Yöntem makalesi

Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

DOI:

10.3791/60812

⸱

2 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Alcon Vision, LLC, 2Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, farklı yapay gözyaşı formülasyonlarının bir in vitro model kullanarak insan kornea epitel hücrelerinin desiccation'dan korunup korunamayacağı değerlendirmedir. Yapay gözyaşı formülasyonlarına ve desiccation maruz kaldıktan sonra, insan kornea epitel hücreleri metabolik aktivite için değerlendirilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapay lipid içeren gözyaşı formülasyonları, eksik bir gözyaşı lipit tabakasının restorasyonu ile gözyaşı buharlaşmasını azaltmak için geliştirilmiştir. Hücrenin yok olmasını önleyen yapay gözyaşı formülasyonları, oküler yüzeyin korunmasına ve hücre metabolik aktivitesinin korunmasına neden olacaktır. Dehidratasyon sırasında, hücreler metabolik aktivite kaybı ve daha sonra hücre ölümü sürecinden geçer. Bu çalışma, yapay gözyaşı formülasyonlarının etkinliğini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Metabolik boya (yani alamarBlue), düşük floresan molekül resazurin'den canlı hücrelerde floresan molekül rezorufin'e dönüşür. Yapay gözyaşı formülasyonunun biyolojik performansı, formülasyonun (a) hücre canlılığını koruma ve (b) desiccation'a karşı hücre koruması sağlama yeteneği olarak ölçülür. Büyüme ortamı ve salin hücre canlılığı/tahliye testleri için kontrol olarak kullanılır. Hücreler 30 dakika boyunca test çözümleriyle inkübe edilir ve daha sonra 37 °C'de 0 veya 5 dakika ve% 45 bağıl nemde kurur. İlk maruziyet ve hücre çıkışından sonra hücre metabolik aktivitesi daha sonra belirlenir. Sonuçlar, göz damlası formülasyonlarının hücre metabolik aktivitesi ve desiccation koruması üzerindeki karşılaştırmalı etkilerini göstermektedir. Bu yöntem, buharlaştırıcı kuru göz ile bireyleri tedavi etmek için tasarlanmış kuru göz formülasyonlarını test etmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilite, pH, ozmolarite ve etkinliği korumak için çok doz oftalmik çözeltilerde birçok farklı bileşene ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, oküler çözeltilerdeki koruyucular veya yüzey aktif maddeler gibi bazı kimyasallar kornea epiteline zarar verebilir1,2. Oftalmik formülasyonlarda bu çeşitli bileşenlerin neden olduğu potansiyel hasarı değerlendirmek için insan kornea epitel hücreleri (HCEC) kullanılarak hücre canlılığı testleri yapılabilir. Hücre hasarını değerlendirmek için özellikle yararlı olan in vitro tahlillerden biri alamarBlue tahlil3. Bu testte, metabolik boya (yani alamarBlue), hücre canlılık göstergesi olarak işlev gören resazurin içerir. Hücresel solunum sırasında, resazurin elektronları kabul 4 kabullarakrezorufin'e düşürülür. Rezorufin azalması, floresan olmayan bir molekülden spektrofluorometre5kullanılarak tespit edilebilen floresan moleküle bir değişikliğe neden olur.

Bu araştırmada, kuru göz ürünlerinin bir in vitro modelde nasıl performans gösterebileceğini belirlemek için kornea epitel hücrelerinin iki farklı tedavisi gerçekleştirilir. İlk değerlendirmede, hücreler bu ürünlerle 30 dakika boyunca tedavi edilir. Tedaviden sonra, hücreler kuru göz ürünlerine maruz kaldıktan hemen sonra ve iyileşme zaman aralığından sonra metabolik aktivite açısından değerlendirilir. Bu değerlendirme, bu ürünlerin bir nem odasında kurutulmasından önce hücreler üzerindeki etkisini belirler. Bu çözeltilerdeki çözelti koruyucuları, yüzey aktif maddelerini veya tamponları metabolik boya kullanılarak tespit edilebilen hücreler üzerinde bazı sitotoksik etkilere sahip olabilir.

İkinci değerlendirme, kuru göz ürünlerine maruz kalma ve kuruma sonrası hücrelerin metabolik aktivitesini belirler. Bu değerlendirmede, ürün tedavisi hücrelere desiccation hasarına karşı koruma sağlarsa, hücrelerin metabolik aktivitesi korunacaktır. Kuru göz ürünü hücreleri lipitlerle kaplayabilirse veya ürün hücrelere nem ekleyerek çevredeki sıvıyı emebilirse, kurumuş meydana gelen zararlı etkilerden hücre koruması oluşabilir.

Bu protokol, hücreler üzerindeki ciddi çevresel stres koşullarını simüle etmek için tasarlanmıştır. Diğer çalışmalar bu dış stresi oluşturmak için çeşitli modeller kullanmıştır. Bazı çalışmalar laminar akış davlumbazlarındaki hücreleri kurutmuş6,7,8, diğerleri oda sıcaklığı ve çeşitli bağıl nem (RH) değerlerini 9 ,10,11kullanmıştır. Kuru göz koşullarını simüle etmenin bir yöntemi, inkübasyon çözeltisinin ozmolaritesini arttırmaktır12,13. Olumsuz çevresel koşulları simüle etmek için bir başka in vitro yöntem, kuru göz hastalarının gözyaşı sıvısını simüle etmek için hücre ortamına sitokin eklemektir14. Bu testler kimyasalların ozmotik stresi nasıl azalttığını veya bağışıklık sistemini nasıl uyardığını değerlendirebilen ilginç modeller olsa da, bu modeller kimyasal formülasyonların hücreleri desiccation stresinden nasıl koruyabileceğini doğrudan göstermez.

Tahliye modeli 37 °C ve%45 RH sıcaklık/nem odası kullanır. Oküler yüzeyden buharlaşmaya neden olabilecek çevresel koşulları simüle eder. 15 uçak kabinlerinde veya16 kış aylarında kapalı ortamlarda bulunan düşük nem gibi diğer aşırı çevresel koşulların simülasyonları da bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Hücre kültürü modellemesi, desiccation stresinin insan korneası üzerindeki etkisini simüle etmek için kullanılır. Hücre stresini tespit etmek için hücre sağlığı üzerindeki etkiyi belirlemek için hücre canlılığı testi yapılır. Strese olup olmadıklarını belirlemek için hücreler üzerinde birkaç farklı fizyolojik test yapılabilir17. Bu test prosedüründe yapılan analizde piyasada bulunan metabolik boya ( Malzeme Tablosu ) sunusunulmuştur. Toksik olmadığı, büyüme ortamlarında çözünür olduğu ve hücre fiksasyonu olmayan hücreleri değerlendirebileceği için diğer birçok hücre stres testinde avantaja sahiptir18. Bu prosedürde hücreler her tedaviden hemen sonra metabolik aktivite için test edilir ve ikinci bir hücre kümesi büyüme ortamına geri yerleştirilir ve 18 h iyileşmeden sonra değerlendirilir. Bir iyileşme döneminden hemen sonra ve sonra test etmenin nedeni, metabolik aktivite üzerinde acil etkilere neden olan hücre hasarını ve gecikmiş etkilere neden olan hücre hasarını tanımlamaktır. Ayrıca, bu formülasyonların kısa vadeli ve uzun vadeli hasar üzerindeki etkisini ve formülasyonların ilk hakaretten kurtulma /kurtarmama yeteneğini değerlendirme fırsatı sağlar.

Bu araştırma, çeşitli lipid içeren kuru göz ürünlerini HCEC metabolik aktivitesi üzerindeki etkileri için ve kurutma olmadan karşılaştırmak için kullanılır. Test edilen kuru göz ürünlerindeki bileşenler Malzeme Tablosundaaçıklanmıştır. Çözelti #1 bileşenler karboksimetilselüloz sodyum (%0,5), gliserin (%1) ve polisorbat 80 (%0,5), çözelti #2 hafif mineral yağdır (%1,0) ve mineral yağ (%4,5) ve çözelti #3 lipid mineral yağ ve propilen glikol demulcent' tir. Bu lipitler, HCEC'nin tahliyeye karşı korunmasını sağlaması beklenen formülasyon bileşenleridir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İnsan kornea epitel hücre kültürü

  1. Ölümsüzleştirilmiş HCEC19'u, Dulbecco'nun modifiye Kartal orta/besin karışımıF-12'nin (DMEM/F12) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren 20 mL'si % 5 CO2ile kollajen kaplı 75 cm 2 şişelerde büyütün.
    NOT: Titreme gerekli değildir.
  2. Ortamı her 2−3 günde bir değiştirin.

2. Hücrelerin test için hazırlanması

  1. Hücreler neredeyse birleştiğinde kültür medyasını kaldırın.
  2. Her 75 cm2 şişeye 4−6 mL hücre ilişkilendirme çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrılana kadar (yaklaşık 20−30 dk) hücreleri 37 °C'de kuluçkaya yatırarak mikroskop altında periyodik olarak kontrol edin.
  3. Her 75 cm 2 şişeye %10 FBS içeren 2−6 mL DMEM/F12 ekleyin.
  4. Şişenin içeriğini 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  5. Hücreleri 5 dakika boyunca 450−500 x g'da santrifüj edin. Üstnatantı borulayın ve önceden ısıtılmış ortamlardaki hücreleri yeniden biriktirin.
  6. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Toplam 1 x 105 hücre içeren ortam hacmini hesaplayın.
  7. 48 kuyu kolajen-1 kaplamalı kültür plakasının her kuyusuna 1 x 105 hücre ekleyin. Kuyuya yeterli medya ekleyin, böylece kuyudaki son medya hacmi% 10 FBS ile 0,5 mL kültür DMEM / F12 olur.
    NOT: Yapay gözyaşı formülasyonu, HCEC'nin metabolik aktivitesinde bir azalma ile ölçülebilen sitotoksikliğe neden olabilir. Verilerin tutarlılığı, tohumlama yaparken her kuyuya aynı sayıda HCEC eklenmesine bağlıdır. 48 kuyu plakası için önerilen kültür konsantrasyonu 1 x 105. Memeli hücreleri resüsüre edildikten sonra santrifüj tüpüne yerleşebildiğinden, hücre süspansiyonunun HCEC'ye eşit şekilde dağıtılması için plakaları hücrelerle tohumlarken sık sık ajitasyonla hücrelerin yeniden kullanılması önerilir.
  8. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 24 saat kuluçkaya yatırın.

3. Hiçbir tahliye protokolü

  1. Kontrol prosedürü
    1. 24 saat inkübasyondan sonra kültür medyasını plakadan çıkarın.
    2. Hemen 150 μL test formülasyonu ve ortam kontrol çözümü ile tedavi edin.
    3. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Test çözümlerini hücrelerden kaldırın.
    5. Metabolik aktiviteyi test etmek için 0.5 mL% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 4 saat daha kuluçkaya yatır ve %5 CO2.
    6. 4 saat kuluçka süresinden sonra, her kuyudan 100 μL metabolik boya çözeltisini çıkarın ve her 100 μL'yi 96 kuyu plakasının kuyusuna yerleştirin.
    7. Floresan plaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak herkuyunun floresanını ölçün. Heyecan dalga boyunu 540 nm ve emisyon dalga boyunu 590 nm olarak ayarlayın.
  2. Ayırma protokolü yok (kurtarma prosedürü)
    1. 3.1.1−3.1.4 adımlarını yineleyin.
    2. Her kuyuya 0,5 mL DMEM/F12 ortam ekleyin.
    3. 37 °C'de 18 saat ve %5 CO2için bir kültür setini kuluçkaya yatırın.
    4. Ortamı çıkarın ve% 10 metabolik boya çözeltisinin 0,5 mL'sini ekleyin. 3.1.6 ve 3.1.7 adımlarını yineleyin.

4. Tahliye protokolü

  1. Kontrol prosedürü
    1. 24 saat inkübasyondan sonra (adım 2.8), kültür medyasını plakadan çıkarın.
    2. Hemen 150 μL test formülasyonu ve ortam kontrol çözümü ile tedavi edin.
    3. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Test çözümlerini hücrelerden kaldırın.
    5. Hücreleri, hücrelerin içini çıkarmak için 5 dakika boyunca 37 °C ve% 45 RH odasına yerleştirin.
    6. Metabolik aktiviteyi test etmek için 0.5 mL% 10 metabolik boya çözeltisi ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 4 saat daha kuluçkaya yatır ve %5 CO2.
    7. 4 saat kuluçka süresinden sonra, her kuyudan 100 μL metabolik boya çözeltisini çıkarın ve her 100 μL'yi 96 kuyu plakasının kuyusuna yerleştirin.
    8. Floresan plaka okuyucu kullanarak her kuyunun floresanını ölçün. Heyecan dalga boyunu 540 nm ve emisyon dalga boyunu 590 nm olarak ayarlayın.
  2. Kurtarma prosedürü
    1. 4.1.1-4.1.5 adımlarını yineleyin.
    2. Her kuyuya 0,5 mL DMEM/F12 ortam ekleyin.
    3. 37 °C'de 18 saat ve %5 CO2için bir kültür setini kuluçkaya yatırın.
    4. Ortamı çıkarın ve% 10 metabolik boya çözeltisinin 0,5 mL'sini ekleyin. 4.1.7 ve 4.1.8 adımlarını yineleyin.

5. Veri analizi

  1. Ortam denetiminin ortalama floresanını hesaplayın. Aşağıdaki formülü kullanarak örneğin yüzde canlılığını hesaplayın:
    Numunenin yüzde yaşayabilirliği = test numunesi floresan/ortam kontrolü floresan x 100
    NOT: Ortam kontrol ortalaması %100 uygulanabilirliktir. Metabolik boya tek başına onunla ilişkili az miktarda floresan vardır. Metabolik boya reaktifinin floresanları, test örneklerinin medya kontrolüne % canlılığını hesaplamadan önce kontrol ve test numunesi floresanından çıkarılabilir.
  2. Denetim ve test örnekleri üzerinde eşit farklılıklar için bir normallik testi ve bir test gerçekleştirin.
  3. Normallik testi geçerse ve farklar eşitse, tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirin. Belirli gruplar arasındaki önemli farkları belirlemek için geçici test sonrası çift yönlü karşılaştırmalar yapın (örneğin, Tukey veya Dunnett'in çoklu karşılaştırma testleri).
  4. Normallik testi geçerse ve farklılıklar farklıysa Welch'in ANOVA'sını gerçekleştirin. Belirli gruplar arasındaki önemli farkları belirlemek için geçici test sonrası çift yönlü karşılaştırmalar yapın (örneğin, Dunnett'in veya Games-Howell çoklu karşılaştırma testleri).
  5. Normallik testi başarısız olursa, nonparametrik bir test kullanın (yani Kruskal-Wallis testi). Belirli gruplar arasındaki önemli farkları belirlemek için geçici test sonrası çift yönlü karşılaştırmalar gerçekleştirin (yani Dunn'ın testi).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç kuru göz formülasyonlarını karşılaştıran bir çalışmanın sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu rakam, üç ürünün, çözüm #1, çözüm #2 ve çözüm #3(Malzeme Masası)HCEC'nin yaşayabilirliği üzerindeki etkisinde farklılıklar olduğunu göstermektedir. Çözüm #1 ve çözüm #2, HCEC'nin ayrılmadan önce metabolik aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Bu, bu ürünlerde HCEC'nin metabolik aktivitesini bozabilecek formülasyon bileşenleri olduğu anlamına gelir. Çözelti #1 maruz kalan hücrelerin 18 saat iyileşmesinden sonra meydana gelen hücre metabolik aktiviteslerindeki ek düşüş, HCEC'nin başlangıçta yaralandığını ve 18 saat sonra yaralanmanın onarılmadığını göstermektedir. Buna karşılık, çözelti #3 HCEC'nin metabolik aktivitesi üzerinde sadece hafif bir etkisi vardı.

Şekil 2,lipit içeren bu kuru göz formülasyonlarının hücre koruması üzerindeki etkisini göstermektedir. 18 saat iyileşme aralığında %0'a yakın HCEC metabolik aktivitesi ile çözelti #1 ve çözelti #2 hücreleri desiccation stresinden korumadı. Ancak çözüm #3, desiccation stresine karşı biraz koruma sundu.

figure-results-1
Şekil 1: Göz kuruluğu lipid geliştirilmiş ürünlerin hücre canlılığı üzerine etkisi. Lipid içeren kuru göz ürünleri ile tedavi sonrası HCEC metabolik aktivitesi ile ölçülen bağıl canlılık. * = çözelti #3 göre istatistiksel anlamlılık (p < 0.05), uygun iyileşme dönemi için ortam kontrolüne göre Δ = istatistiksel anlamlılık (p < 0.05). Çubuğun yüksekliği ortalama değeri temsil eder ve hata çubukları SD'dir. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen burayı tıklatın.

figure-results-2
Şekil 2: Göz kuruluğu gelişmiş ürünlerin kurutma korumasına etkisi. Lipit içeren kuru göz formülasyonlarının hücre korumasına etkisi. Çözüm #1 ve çözüm #2 hücreleri desiccation stresinden korumadı ve zamanla desiccation etkilerinden kurtulamadılar. Buna karşılık, çözüm #3, desiccation stresine karşı biraz koruma sundu. * = p < çözelti #3 göre 0,05 ve uygun iyileşme süresi için tedavi edilmemiş (kontrol) ortama göre Δ = p < 0,05. Çubuğun yüksekliği ortalama değeri temsil eder ve hata çubukları SD'dir. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen burayı tıklatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yapay gözyaşı çözeltilerinin hücre tahliyesine karşı koruyucu etkilerini belirlemek için tasarlanmıştır. Başlangıçta, hücreler hücreleri kaplamak için kuru göz damlalarına maruz kalır. Daha sonra, hücreler kurutulur ve formülasyonların desiccation stresinin zararlı etkilerini azaltıp azaltamayacağı değerlendirmek için metabolik aktivite izlenir. Bu adımlar, kuru göz formülasyonlarının kornea epitel hücrelerinin genel canlılığı üzerindeki genel etkisini anlamak için kritik öneme sahiptir.

Kuru göz formülasyonlarının çoğu kültür kuyularından çıkarıldıktan sonra, hücrelerle temas halinde olan kalan moleküllerin kimyası hücre kurumasını etkileyecektir. Bazı ürünler hücre buharlaşmasını en aza indiren yağların mikro emülsiyonlarını içerir20. Durulamadan sonra sürtünme analizini değerlendiren bir çalışma, kuru göz formülasyonlarının gelişmiş oturma süresinin bir göstergesi olabilecek bazı kuru göz formülasyonları için düşük sürtünmenin bakımını göstermiştir21. Bu tahlilin sınırlamalarından biri, kurutma korumasının diğer göz damlası formülasyonlarına göre değerlendirilebilmesine rağmen, değerlendirilen kısa kuruma süresi nedeniyle bu korumanın süresinin belirlenememesidir. Bu in vitro testte daha uzun kuruma süreleri, bir hücre monolayerinden genel olarak daha fazla nem içeriğine sahip çok katmanlı kültürlerin kullanılmasını gerektirebilir.

Sıcaklık ve nem değerleri değiştirilirse, hücrelerdeki formülasyonlar için özel kuluçka sürelerinin ve kuruma süresinin ayarlanması gerekebilir. Kuru göze katkıda bulunabilecek çevresel stres koşullarını simüle etmek için bir sıcaklık, RH ve hava akışı seçmek zor olabilir, çünkü mevsimsel ve yerel çevre koşulları oldukça değişkendir21. İnsan çalışmaları için modern ortam odaları sıcaklığı 5 °C ile 35 °C arasında, RH ise %5 ile %95 arasında değişebilir22. Bir evaporimetre ve sıkıca takılmış gözlükler kullanılarak, korneadan buharlaşma oranının %40−45 RH'de 0,037 μL/cm2/dkve RH'de %20−25 buharlaşma oranının 0,065 μL/cm2/dk 23olduğu belirlenmiştir. İn vitro model,15,çöl veya kuru iç mekan ortamları16gibi son derece düşük RH koşullarında formülasyonların koruyucu etkisine bakıyorsa, hücrelerden gelişmiş buharlaşma oranlarını karşılamak için kuluçka sürelerinin azaltılması gerekebilir. İnsan gözyaşı sıvısında, gözyaşlarını buharlaşmadan koruyan meibomian ve diğer bezlerden elde edilen çeşitli lipitler bulunur. Bu lipitlerin farklı erime noktaları vardır24. Sıcaklık değişimleri gözyaşı sıvısının akışkanlığını etkileyebilir, bu nedenle ortam sıcaklığında yapılan testler 37 °C'de yapılan testlerden önemli ölçüde farklı buharlaşma oranlarına sahip olabilir. Ortalama oküler yüzey sıcaklık aralığı 32,9 ila 36 °C25olduğundan, testin bu sıcaklık aralığına yakın yapılması önerilir.

Bu protokolde kullanılan metabolik boyaya (alamarBlue) ek olarak, ürün formülasyonlarının hücre metabolik aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilecek başka kimyasal reaktifler de vardır. Tetrazolium tuzları (MTT, XTT, MTS, WST) kullanılabilecek alternatif kimyasallardır. Tetrazolium tuzlarındaki fark, MTT'nin pozitif yüklü bir molekül olmasıdır, böylece canlı hücrelerin sitoplazmını girebilir26. MTT, NAD(P)H27tarafından azaltılmasından sonra çözünmez hale gelir. Bir plaka okuyucusunda emici okumadan önce çözünmelidir. Diğer tetrazolium tuzları negatif yüklü28. Hücreye giremedikleri ve hücre içi moleküllerle doğrudan etkileşime giremedikleri için canlı hücre dışındaki ikincil moleküller tarafından azaltılmalıdırlar29. XTT, MTS ve WST-1 tahlilleri için, bir elektron kavrama ajanının eklenmesi 1-metoksi fenazin metosülfat (PMS) tahlillerin performansını artırabilir30. Tetrazolium tuzları kullanan metabolik testlerin aksine, alamarBlue ek bir çözünür veya elektron kavrama ajanları gerektirmez. Ayrıca, XTT, MTS veya WST-1'in aksine, alamarBlue hücre zarlarına nüfuz eder ve doğrudan hücresel enzimler27,29ile azaltılabilir. AlamarBlue'nun tetrazolium tuzları ile doğrudan karşılaştırılması, alamarBlue'nun HCEC 3,27 ,31,32dahil olmak üzere çeşitli hücre hatlarının metabolik aktivitesini değerlendirmek için daha hassas olduğunugöstermiştir.

Diğer biyokimyasal uç noktalar da insan kornea epitel hücrelerinin deşilerek korunmasını değerlendirmek için düşünülebilir. Floresan boyalar hücre zarı geçirgenliğini ve hücre esteraz aktivitesini tespit etmek için kullanılabilir1. Ayrıca, apoptoz hücre yüzeyinde apoptotik belirteçler için boyama veya kaspaz aktivitesi için ölçüm ile tespit edilebilir1,33. Diğer tahliller oftalmik ürünlerin HCEC sıkı kavşaklar üzerindeki etkilerini belirlemiştir34. Bu tahliller, bu makalede açıklanan tahliye prosedürlerinden yararlanarak gelecekteki değerlendirmelere dahil edilebilir.

Göz kurusunun birçok nedeni vardır. Göz kuruluğu, gözyaşı salgısının azalması, oküler yüzey iltihabının artması veya oküler yüzeyde artan dehidratasyondan kaynaklanabilir. Kurutma koşullarında hücrelerinin kurumasını önleyen kuru göz damlasının buharlaştırıcı kuru göz kullanımı olan bireyler için göz kuruluğu belirtileri hafifletilebilir. Bazı kuru göz formülasyonlarındaki sorunlardan biri de oküler yüzeye zarar verebilecek koruyucuların varlığıdır. Yaralı hücreler, kuru göz hastalarına yardımcı olmaz, çünkü yaralı hücreler kurutma stresine daha duyarlı olduğu için daha fazla hücrenin ölmesine neden olabilir35.

Garrigue ve ark.36 tarafından yapılan yeni bir inceleme makalesi, lipid bazlı ürünlerin buharlaştırıcı kuru gözü hafifletmek için nasıl hareket ettiğine dair mevcut bilginin bir değerlendirmesini sunmaktadır. Lipid eksikliği yırtıklarına lipit eklemek buharlaşmayı önleyebilir, böylece hücrelerin yok olmasını önleyebilir. Ek olarak, humektifler oküler yüzeyde suyu çeken ve tutan moleküllerdir37. Çözelti #1 gliserin ve çözelti #3 propilen glikol humektiflerdir. Çözelti #3, HCEC'nin formülasyon bileşenlerinin lipit ve hümektatif özelliklerinden kaynaklanmış olabilecek daha koruyucu bir etki gösterdi.

Bu protokol, kuru göz formülasyonlarına maruz kaldıktan sonra HCEC'nin metabolik aktivitesini değerlendirmek ve kurum stresini azaltmak için tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan yöntemler kullanılarak, buharlaştırıcı kuru gözden muzdarip insanlar için yeni nonirritating ve koruyucu göz damlaları geliştirilebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç yazar (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) Alcon'un çalışanlarıdır. Alcon bu projenin tek finansman kaynağı ve sponsorudur. Lyndon W. Jones, son 3 yılda aşağıdaki şirketlerden araştırma desteği veya ders onur ödülü almıştır: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass ve Visioneering. Lyndon Jones aynı zamanda Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ve Ophtecs için bir danışman ve/veya danışma kurulunda görev yapmaktadır. Aşağıdaki yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmalara maddi destek sağladığı için Alcon'a teşekkür ediyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
75 cm2 Bacalı ŞişeCorning354485Bu BioCoat marka kollajen kaplı
96 kuyulu plakacostar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Corning 48 Kuyulu plakalarCorning354505Bu BioCoat marka kollajen kaplı
Cytation 5BioTekCYT5MPV280 - 700 nm arasında floresan okuyabilir (540/590 tahlil için)
L-glutamin ve 15 mM ile DMEM / F12 HEPESGibco11039-021Bu ortamda Fenol Kırmızısı yoktur
Fetal Sığır SerumuHyconeSH30396.03
İnsan Kornea Epitel HücreleriOttawa ÜniversitesiYokDr. M. Griffith'ten (Ottawa Göz Araştırma Enstitüsü, Ottawa, Kanada) SV40 ile ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri ve Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA ile karakterize edilmiştir. Hücre hatlarından oluşturulan fonksiyonel insan kornea eşdeğerleri. Bilim. 1999; 286:2169&ndaş;72.
Nem/Sıcaklık Odasıİlişkili Çevre SistemleriLH-1.5Ekonomi Hattı Nem Odası
Penisilin StreptomisinGibco15140-122100X konsantrasyon, bu nedenle her 99 ml ortama 1 ml ekleyin
Refresh Optive Advanced (çözüm #1)Allergan, IncKarboksimetilselüloz Sodyum (% 0.5), Gliserin (% 1), polisorbat 80 (% 0.5), -Yağlayıcılar - Aktif olmayan bileşenler-borik asit; karbomer kopolimer tip A; hint yağı; eritritol; levokarnitin; arıtılmış su; Pürit (stabilize oksikloro kompleksi) ve pH'ı ayarlamak için sodyum hidroksit içerebilir.
XP'yi Yatıştırın (çözüm #2)Bausch & LombHafif mineral yağ (% 1.0), Mineral Yağ (% 4.5) -yumuşatıcılar-Aktif olmayan bileşenler-borik asit, edetat disodyum, okoksinol-40, polikuaterniyum-1 (koruyucu), polisorbat 80, arıtılmış su, sodyum borat dekahidrat. Hidroklorik asit ve/veya sodyum hidroksit içerebilir (pH'ı ayarlamak için).
Systane Complete (çözüm #3)Alcon Inc.Propilen Glikol% 0.6 Yağlayıcı Aktif olmayan bileşenler- borik asit, dimiristoil fosfatidilgliserol, edatate disodyum, hidroksipropil guar, mineral yağ, polioksl 40 stearat, POLYQUAD ve reg; (polikuaterniyum-1) %0.001 koruyucu, sorbitan tristearat, sorbitol ve arıtılmış su. PH'ı ayarlamak için hidroklorik asit ve/veya sodyum hidroksit içerebilir.
TrypLE Express (hücre ayrışma çözümü)Fisher Scientific12605036

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  2. Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
  3. Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
  4. Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
  5. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  6. Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
  7. Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
  8. Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
  9. Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
  10. Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
  11. Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
  12. Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
  13. Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
  14. Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
  15. Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
  16. van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
  17. Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
  18. Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
  19. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  20. Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
  21. Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
  22. Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
  23. McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
  24. Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
  25. Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  27. Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
  28. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  29. Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
  30. Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
  31. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
  32. Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
  33. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716(2015).
  34. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  35. Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
  36. Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
  37. Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metabolik Aktivite AnaliziDesikasyon KorumasAlamarBlue BoyasH cre Canl l TestiKuru G z Form lasyonlarKolajen Kapl PlakalarFloresans l mstatistiksel Analiz

İlgili makaleler