Method Article

Akış Sitometrisinin Kullanılmasında Eritrosit Kompleman Reseptörü 1 Ölçümü

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin amacı, eritrosit CR1 yoğunluğu bilinen üç denek ile karşılaştırarak herhangi bir deneğin eritrositlerinde CR1 yoğunluğunu belirlemektir. Yöntem, deneklerin eritrositlerinin phycoerythrin (PE) kullanılarak güçlendirilmiş bir sisteme bağlı bir anti-CR1 monoklonal antikor ile immünoboya dan sonra akış sitometrisini kullanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (CD35, C3b/C4b için Kompleman Reseptör tip 1) aktivasyonu tamamlayan, bağışıklık komplekslerini taşıyan ve humoral ve hücresel immün yanıtlara katılan yaklaşık 200 kDa'lık yüksek molekül ağırlıklı membran glikoproteindir. CR1 eritrositler de dahil olmak üzere birçok hücre tipinin yüzeyinde bulunur ve uzunluk, yapı (Knops veya KN, kan grubu) ve yoğunluk polimorfizmleri sergiler. Eritrosit başına CR1 (CR1/E) başına ortalama yoğunluk eritrosit başına 500 moleküldür. Bu yoğunluk bir bireyden diğerine (100-1.200 CR1/E) ve aynı bireyde bir eritrositten diğerine değişir. Burada cr1/E'nin yoğunluğunu ölçmek için sağlam bir akış sitometrisi yöntemi sitometri sitometri sitometri sitometri sitometri sitometrisi, düşük yoğunluklu olarak ifade eden denekler de dahil olmak üzere, güçlendirici bir immünboyama sistemi yardımıyla sitometri yöntemi ni sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometri sitometrisi sitometrisi sitometrisi sitometris Bu yöntem, Alzheimer hastalığı (AD), sistemik lupus eritematosus (SLE), AIDS veya sıtma gibi hastalıklarda CR1 eritrosit ekspresyonunun alçaltıcılığını göstermemizi sağlamıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (kompleman reseptör tip 1, CD35) eritrositler1,B lenfositler2, monosit hücreler, bazı T hücreleri, foliküler dendritik hücreler3, fetal astrositler4ve glomerüler podositler5gibi birçok hücre tipinin yüzeyinde bulunan 200 kDa transmembran glikoproteindir. CR1 onun ligands C3b müdahale, C4b, C3bi6,7,8,9, ilk kompleman bileşeni bir alt birim, C1q10 ve MBL (mannan bağlayıcı lektin)1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kanı toplama ve işleme protokolü bölgesel etik komitesi (CPP Est II) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve protokol numarası 2011-A00594-37'dir. Aşağıdaki protokolinsan kanının işlenmesini açıkladığı için, biyolojik tehlikeli maddelerin atılması na yönelik kurumsal kurallara uyulmalıdır. Laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi laboratuvar güvenlik ekipmanları giyilmelidir.

1. Eritrosit yıkama

NOT: İşlemden bir gün önce, büyükbaş hayvan serum albumininin (BSA) %0,15'ini içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir PBS-BSA tamponu hazırlayın ve 4 °C'de buzdolabına koyun. Bu tampon bir yıkama tamponve se....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 yoğunluğu bilinen üç deneğin eritrositleri ("düşük" özne [180 CR1/E], "orta" konu [646 CR1/E], ve "yüksek" konu [966 CR1/E]) ve CR1 yoğunluğu nun belirlenmesi gereken iki deneğin eritrositleri, fikotorin flukromoru kullanarak bir anti-CR1 antikor ile birleştirilmiş bir anti-CR1 antikor ile immünosiye edildi. Başlangıçta, düşük-yüksek aralıktaki deneklerin CR1 yoğunluğu radiolabeled antikorlar kullanılarak Scatchard yöntemi29 ile belirlendi. Belirlenen standartlar (düşük, orta ve yüksek) bir ka.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eritrosit CR1 (CR1/E) yoğunluğunu belirlemek için çeşitli teknikler mevcuttur. Kullanılan ilk teknikler anti-CR1 antikorları31 ile kırmızı kan hücrelerinin agglutinasyonu ve C3b32ile kaplanmış eritrosit varlığında rozet oluşumudur. Bu temel teknikler hızla radiolabeled anti-CR1 antikorlar kullanılarak immünboyama yöntemleri ile değiştirildi1,33. Ayrıca enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA)34

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PROTOKOLÜn optimizasyonuna ve doğrulanmasına katkıda bulunan TÜM URCACyt üyelerine, akış sitometri teknik platformuna, İmmünoloji Anabilim Dalı personeline ve İç Hastalıkları ve Geriatri Anabilim Dalı personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Reims Üniversitesi Hastaneleri (hibe numarası AOL11UF9156) tarafından finanse edilmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Bariyer UcuThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Fransa2079Enumune pipetleme
1-100 & mikro; L Eğimli, filtre ucuStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AlmanyaS1120-1840numune pipetleme
Biyotinile anti-CR1 monoklonal antikor (J3D3)Ticari olmayan monoklonal antikorun evde üretimi, Dr J. Cook'unboyama
Bluzkoruması
Bovin serum albümini (%7,5)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Fransa15260037sitometri
SantrifüjThermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Fransa11176917santrifüjleme
Temiz ÇözeltiBD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa340345sitometrisi
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Praf
Sitometresi Kurulumu ve İzleme Boncukları KitiBD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa655051sitometri
Formaldehit çözeltisi %36,5Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FransaF8775-25MLFiksasyon
10 & mikro; L Mezun, filtre ucuStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AlmanyaS1121-3810numune pipetleme
LSRFORTESSA Akış SitometresiBD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa647788sitometrisi
Microman Kılcal PistonlarDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494numune pipetleme
Micronic 1.40 mL yuvarlak tabanlı tüplerDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051karışımı
Mikropipet Microman - M25 tipi -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379numune pipetlemesi
Fosfat tamponlu Salin (PBS)Thermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Fransa10010031sitometrisi
Pipet PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952numune pipetleme
tozsuz Nitril Muayenesi eldivenlerMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, ABD486802numune koruması
Referans 2 pipet, 0,5-10 ve mikro; LEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4920000024numune pipetleme
Referans 2 pipet, 20-100 ve mikro; LEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4920000059numune pipetleme
Referans 2 pipet, 100-1000 ve mikro; LEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4920000083numune pipetleme
Durulama ÇözeltisiBD, F-38801 Le Pont de Claix, Fransa340346sitometrisi
Yuvarlak tabanlı tüpSarstedt, F-70150 Marnay, Fransa55.1579sitometri
Güvenli Kilitli Tüpler, 1.5 mLEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa0030120086karışımı
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FransaAS-60669immün boyama
Konik Santrifüj Tüpleri 50 mLThermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Fransa10203001karışımı
Vektör anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FransaBA-0500immün boyama
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemya, NY 111716, ABDSI-0236karışımı
izniyle immün

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Erythrocyte Complement Receptor 1Flow Cytometry AnalysisCR1 Density MeasurementImmunostaining ProtocolAntibody Amplification SystemBlood Cell PreparationFluorescence DetectionReceptor QuantificationDisease Biomarker AnalysisCell Surface Markers

Related Articles