma örneklemesini gerçekleştirin.

4. Bölümlü İn Vitro Transkripsiyon-çeviri Reaksiyonu

1. In vitro transkripsiyon-çeviride ensonükleaz ekspresyonu ve enzimatik aktiviteyi test edin.
   1. Dekolte reaksiyonu kolayca tespit edilebilmek için molekülün merkezine yakın bulunan ensonükleaz için tek bir tanıma alanı ile kısa (200-500 bp) bir substrat hazırlayın.
      NOT: Substratı hazırlamanın en kolay yolu, herhangi bir DNA molekülünün uygun bir parçasının PCR amplifikasyonudur. Dekolte tespitini kolaylaştırmak için alt tabaka radyoetiketli veya floresan olarak etiketlenebilir.
   2. Üreticinin tavsiyelerine göre 0,5 g vahşi tip ESC ile 50 μL transkripsiyon-çeviri reaksiyonu ayarlayın. Magnezyum tuzu ekleyin (MgCl₂, MgSO₄, ve magnezyum asetat test edilebilir) 1.5 mM ve bir önceki adımdan substrat uygun miktarda (en az 0.5 μg etiketsiz DNA durumunda).
      NOT: Magnezyum tarafından aktive nükleaz içermeyen herhangi bir transkripsiyon / çeviri kiti kullanılabilir. Bazı kit satıcıları üretim sırasında DNA kontaminasyonunu gidermek ve daha sonra nükleaz inhibitörleri olarak şelatörler eklemek için nükleaz kullanın. Bu tür kitleri bu yöntem ile uyumlu değildir.
   3. Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu üreticinin talimatlarına göre kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyon karışımını 2 saat boyunca restriksiyon enzimi için en uygun sıcaklığa aktarın.
   4. Bir agarose jel içinde substrat dekolte analiz uygun algılama (örneğin, DNA boyama, floresan görüntüleme veya otoradyografi)(Şekil 5).
      NOT: Bölme işlemine devam etmeden önce substratın en azından kısmi bölünmesi gereklidir. Bu elde edilmezse, magnezyum kimyasal formu veya konsantrasyonu daha fazla optimizasyon gereklidir.
2. 15 mL konik bir tüpe 225 μL Span 80 ve 25 μL'lik 80 ila 5 mL mineral yağ ekleyerek yağ sürfaktan karışımı hazırlayın. Tüpü 15x ters çevirerek iyice karıştırın.
3. Her kütüphane için 950 μL yağ sürfaktan karışımını 2 mL yuvarlak alt kriyojenik şişeye, kütüphane adı içeren etikete aktarın ve buza aktarın. Her şişenin içine küçük bir silindirik karıştırma çubuğu (5 x 2 mm²⁾koyun.
4. Üreticinin önerilerine göre bir in vitro transkripsiyon-çeviri reaksiyon karışımı (her kütüphane için 50 μL) hazırlayın. Karışımı magnezyum klorür ile 1,5 mM'lik son konsantrasyona tamamlayın (bkz. adım 4.1.4).
5. Buz üzerinde 1,5 mL tüpler içine 50 μL aliquots dağıtın.
6. Buz üzerindeki reaksiyon karışımına kütüphaneden 1,7 fmole (bölüm 3'ten) ekleyin.
   NOT: Seçim verimliliği için daha yüksek miktarda ifade kitaplığı kullanmayın. Birden fazla DNA molekülü içeren sulu damlacıkların sıklığını en aza indirmek çok önemlidir.
7. Her kütüphane için art arda yağ içi su emülsiyonunu hazırlayın.
   1. 1.150 rpm olarak belirlenen karıştırma hızı ile manyetik bir karıştırıcı üzerinde buz dolu küçük bir kabı (veya büyük şişe fincan) koyun.
   2. 950 μL yağ sürfaktan karışımı ve 4.3 adımdan küçük bir karıştırma çubuğuna sahip kriyojenik bir şişeyi manyetik karıştırıcıdaki buz gibi bir kabına aktarın. Karıştırma çubuğunun döndüğünü kontrol edin.
   3. 30 s aralıklarla 2 dakika süre içinde in vitro kütüphane-transkripsiyon-çeviri karışımı beş 10 μL aliquots ekleyin ve ek bir dakika karıştırmaya devam edin. Emülsiyon ile şişeyi bir buz kabına aktarın. Adım 4.7.2 ile başlayan bir sonraki kitaplığı ile devam edin.
   4. Tüm kütüphaneler işlendikten sonra kit üreticisinin önerilerine göre tüm kütüphanelerin kuluçkaya yatmaktadır.
8. Ek bir 2 saat için mühendislik enonukleaz için optimum sıcaklık şişeleri aktarın ve daha sonra en az 10 dakika buz üzerine koyun.

5. Kütüphanelerin Sürekli İşlenmesi ve Seçimi

1. Kriyojenik şişelerden emülsiyonları soğuk 1,5 mL tüplere aktarın, 0,5 M EDTA'nın 1 μL'sini ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin.
2. Bir pipet ile üst yağ fazını çıkarın. Bir yağ-su interfazı görülmezse, sulu fazı dondurmak için tüpü en az 5 dakika -20 °C'de kuluçkaya yatırın ve hemen sıvı yağ fazını dışarı çıkarın.
3. 10 mM Tris HCl pH 8.0 100 μL ekleyin ve hemen 150 μL fenol ile ekstraksiyon gerçekleştirin:kloroform (1:1 v/v) kısa girdap ve ardından faz ayırma 30 s santrifüj ile 13.000 x g. Üst sulu faz toplayın.
4. 3 M sodyum asetat (pH = 5,2), 2,5-5 g glikojen ve 2,5 vol (375 μL) etanol 0,1 vol (15 μL) ekleyerek DNA'yı çökeltin. -20 °C'de 1 saat, santrifüj 15 dakika 13.000 x g, 4 °C'de kuluçka. Supernatant atın ve kısaca soğuk% 70 etanol 1 mL ile pelet yıkayın.
5. KURU DNA / glikojen pelet bir speedvac veya hava kuru >5 dk.
6. Peleti 10 mM Tris-HCl'nin 50 μL'lik (pH = 7,5) olarak eritin. Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan 5 μL streptavidin manyetik boncukekleyin ve rt'de 1 saat boyunca, tercihen bir atlıkarınca karıştırıcısında veya nazik girdaplarla karıştırın.
7. Bir manyetik standı üzerinde boncuk ayırın ve biotin olmadan DNA zenginleştirilmiş sıvı toplamak.
8. DNA'yı etanol çökeltme ile yoğunlaştırın (adım 5.4-5.5).
9. 5 μL su önceki adımdaki konsantre DNA'yı çözün ve F2 ve R1 astarlarla PCR reaksiyonunda şablon olarak kullanın(Tablo 1A).
   NOT: Şablon kontaminasyonu ile ilgili sorunları önlemek ve PCR yapılarını en aza indirmek için Taks polimeraz (Pfu veya Phusion değil) kullanın ve şablon boyutuyla orantılı uzatma süresiyle 18-20 döngü çalıştırın (Tablo 2B'yebakın).
10. PCR ürünlerini bir agarose jelde kesirle ve beklenen boyuttaki ürünü kesin. Bazı bulaşmalar farklı boyutlarda ürünler olduğunu gösterir (bkz. Şekil 6). Ticari bir kit ile jel levha DNA arındırın.
11. Adım 5.10'dan 50 ng'ye kadar DNA ve adım 5.9'daki yle aynı protokolü kullanarak F1 ve R2'den 50 ng'ye kadar ikinci bir PCR reaksiyonu uygulayın. 5.10'da açıklandığı gibi ürün arınma ile devam edin. Agarose jel densitometri (UV spektroskopisi değil) ile nicel leştirme densitometrisinden sonra saflaştırılmış DNA in vitro seçiminin bir sonraki turunda kullanılabilir (adım 4.6).

6. Değiştirilmiş Sıra Özgüllüğü için ekran varyantları

1. Seçili türevlerini klonla.
   1. Ürünü, orf'nin klonlanması için uygun olan 10 U kısıtlama enzimi ile 2 saat için adım 5.10'dan, enzim satıcısı tarafından önerilen sıcaklık ve tamponda (NlaIV: NcoI ve XhoI için) sindirin. Agarose jel elektroforez ile ürünleri çözün ve beklenen boyut parçası izole.
   2. Plazmid vektörü (örneğin, pET28) adım 6.1.1'deki yle aynı enzimlerle çift dekolte ile hazırlayın ve ürünü ticari bir DNA jel saflaştırma kiti ile arındırın.
   3. Agarose jel elektroforezile densitometri ile vektör ve insert konsantrasyonlarını tahmin edin.
   4. T4 DNA ligaz ve vektör 1-5 U ile bir ligasyon kurmak:insert molar oranı 1:3-1:5 enzim satıcısı tarafından önerilen 1x ligaz tampon. RT 2 saat için kuluçka ve uygun konak bakteri içine tanıtmak (adım 1.3) dönüşüm veya elektroporasyon¹².
   5. Uygun antibiyotik (pET28 veya pET30 vektörleri için 50 μg/mL kanamisin) ve %1 glikoz içeren LB plakalarında ektransformantları seçin.
2. Ekspres protein varyantları.
   1. Tek kolonileri dönüşümden (24 klontek bir koşuda kolayca işlenebilir) kanamisin (50 μg/mL) ve %1 glikoz ile 2 mL LB'ye dönüştürün ve sallayarak bir gecede 37 °C'de büyütün.
   2. 100 g kanamisin içeren 15 mL ılık (37 °C) LB inoculate ve gecelik kültürün 0.75 mL ile glikoz ve güçlü sallayarak 37 °C'de kuluçka.
      NOT: 50 mL santrifüj tüpler veya 100 mL Erlenmayer matarakullanılabilir.
   3. 1 mL gecelik kültüre 176 μL gliserol ekleyin (gliserol son konsantrasyonu = %15) iyice karıştırın ve -70 °C'de dondurun.
   4. 2-3 h ek sonra 15 mL kültür (adım 6.2.1) IPTG ile 1 mM ve kültür ek 5 saat için.
   5. Bakteriyel peleti santrifüj (10.000 x g, 4 °C, 10 dk) toplayın ve -70 °C'de dondurun.
3. Protein çeşitlerini arındırın.
   1. 20 μL nikel afinite reçine süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpte 200 μL B1 tamponuna aktarın, geniş delikli pipet ucu ile hafifçe karıştırın ve santrifüj (5.000 x g, 30 s, 4 °C). Pipetleme ile supernatant çıkarın ve buz üzerinde tüp bırakın.
   2. Bakteriyel peleti 300 μL B1'de 6.2.5'ten güçlü girdaplarla yeniden askıya alın. Süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
   3. B1'e 3 μL 100x proteaz inhibitör kokteyli ve lizom solüsyonu ekleyin (1 mg/mL'lik son konsantrasyon). Bir ucu donanımlı sonda ile sonication ile hücreleri parçalamak. Aradaki buzda >15 s ucu soğutma süresi ile numune başına altı adet 10 s patlama kullanın. Hücre süspansiyonlarını her zaman buzda tutun.
   4. Santrifüj (2 dk, 12.000 x g, 4 °C) ile pelet hücre enkazı ve adım 6.3.1'den 250 μL supernatant'ı reçine aliquot'a aktarın.
   5. Soğuk bir odada 15 dakika, tercihen bir atlıkarınca mikseri veya nazik girdap ile karıştırın.
   6. Santrifüj (5.000 x g, 30 s, 4 °C) ve bir pipet ile supernatant aspire.
   7. 500 μL W arabelleği ekleyin ve reçiyiyi yavaşça yeniden askıya alın. Santrifüj (5.000 x g, 30 s, 4 °C) ve bir pipet ile supernatant aspire.
   8. Adımı 6.3.7'yi tekrarlayın.
   9. 20 μL arabellek E ekleyin, reçineyi yavaşça yeniden askıya alın ve numuneyi 2-5 dk. Santrifüj (5.000 x g,30 s, 4 °C) için buzüzerinde bırakın ve süpernatant'ı toplayın.
   10. Adımı 6.3.9'u tekrarlayın. Havuz süpernatları.
   11. Protein örneklerini SDS-PAGE (5-10 μL) ile analiz edin (Şekil 7).
4. Değiştirilmiş özgüllüklü varyantlar için ekran.
   1. Bakteriyofaj lambda DNA'sında ki test bölünmesi aktivitesi. Protein örneği son reaksiyon hacminin %10'una kadar olabilir. 0,5 g DNA'da toplam 2 μL protein örneği ve 2 saat reaksiyon süresi iyi bir başlangıç noktasıdır.
   2. Yabani tip enzim tarafından üretilen ürünler ile birlikte agarose jel elektroforez ile reaksiyon ürünleri analiz edin. Daha fazla analiz için yabani tip enzim tarafından üretilen den açıkça ayırt edilebilir dekolte desenleri üreten klonlar seçin (Şekil 8).

Sonuçlar

Bu protokol sadece bir mühendislik REase istenilen türevlerinin sıklığını artırmak için iki istenmeyen sınıfları tüketerek (ama ortadan kaldırarak değil): inaktif enzimler ve değişmemiş yabani tip dizi özgüllüğü ile ensonükleazlar. Öte yandan, REase özgüllüğünü değiştirmek son derece zor olduğundan, 24 klondan oluşan tek bir taramada yabani tip enzimden farklı bir dekolte deseni üreten böyle bir varyantı bile bulmak bir başarı olarak kabul edilmelidir. Elimizde en iyi ekranlar umut verici türevlerinin 'sine kadar(Şekil 8A)tanımlayabilir.

Olumlu sonuç, kütüphane kalitesine (yani sınırlı sıklıkta ikamelere ve rasgele dağılımlarına) ve kütüphane üyelerinin biyotinylated popülasyonunun etkin bir şekilde yakalanmasına (3.6-3.7. adım) bağlıdır. Her iki sorun da algılanabilir. Kitaplık kalitesi seçimden önce mümkün olduğunca çok klon sıralayarak (>15) veya kitaplığın doğrudan sıralanmasıyla yüksek iş bölümü sıralaması (adım 3.10, Tablo 3)ile kontrol edilmelidir. Seçilen klonların çoğunluğu etkin değilse, bu streptavidin yakalama seçiminin başarısızlığının açık bir göstergesidir. Bu tür kütüphaneler büyük olasılıkla streptavidin yakalama seçim adımı(Şekil 8B)kaçan inaktif varyantları tarafından hakim olduğu için, birçok seçim döngüleri geçmesi kütüphaneler durumunda benzer bir etki görülmektedir. Bu nedenle, her seçim döngüsünden sonra tarama çalıştırmak ve daha fazla seçim yineleme bağlı yerine el ile seçilmiş umut verici türevleri geliştirmek için tavsiye edilir.

Şekil 1: NlaIV mühendisliğine dayalı yeni bir dizi özgüllüğünün in vitro seçimi. (A)İfade/seçim kasetinin (ESC) organizasyonu, REase için iki tanıma sitesi, 1) seçilen sıra (GGATCC) sağ uca yakın ve 2) sol uca yakın sayaç seçili sıra (GGSSCC) ile T7p ve T7t-T7 organizatörü ve T7 terminatör içerir. Astar bağlama siteleri aşağıda gösterilmiştir. Yabani tip ve seçili NlaIV varyantlarına göre bölünme sırasıyla kırmızı ve yeşil üçgenler olarak gösterilir. (B) Seçim döngüsü adımları: I) Transkripsiyon-çeviri-bölünme reaksiyonunun ESC kütüphanesi ile birleştirilmesi; II) Tüm biyotinylated DNA streptavidin ile kaplı manyetik parçacıklar üzerinde yakalanır ve kaldırılır, böylece kodlama inaktif varyantları kaldırarak; III) REase'leri vahşi tip aktivitesi ile kodlayan ESC'ler (yani GGSSCC dizisini ayırabilenler) ortadan kaldırılır, çünkü dizinin bölünmesi ileri ve geri astarlar için bağlama sitelerini ayırır. Bu nedenle, bu ESCs hiçbir amplifikasyon oluşur; IV) Bir sonraki seçim turuiçin giriş sağ uçta biotin ilavesi ve sol uçta seçilen sayaç dizilerinin varyasyonunun yeniden tanıtılması yla oluşturulur. Elsevier'in izniyle Czapinska ve ark.^8'den yeniden basıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ESC'nin hazırlanması. T7 organizatörü kontrolü altında NlaIV ORF içeren bir ifade vektörü orijinal yapıttından türetilen parça ifade / seçim için uygun olacak şekilde değiştirilmiştir. NlaIV ORF'den aşağı yayılan NlaIV sitesi kaldırıldı ve seçilen pozisyonları mutagenize etmek için kullanılan benzersiz siteler (SalI, EcoRI ve Eco52I) NlaIV ORF'de sessiz mutasyonlar olarak tanıtıldı. Son yapı, iki yan NlaIV sitesi tanıtan yan astarlarla güçlendirilmiştir: solda sayaç seçilen sıra (GGSSCC) ve sağda seçilen sıra (GGATCC). Ters astar da biotin tanıttı. Mutasyona uğramış ECS'lerin oluşturulmasında kullanılan astarlar mavi oklar olarak gösterilir ve aşağıda etiketlenir (bkz. Tablo 1B,C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bölme ve karışım sentezi şeması. Örnek, bir NNS dizisinin dört pozisyonda 0,8 frekansta tanıtıldığı MutB astar sentezini ifade eder (ayrıca bkz. Tablo 3). Kimyasal sentezin 3' den 5'e kadar yapıldığını ancak tüm sekansların 5'-3' oryantasyonda gösterildiğini unutmayın (yani bu şemada sağdan sola doğru ilerler). NNS mutajenik dizileri kırmızı renkte iken mutajenleşmiş pozisyonlarda yabani tip dizileri yeşil olarak gösterilir. Daha sonra ESC'lerde mutasyonları tanıtmak için kullanılan SalI tanıma sitesi altı çizilir. Karıştırma ve bölme adımları noktaları (2 ve 4) belirtilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Oligonükleotid hedefli mutagenezde benzersiz restriksiyon enzim bölgelerinin kullanımı. Mutasyona giriş stratejisi A-C kütüphanelerinin inşasının bir örneğinde gösterilmiştir (bkz. 3.1-3.7. adımlar). Elsevier'in izniyle Czapinska ve ark.^8'den yeniden basıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Endonükleolitik bölünme in vitro transkripsiyon-çeviri. (A) Optimal REase tampon bir test substrat dekoltesi: 1) Substrat, tek bir NlaIV tanıma sitesi ile 612 bp PCR ürün; 2) Dekolte ürünleri, 355 bp ve 257 bp.(B) Dekolte bir in vitro transkripsiyon-çeviri reaksiyonu (ESC 0.5 μg içeren): 1-2) 15 μL in vitro transkripsiyon çeviri substrat olmadan aliquots (satır 2: reaksiyon 1.5 mM MgCl₂ile tamamlanır ); 3–4) 1 μg test substratı ile in vitro transkripsiyon-çeviri15 μL aliquots; (satır 4: reaksiyon 1.5 mM MgCl₂ile desteklenmiştir). S-DNA boyutu belirteci (pBR322 MspI ile sindirilir). Örnekler %6 yerli SAYFA'da çözüldü. DNA ethidyum bromürle lekelenmiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Seçim döngüsündeki ilk PCR ürünleri. Bkz. Şekil 1B, adım III; protokol adım 5.10. Sütun kümeleri 1 ve 2, üç etekli olarak yüklenen iki farklı kütüphanenin aliquotlarıdır. S-DNA boyutu standardı (HindIII ve EcoRI ile sindirilmiş lambda DNA). Ok, tam uzunluktaki ESC'nin (1.050 bp) konumunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Mini ölçekte daha fazla tarama için saflaştırılmış NlaIV varyantları. Bkz. adım 6.3.11. Her satır farklı bir varyantın 10 μL aliquot içerir. S-protein moleküler ağırlık standardı. NaIV REase alt biriminin moleküler kütlesi 29.9 kDa'dır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Sıra özgüllük değişikliği için NlaIV varyantlarının tarama örnekleri. Bkz. adım 6.4.2. (A) Umut verici varyantların yüksek frekanslı başarılı tarama. S = DNA boyutu belirteç, hindIII ve EcoRI ile lambda DNA cleaved; yabani tip (wt) = lambda DNA yabani tip NlaIV ile cleaved; λ = lambda DNA substratı, cleaved değil; diğer sütunlar=çok düşük aktiviteye sahip türevleri. Varyantlar etiketlenir! = yabani tip enzimden farklı bir dekolte deseni üreten umut verici varyantlar; ? = sıra tercihini de değiştirmiş olabilecek türevleri. (B) Başarısız tarama, varyantların çoğunluğu etkin olmayan ve görünüşe göre değişmemiş dekolte deseni ile bir varyant. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Ligasyona göre alternatif seçim. Bu alternatif yapışkan biter üreten tüm REases için kullanılabilir. Burada MwoI enzimi (yayınlanmamış) için bir seçim şeması için örnek bir protokol salıyoruz. I) Seçili sekans (ESC'nin sağ ucunda bulunan) tanımlı kalıntılar kırmızı ve mavi ile gösterilen biliş dizisinin seçili varyasyonu ile gösterilir. ESC'nin sol ucuna yerleştirilecek sayaç seçili sıranın altındaki parantez içinde gösterilir; II) MwoI dekoltesinin ürünü; III) İn vitro transkripsiyon/çeviri sonlandırma yapıldıktan sonra ürünler saflaştırılır ve fazla adaptörle ligasyon yapılır. Sadece seçilen dizide ayrılan dekolte ürünleri ligasyona katılabilir. Bu nedenle, etkin olmayan türevleri ortadan kaldırılır ve çekme adımı gereksizdir. Adaptörün çıkıntılı ucu sayaç seçili sıraya tamamlayıcı olmadığından, sayaç seçili dizideki dekolte ürünü (ESC'nin sol ucunda, gösterilmez) bu ligasyona katılamaz; IV) Seçici PCR, yabani tip dejenere dizi özgüllüğü (F1 astar bağlama distal sayaç seçilen siteye) ile varyantları ortadan kaldırmak için ana protokolde aynı stratejiyi kullanır, oysa inaktif varyantlar amcaaved bağlanamaz seçici ters astar tarafından ortadan kaldırılır (ve bu nedenle adaptör ligasyonu ile değiştirilmez) sağ uç. Bir sonraki döngüde işlem, bir önceki adımın dekolte ürünüyle aynı olan adaptör (yani, panel III'teki "cleaved kaset" ve uygun bir seçici ters astar kullanılarak yinelenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: NlaIV mühendisliğinde kullanılan astarlar. Yorumlarda belirtilen kısıtlama sitelerinin dizileri altı çizilmiştir. Küçük harfler, DNA şablonlarında tamamlayıcı olmayan dizileri gösterir. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Tablo 2: Protokolde kullanılacak PCR reaksiyonlarının koşulları. T_m = astar erime sıcaklığı (T_m astarlar için farklıise, alt T_m kullanılmalıdır). Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Tablo 3: Bölünmüş ve karışım stratejisi ile sentezlenen iki mutajenik astarın kalite kontrolü sonuçları. Mutajenize kodonlar [XXX] ile gösterilir. Daha düşük bir indeks numarası kodlanmış bir amino asitkonumunu gösterir. Elsevier'in izniyle Czapinska ve ark.^8'den uyarlanmıştır. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Tablo 4: EP-PCR sonuçları. ECS'nin 22 klonunun dizi analizinden elde edilen ana parametreler. Bu tabloyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).

Tartışma

Burada açıklanan seçim protokolü NlaIV⁸için test edilmiştir , merkezi NN üsleri ile bir palindromik hedef site tanır ve NN üsleri arasında künt bir uç kesim katalizler dimeric PD-(D/E)XK kat tanıma dizisi. NN bazları arasındaki bölünme bu bazların kompleksteki proteine yakın olduğunu gösterdiği için NlaIV seçilmiştir. Prensip olarak, protokol herhangi bir katlanır grubun herhangi bir dizi özel kısıtlama ensonükleaz, monomerik veya dimeric, katalalitik ve özgüllük etki alanları çakışıyor (NlaIV örnekte olduğu gibi) ya da ayrı (örneğin, FokI) olup olmadığına bakılmaksızın, herhangi bir stagger çift iplikçik tatili katalize için kullanılabilir. Ayrıca, prensipte protokol sadece yeni, daha dar enzim özgüllüğü üretimi için değil, aynı zamanda yıldız aktivitelerini ortadan kaldırmak veya yüksek sadakat endokleazları oluşturmak için de kullanılabilir. Ancak, tüm bu henüz test edilmemiştir. Aynı amino asit artıkları istenilen ve istenmeyen bazlara bağlanmada rol tutulabileceğinden, özellikle yıldız aktivitesinin hedefli ortadan kaldırılması karmaşık olabilir. Bu protokolde açıklanan in vitro adımlar daraltılmış özelliklerin seçimi yle sınırlı değildir, ancak başka türlü değiştirilmiş özellikleri seçmek için de kullanılabilir. Ancak, varyant endokleazlarla ilgili bir sorun vardır: eğer substrat spektrumu ebeveyn endokleazı tarafından ayrılmayan yeni hedefler içeriyorsa, hücreleri bu aktivitenin zararlı etkilerinden korumanın genel olarak iyi bir yolu yoktur. Buna karşılık, ensonükleaz özgüllüğü sadece daraltılırsa, hedefler yabani tip hedeflerin bir alt kümesidir ve bu nedenle zaten mevcut olan cognate metetiltransferaz tamamen koruyucu olmalıdır.

Protokolümüz birçok yönelimli evrim protokolünden birçok açıdan farklıdır. Açık okuma çerçevesi çeşitliliği, her yinelemede değil, denemenin başında bir kez oluşturulur. Ayrıca, EP-PCR yerine bölme ve karıştırma sentezi ile oluşturulur. Bu çalışmada kullanıldığı gibi kodonların NNS ikameleri için altı pozisyon için (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1,07 x 10⁹ kombinasyonları vardır. Bu nedenle, herhangi bir varyant ESC 1.7 fmoles bir kez ortalama olarak mevcuttur. Glen Research tarafından sunulan 20 trinükleotid öncüllerinin karışımı yla sentez kullanılarak veya split-and-mix oligonükleotid sentezi ile daha az umut verici pozisyonlarda mutasyon frekansı azaltılarak bu kapasite yedi konuma yükseltilebilir. Mümkünse, varyasyonun kapsamını altı konumla sınırlamak önerilir. Açıkçası, bu tür mutagenez hedefleme substrat bağlama dahil REase en azından bölgeleri hakkında bazı önceden varolan bilgi gerektirir. Çeşitlilik oluşturmak için split-and-mix protokolü EP-PCR ile karşılaştırıldığında net avantajlara sahiptir. EP-PCR kullanarak, aynı EP-PCR'de NlaIV ESC'ler için sekiz ikame taşıyan değişmemiş varyantlar ve diziler elde ettik(Tablo 4). EP-PCR'nin kütüphanesi, kaçınılması gereken klonların önemli bir kısmını içerir (vahşi tip dizileri, çoklu değişimler, kare kayması ve saçma mutasyonlar ve dizi özgüllüğünü etkilemeolasılığı düşük yerlerdeki mutasyonlar).

Protokolümüz aynı zamanda diğer birçok yönlendirilmiş evrim protokolünden iki sıralı seçim adımı nın varlığı ile farklıdır. Pozitif seçim istenilen aktivitenin korunmasını sağlar, aksi takdirde biotin etiketi kaldırılmaz ve kodlama sırası aşağı çekilerek kaldırılabilir. Teknik olarak, bir romanın tesadüfi ortaya çıkması, örtüşmeyen özgüllük (örneğin, GCATGC) biotin etiketinin kesilmesine yol açabilir, eğer uygun bir dekolte alanı istenilen dekolte yakınında mevcutsa, ancak başka bir yerde değil. Ancak, bu son derece olası olmalıdır. Negatif seçim, hala istenmeyen aktiviteye sahip enzimleri kodlayan açık okuma çerçevelerini kaldırır. Bu adım kesinlikle zorunlu değildir, çünkü protokol yine de çıkış kitaplığını seçim sırasını bozabilecek ancak ESC'nin başka bir yerinde ayrılamayan varyantlarla zenginleştirecek, bu nedenle pcr amplifikasyon için uygun hale getirecektir. Ancak, orijinal dizi özgüllüğüne sahip enzimler çıktıdan çıkarılmayacağı ve değişmiş özgüllüğe sahip umut verici varyantları aşacağı, aynı zamanda enzimaktivitesini azaltacağı için seçim etkinliğinin daha düşük olması beklenmektedir. Nüfus düzeyinde, hem istenilen hem de istenmeyen hedef dizilerinin dejenere olabileceğini, ancak buna gerek olmadığını unutmayın. NlaIV örneğinde, anti-hedef dejenere ve hedef dejenere değildi. Nüfus düzeyinde dejenerati olsa bile, tek bir damlacıkta sadece bir (dejenere olmayan) hedef veya anti-hedef mevcuttur. Protokolümüzde, seçim adımlarının her tekrarında hedef ve hedef karşıtı diziler yeniden tanıtılır. Bu nedenle, açık bir okuma çerçevesi, mümkün olan tüm hedefleri yarık yeteneğine sahip ve birden fazla seçim mermisi hayatta kalmak için anti-hedeflerin herhangi birini yarık mümkün bir enzim kodlamak gerekir. Protokolün her yinelemesinde antiselection hedefini yeniden başlatma gereksiniminin iki sıralı PCR uyguladığına dikkat edin. İlk PCR anti-hedef dışında anneals bir astar kullanır, böylece anti-hedef bölünmesi PCR reaksiyonu önler. İkinci PCR, anti-hedefin ötesine ulaşan bir astar gerektirir ve birden fazla seçim turunda her açık okuma çerçevesinin hedef karşıtı tüm varyantlara karşı test edildiğinden emin olmak için anti-hedefi yeniden tanıtır.

Yapışkan uçlar üreten enzimler için, REase ORF^10'un izolasyonu için daha önce tanımlanmış bir yönteme dayalı ilgili bir alternatif protokol kullanılabilir. Deneylerimizde kullanılan biotin yakalama ile inaktif varyantların tükenmesi, uyumlu bağdaştırıcının seçici bir PCR'de astar bağlama sitesi olarak kullanılan bir dizi ile bağlanması ile alternatif protokolde değiştirilir (Şekil 9). Sadece seçilen özgüllükte enzim üreten ESC'ler ligasyon alabilen uçlar üretirler ve bu nedenle seçilir. Sayaç eselected dizisinin yapışkan uç sırası adaptörleri ile ligasyon katılamaz şekilde tasarlanmalıdır. Seçim sürecinin yinelemesi, seçici PCR'de iki farklı bağdaştırıcı ve dolayısıyla iki farklı ters astar arasında geçiş yaparak kolayca elde edilebilir.

Yeni protokollerle bile, in vitro'da yeni özellikleri netme görevi hala çok zordur. Tipik tip II REases için, dizi özgüllüğü ve endonükleolitik aktivite aynı protein bölgelerine bağlıdır. Bu nedenle diğerini etkilemeden birini değiştirmek zordur. Başarı, enzimin ayak izini dikkate alan, protein-DNA etkileşimlerinin simetrisine saygı gösteren ve NlaIV örnek^8'deolduğu gibi biyokimyasal deneylerde önceden belirlenmesi gereken önceden var olan enzimatik tercihler üzerine inşa edilen bir strateji yle daha olası hale getirilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1000 > CPG Desteği (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Jel Ekstraksiyon Kiti	Thermo Scientific	K0691	Başka herhangi bir kit kullanılabilir
Glen-Pak DNA saflaştırma kartuşu	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nikel Afinite Jeli	Sigma	P6611
pET 28a vektörü			Bunun yerine, klonlama bölgesinin yukarısında T7 promotörü olan başka herhangi bir vektör kullanılabilir
Phusion High-Fidelity DNA Polimeraz	Thermo Scientific	F530S	Bunun yerine başka herhangi bir yüksek kaliteli ve yüksek işlemsel termofilik polimearse kullanılabilir
Gözenekli çelik folyo	Biosset	40-063
Hızlı Çeviri Sistemi RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Kısıtlama endonükleazları	Thermo Scientific		Açıkçası diğer satıcılar, enzimler kullanılabilir
Streptavidin Manyetik Boncuklar	New England Biolabs	S1420S	Diğer satıcılar da kullanılabilir. Fosforamid
dahil olmak üzere Sigma Sentez kimyasallarından	Carl Roth		Diğer satıcılar da kullanılabilir
Sentez sütunları (farklı boyutlarda)	Biosset
T4 DNA ligaz	Thermo Scientific	EL0011	Başka herhangi bir ligaz kullanılabilir