Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Diş innervasyonu dişlerin basınç, sıcaklık ve iltihabı algılamasını sağlar, bunların hepsi diş organının kullanımı ve bakımı için çok önemlidir. Diş çürükleri ve travma ile ilişkili diş ağrısı hissedilmemesi hastalığın ilerlemesine yol açar. Böylece, uygun innervasyon normal diş büyümesi, fonksiyon ve bakım için bir gerekliliktir.

Çoğu organ tamamen işlevsel ve doğum zamanı ile innerve iken, diş gelişimi yetişkin yaşam içine uzanır, diş innervasyonu ve mineralizasyon sonrası aşamalarında meydana gelen ile^1,2. İlginçtir, diş hamuru (DP) mezenchyme başlangıçta gelişmekte olan diş organıiçine akson girişini önlemek için embriyogenez sırasında itici sinyalleri salgılar, hangi daha sonra diş patlaması yakın olarak çekici faktörlerin salgısına geçer^3,4. Doğum sonrası evrelerde, trigeminal (TG) sinirinden gelen afferent aksonlar, dentin birikiminin başladığı zaman dişin içine ve her zamanına nüfuz eder (Pagella, P. ve ark.^5'tegözden geçirilir). Vivo çalışmalarda çeşitli nöronal-mezenkimal etkileşimler farelerde diş innervasyonu kılavuzu göstermiştir (Luukko gözden, K. ve^{ark. 6),}ama moleküler mekanizmaların birkaç ayrıntı mevcuttur.

Hücre ortak kültürleri, araştırmacıların nöronal ve mezenkimal popülasyonlar arasındaki etkileşimleri manipüle edebildiği kontrollü ortamlar sağlar. Ortak kültür deneyleri, diş innervasyonu ve gelişimine rehberlik eden sinyal yollarının daha derinlerine dalmamayı mümkün kılar. Ancak, ortak kültürdeki hücreleri incelemek için kullanılan geleneksel yöntemlerin bir çoğu teknik zorluklar sunmaktadır. Örneğin, neurite büyüme kristal mor boyama non-özel TG demet dağılımları dahil Schwann hücreleri leke olabilir, ve nispeten küçük tepkiler ile renk yoğunluğu zirveleri olabilir⁷. Mikroakışkan odaları cazip bir seçenek sunuyoruz, ancak transwellfiltreler 8,⁹ ve sadece DP salgıları nöronal tepkilerin araştırılmasına izin çok daha pahalıdır. Bu sorunları ele almak için, bir protokol geliştirdik: a) DP salgılarına yanıt olarak TG neurite outgrowth kesin boyama ve görüntüleme, b) DP hücreleri ve / veya TG nöronlar genetik modifikasyonbelirli sinyal yollarını araştırmak için, ve c) TG nöronlar tarafından salgılanan faktörlere DP hücre yanıtlarının araştırılması. Bu protokol, bir in vitro co-kültür testin kontrollü ortamında diş innervasyonunun çeşitli özelliklerini tam olarak araştırma olanağı sağlar.

Farelerle yapılan tüm deneyler UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Plaka Hazırlama

NOT: Coverslips, tayın sonundaDP hücrelerini görüntülemek için kullanılabilir. Numune işleme sırasında kontaminasyonu önlemek için steril doku kültürü başlığının dışındaki tüm kuluçka ve durulama basamaklarında plaka kapağının açık olduğundan emin olun.

1. Coverslip hazırlama
   1. Otoklav dairesel kapakları.
   2. Ultra saf suyu kaputun altına süzün.
   3. Kapakları 24 kuyulu bir tabağa aktarın ve her birini 0,1 mg/mL poli-D-lizin 400 μL ile kaplayın.
   4. Coverlips emmek için izin verin, 5 dakika batırılmış, bir rocker üzerinde 12 rpm veya orbital shaker 40-50 rpm. Kontaminasyonu önlemek için kapağın üzerinde olduğundan emin olun.
   5. 12 rpm veya shaker bir rocker üzerinde yaklaşık 5 dakika boyunca filtre ultrasaf su ile kapakları durulayın 50 rpm. Tekrar.
   6. Kapak kapaklarının kaputun altında en az 2 saat kurumasını bekleyin ve plaka kapağı kapalı buharlaşmayı kolaylaştırın. Bu kapaklar 48 saat içinde kullanılmalıdır.
   7. İmmünofloresans için yapılan tayın sonunda coverslips ve proses üzerine tohum DP hücreleri (bölüm 3.3).
2. Kaplama filtreleri
   1. Laminanın 10 μg/mL'ye seyreltilmesi. Seyreltilmiş laminin kaputun altına süzün.
   2. Pipet 450-500 μL 10 μg/mL laminin 24 kuyunun her kuyuiçine.
   3. Transwell filtresini, 3 μm gözenekliliği, laminin çözeltisi ile temas etmesi için bir kuyuya yerleştirin ve 2 saat veya gece boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde bırakın. Filtre gözenekleri, çözeltinin bir kısmının filtrenin hem üst hem de alt kısmını dağıtmasına ve kaplamasına izin vermelidir. Bu filtreler 48 saat içinde kullanılmalı veya 4 °C'de 1 haftaya kadar buzdolabında bekletilmelidir.

2. İsteğe Bağlı Genetik Manipülasyon ile Hücre Kaplaması

1. Fareler: Mezenkimal-nöronal etkileşimleri incelemek için DP hücrelerinin genetik değişimi yapılabilir (ancak gerekli değildir). Önerilen genetik varyasyonlar için bölüm 2.3 ve 2.4'e bakın.
2. DP diseksiyonu, dağılım ve kaplama (Şekil 1)
   NOT: DP diseksiyonu için ultra ince, düz kenarlı forseps kullanın. Ultra ince kenarlar, kullanıcının mineralize yapı ile DP dokusu arasındaki forcep kenarını sıkıştırmasını sağlar.
   1. Hasat P5-P8 fareler. Bu aşamada dişler mineralleşmeli ve kök açık olmalıdır.
   2. Neonatları hipotermi yoluyla, 4 °C'lik buzdolabında ki bir tabağa yerleştirerek, dokunmaya devam edene kadar anestezi edin. Belirlenen tesiste ki Yoğun Bakım Ünitesi prosedürlerine uygun olarak ve kafa kesme ile nötralar.
   3. Her fareden DP toplamak için 50 mL konik tüpte %0,25 tripsin-EDTA'dan oluşan 3-5 mL aliquot hazırlayın. Bu doğum sonrası farelerdiş hamuru sindirimini kolaylaştıracaktır. 10'dan fazla doğum sonrası fareden doku sindiriyorsanız 3 mL'den fazla kullanın.
   4. Ağzı tavana doğru ve boyun tabanı çalışma yüzeyinde düz olacak şekilde tek kullanımlık bir alt lık üzerine baş yerleştirin. Mandibulayı maksilladan ayırmak için testere hareketiyle jilet kullanın.
   5. İsteğe bağlı olarak azı azı nalerine daha kolay erişim sağlamak için dili makasla veya çömleçlerle çıkarın.
   6. Açılan başı steril bir gazlı bez yastığının üzerine bir tabağa yerleştirin ve numuneyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin(Şekil 1D).
   7. İlk azı döşeylerini çevreleyen alveoler kemik dokusunu çıkarın. Submandibular dişler bu noktada tam olarak patlak vermez. Alveolar açılım içine forceps yerleştirin ve ağız bukcal (yanak) veya lingual (dil) tarafına doğru diş uzak doku kızdırmak. Maksiller dişler pozlama ve çıkarılması için diş etrafında yarık tam kaldırılmasını gerektirir.
   8. Submandibular ve maksiller ilk azı döşeylerini (M1s) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren ayrı bir hücre kültür yemeğine yavaşça aktarın.
   9. Tüm M1'ler toplanana kadar 2.2.4-2.2.8'i tekrarlayın. Hasat sırasında buz üzerinde M1s içeren çanak tutun.
   10. Her M1'in dışını çevreleyen Emaye Dış Organını (EOE) çıkarın. Bu alternatif olarak adım 2.2.11 sonra yapılabilir.
   11. Bir set ile M1'i döndürün, böylece tepeler inin ve açık kök açıkta kalır. Dişin alt kısmında oval bir açıklık ve ince bir dentin ve mine tabakası ile kapsüllenmiş opak DP dokusu olacaktır.
   12. Forceps ucu nu kullanarak, mineralize dokunun iç çevresi etrafında forceps bir kol çalıştırarak DP yavaşça gevşetin. DP dokusunu mineralize yapıdan çıkarın ve 1x PBS içeren üçüncü bir tabağa aktarın. EOE'yi zaten ayrılmamışsa çıkarın(Şekil 1E).
   13. 50 mL konik tüpte tüm DP dokusunu %0.25 tripsin-EDTA'ya aktarın. Girdap karışımı ve 10 dakika boyunca 37 ° C ılık su banyosu yer. Bu aynı forceps veya uzun, şişe forceps ile yapılabilir. Doku dağıtmak zor olacak ve her 3-4 dakika girdap gerektirecektir. Tripsin hücre zarlarına zarar verebileceğinden 10 dk trypsinizasyonu geçmeyin.
   14. Steril bir başlık altında, enzimin inaktive etmek için en az 1:1 medya son oranına ısınmış co-kültür medya(Tablo 1)ekleyin. Daha fazla doku dağılımı isteniyorsa daha büyük oranlar kabul edilebilir.
   15. Pipet, DP'yi medyada daha fazla dağıtmak için 10 mL'lik pipetle medyayı birden çok kez yukarı ve aşağı doğru çevirin. Büyük kabarcıklar önlemek için dikkatli olun. Tam dağılım neredeyse doku yapışkan doğası nedeniyle mümkün değildir. Ancak, hücreler bir kez kaplanmış doku dan dışa doğru göç edecek çünkü de gerekli değildir.
   16. Dağılmış DP'nin 1 mL'sini 24 kuyulu doku kültür plakasının her kuyuya aktarımı(Şekil 1F).
3. 1. 
      
   2. 
      
4. 
   

Bu sonuçlar, TG neurite monokültür kontrolüne göre altta yatan primer DP hücrelerinin varlığında TG neurite outgrowth'un arttığını göstermektedir(Şekil 2A,C). Neurite büyüme bazı tas-to-asa değişkenliği vardır. Böylece, bir TG nöron monokültür nörat büyüme bazal düzeylerini tespit etmek için bir kontrol olarak tüm tahliller dahil edilmelidir. Ad-Cre-GFP enfeksiyonu ve Ad-eGFP enfeksiyonu eşdeğer sayıda hücre olarak doğrulandıktan sonra bu protokolde Tgfbr2f/f faresinden birincil hücreler kullanılmıştır(Şekil 2D). Ad-eGFP bir kontrol viral vektör olarak görev yaptı. Ad-Cre-GFP, yarı kantitatif PCR(Şekil 2E)ile gösterildiği gibi yanlı gen Tgfbr2'yi sildi. Transforming büyüme faktörü beta reseptörü 2 (Tgfbr2) deletion olan kültürlerde, neurite outgrowth azaltıldı(Şekil 2A-C).

Thy1-YFP fare TG nöronlarını kullandık ve şekil 2'degösterildiği gibi, bu arka planın çok üzerinde aksonal yapıların çok spesifik ve parlak görüntülerini üreten bir anti-GFP antikorile boyandı. Bu kristal menekşe7gibi daha önce bildirilen yöntemler kullanarak non-nöronal hücrelerin non-spesifik boyama olmadan nöronal belirteçlerin özel boyama izin verdi. Filtrelerdeki büyük gözenekler otofloresan ve/veya ikincil antikorlar birikebilir ve aksonal görüntüleme hassasiyetini azaltabilir(Şekil 3). İmmünofloresans ile Thy1-YFP nöronlar büyük ölçüde görüntüleme geliştirir iken, daha fazla arka plan otomatik eşik yazılımı ile kaldırılabilir ve daha sonra sayısal. Ayrıca, ilk bulgularımıza (gösterilmez) ve thy1-YFP fareler mevcut değilse diğer8,9'a dayanarak Neurofilament 200 için immünororesans gerçekleştirmenizi öneririz.

Şekil 1: Eş kültür için hücre elde etmek için fare diseksiyonu şeması. (A) Fare kafatasını açmak ve son tasvirde siyah olarak gösterilen TG sinirlerini bulmak için kesilecek yerin diyagramı. Makas noktalı çizgiler boyunca kesmek için makas uçları eklemek için nerede gösterir. (B) Thy1-YFP+ TG sinirlerini beyaz daire içine alan birleşik bir darkfield ve GFP görüntüsü. (C) Diseksiyonlu TG gangliyonu, F'degösterildiği gibi dağılabilir ve kültürlenebilir. (D) P7 farenin çene kemiği, sol tarafta mandibula tutan pofiller ve dilin her iki tarafında patlamamış dişler içeren alveoler kemik sırtları. (E) DP doku (daire içinde) mineralize yapı (üst) çıkarılan ve emaye dış epitel (alt) bir doku kültürü tedavi plaka içinde dağıtmak ve plaka kaldırıldı, Fgösterildiği gibi . Görüntüler ölçeklendirilecek şekilde gösterilmez. DP hücreleri dağıtıldı ve TG nöronlar eklemeden önce biraraya büyüdü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ortak kültürden temsil sonuçları. (A-C) Thy1-YFP TG nöronlar transwell filtrelerinde primer Tgfbr2f/f DP hücrelerinin üzerine 3 m gözenek ile kültürlendi. YFP proteini için nöronal yapıların tüm filtre üzerinde son derece spesifik boyanmasını sağlamak için anti-GFP antikor kullanılarak immünofloresan boyama yapıldı. 10x'te 100 m z-stack konfokal mikroskopi görüntülerinin maksimum projeksiyonları toplanmış ve dikiş yazılımı ile dikilmiştir. TG nöronlar dp hücreleri ile birlikte kültür(A)zaman tek başına kültürlü daha önemli ölçüde daha fazla büyüme gösterdi(C). Nöronların Ad-Cre-GFP ile enfekte DP hücreleri ile birlikte Tgfbr2 (B)yıkmak için enfekte olduğunda Neurite outgrowth indüklenen değildi . Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Ad-eGFP ve Ad-Cre-GFP ile enfekte hücrelerin eşdeğer sayıları (D)gösterilir. Ölçek çubuğu = 125 μm. Yarı kantitatif PCR Tgfbr2 KD doğruladı (E). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Afferent görüntülemede sunulan teknik güçlükler. (A) Hücre popülasyonlarının kristal mor boyama sonra transwell filtrelerin Brightfield görüntüleme. Büyük gözenekler yaygındır. Büyük ok mezenkimal morfolojisi sergileyen bir hücreye işaret ederken, küçük ok nöronal morfolojinin bir hücresini işaret ediyor. Kristal menekşe önyargısız her iki hücrelekeli. (B) Β3 tubulin in inİmfüorescent boyama bir Alexa-488 ikincil antikor ile birden fazla hücrede non-spesifik boyama gösterdi, afferent yapıların görüntüleme zor hale. Görüntüler temsilidir ve Şekil 2'degösterilen görüntülemeyi optimize etmek için birden fazla tahlil üzerinde tekrarlanır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Ortak kültür medyası.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.