Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Crohn hastalığı inflamatuar barsak hastalığının en çok tanı konulan tipidir. Bağırsakta gelişen kronik inflamasyon peristalsis bozukluğu ve bağırsak mukozası hasarına yol açar ve kolon neoplastik dönüşüm riski ile ilişkili gibi görünüyor. Kanıt birikmesi östrojen ler ve östrojen reseptörleri sadece hormona duyarlı dokuları etkiler gösterir, ama aynı zamanda diğer dokular doğrudan östrojen ile ilgili değil, akciğerler veya kolon gibi. Burada, tnbs kaynaklı Crohn hastalığının bir murine modelinden elde edilen kolonda östrojen reseptörlerinin başarılı immünororesans boyama protokolünü açıklıyoruz. Crohn hastalığının fare ve bağırsak preparatına indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol ve formalin-sabit parafin gömülü bağırsak bölümleri kullanılarak adım adım immünohistokimyasal bir prosedür sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler sadece östrojen reseptör algılama ve in vivo östrojen sinyal araştırma için yararlı değil, aynı zamanda kolit gelişiminde rol olabilir diğer proteinler için uygulanabilir.
Giriş
Crohn hastalığı (CD) kronik bağırsak iltihabı olarak kendini gösteren inflamatuar bir barsak hastalığıdır (IBD). CD etiyolojisi kötü anlaşılmaktadır, ancak cd gelişimi için sorumlu gibi görünen birkaç önemli faktörler vardır, bağırsak mikrobiyota dahil, ve genetik ve çevresel faktörler, diyet veya stres gibi1. Crohn hastalığının patogenezinin daha iyi anlaşılması için, bağırsak iltihabının çeşitli modelleri,2,3,34,5,6,7olarak kullanılmaktadır. Bu makalede, CD'nin 2,4,6-trinitrobenzene sülfonik asit (TNBS) kaynaklı murine modelinden elde edilen sonuçları satıyoruz.
Bu östrojenler kronik bağırsak iltihabı8,9,,10,,11,12modüle yeteneğine sahip olduğu belgelenmiştir. Östrojenlerin biyolojik aktivitesi, aralarında nükleer östrojen reseptörleri (ER), yani ERα (ESR1geni) ve ERβ (ESR2geni) ve G proteinle birleşen östrojen reseptörü, yani GPER (gen GPER1),membrana bağlı ER13,14gibi konjenital reseptörler tarafından aracılık edilir. Östrojen reseptörlerinin düzeyini belirlemek için çeşitli yöntemler vardır, ama sadece birkaç bağırsakta onları görselleştirmek için kullanılabilir.
İmmünohistokimya (IHC), florokrom konjuge antikorları olan hücre veya dokularda bazı antijenlerin saptanması için klinik ve temel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. IHC doku yapısı görselleştirme önemli bir yöntem gibi görünüyor, yanı sıra belirlenmesi ve kolit gelişimini anlamak için çok önemli olabilir belirli proteinlerin lokalizasyonu. Burada, immünoresans kullanarak bağırsakta östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görüntüleme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan çalışmaları, Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB Direktifi ve 22 Eylül 2010 Tarihli Konsey Direktifi ve kurumsal tavsiyeler doğrultusunda Yerel Etik Komitesi'nin (28/ŁB29/2016) onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı ürinen üriner modeli
NOT: Bu protokol, 25-28 g. Ağırlığındaki erkek BALB/C farelerini kullanır. ad libitum
- Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatın. Fareyi kısaca izoflurane ile anesthetize edin (25% O2 O2 akış hızı ile 1.5-2 L/dk).
NOT: Solunum hızı ritmik ve normalden daha yavaş kalmalı ve zararlı bir uyarıcıya yanıt olarak değişmemelidir. - 0.1 mL0 etanol %0.9 NaCl veya 0.1 mL 0 etanol içinde %0.9 NaCl'de %0.9 NaCl'de bir kateter aracılığıyla distal kolona araç kontrolü olarak 4 mg TNBS aşındırın.
NOT: Kateter anüsiçine yaklaşık 3 cm dikkatlice tanıtılmalıdır. - Vücut ağırlığı, rektal kanama, dışkı tutarlılığı ve mortalite gibi klinik parametreler için fareyi ikinci günden sekiz güne kadar her gün izleyin.
- Sekizinci günde, servikal çıkığı ile fareyi ötenazi edin.
Şekil 1: Crohn hastalığının TNBS kaynaklı murine modeli için zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Kolon ayrılması ve makroskopik değerlendirilmesi
NOT: Kolon ayrılmasından bir gün önce, 1 mL fosfat tamponsal salininde (PBS) 100 μL antibiyotik seyreltin ve bir gecede 4 °C'de bırakın.
- % 75 etanol ve steril gazlı bez kullanarak karın üzerinde cilt temizleyin.
- Steril makas ve cımbız kullanarak göğüs kemiğinden anüse karın duvarını kesin.
- Anüs ve çekum mümkün olduğunca yakın kolon kesin.
- Petri kabının üzerine kolon yerleştirin. Çekum ucuna anüs boyunca kolon kesin. Soğuk antibiyotik-PBS çözeltisinde kolonu 2-4 kez temizleyin ve yıkayın.
- Tablo 1'egöre kaliper kullanarak makroskopik değerlendirme yapın.
NOT: Doku yapışması* ve eritem / kanama#, dışkı kan# ve ishal# görsel değerlendirmeye tabidir. * Doku adezyonu üç noktalı bir ölçek kullanılarak değerlendirmek (0: doku adezyonu olmadan kolon, 1: orta doku adezyonu ile kolon, 2: geniş doku adezyonu ile kolon); #yokluğuna göre (0) veya varlığı (1) eritem / kanama, dışkı kan ve ishal.
| Yapışma* | Eritem / kanama# | Dışkı kanı# | İshal# | Ülser uzunluğu | Kolon kalınlığı | Kolon uzunluğu |
| puan (0 - 2) | puan (0 - 1) | puan (0 - 1) | puan (0 - 1) | cm/noktalar | mm/puan | cm/noktalar |
| 0 – yok | 0 – yok | 0 – yok | 0 – yok | 0,5 cm = 0,5 nokta | n mm = n noktaları | 0 – |
| 1 – Orta | 1 – mevcut | 1 – mevcut | 0.5 - hafif/gevşek dışkı | 1 – kontrolden ila daha kısa | ||
| 2 – mevcut | 1 – mevcut | 2 – kontrolden daha kısa |
Tablo 1: Crohn hastalığının TNBS kaynaklı modeli ile farelerin bağırsak makroskopik skorlama.
- Ülserin uzunluğu santimetre olarak bir puan ölçeğine dönüştürülür, yani ülserher 0.5 cm 0.5 nokta olarak sayılır. Bir nokta ölçeğine milimetre kolon kalınlığı dönüştürmek, yani, her n mm n noktalarına karşılık gelir.
- Üç noktalı bir ölçekte santimetre olarak kolon uzunluğu dönüştürün. TNBS'ye bağlı Crohn hastalığı olan her fareden elde edilen kolon uzunluğu, kontrol grubu için ortalama kolon uzunluğuna göre değerlendirilir (0:
- Denkleme göre toplam makroskopik skoru hesaplayın: Toplam makroskopik skor = yapışma (puan) + eritem/kanama (puan) + dışkı kanı (puan) + ishal (puan) + ülser uzunluğu (puan) + kolon kalınlığı (puan) + kolon uzunluğu (puan).
3. Kolon numunesi hazırlama
- 1-2 cm parçalar halinde kolon kesin ve uygun etiketli histolojik kaset sünger her yerleştirin.
NOT: Histolojik kasetler için süngerler sıvı parafin dehidratasyon ve kuluçka sırasında kolon katlanmasını önler. - Kolon parçasını %4 formaldehit ve 4 °C'de en az 24 saat kuluçkaya yatırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TNBS'ye bağlı Crohn hastalığı olan farelerde kolonların makroskopik özellikleri
Kontrolden alınan kolonlar ve TNBS ile tedavi edilen farelerin temsili görüntüleri Şekil 2'degösterilmiştir. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı modeli olan farelerde, kolon genişliği artarken kolon uzunluğu azalır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Genetik, immünolojik veya spontan modeller de dahil olmak üzere IBD patofizyolojisi muayenesi için çok sayıda hayvan modeli, yanı sıra kimyasal olarak indüklenen modeller15vardır. Kolitin çeşitli hayvan modelleri arasında, bu protokolde açıklanan TNBS kaynaklı model gibi kimyasal kaynaklı modeller nispeten ucuz ve elde edilmesi kolaydır. Kolitin TNBS'ye bağlı murine modelinde CD'nin patolojik temeli ile ilgili çeşitli klinik semptomlar vardır. İndüklenen kolit olan hayvanlar tutarsız dışkı oluşumu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Çalışma, Lodz Üniversitesi yetkililerinin mali desteği sayesinde yayınlandı: Bilimsel Araştırmadan Sorumlu Rektör Yardımcısı, Ulusal ve Uluslararası İşbirliğinden Sorumlu Rektör Yardımcısı ve Biyoloji ve Çevre Koruma Fakültesi Dekanı. Damian Jacenik, Polonya Ulusal Bilim Merkezi'nden (2017/24/T/NZ5/00045 ve 2015/17/N/NZ5/00336) hibeler ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hayvanlar | |||
| BALB/C fareler | Lodz Üniversitesi | NA | |
| güçlü>Ekipman | |||
| Kaliper | VWR | 62379-531 | |
| Karton blok | NA | NA | |
| Konfokal mikroskop - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Tam otomatik döner mikrotom - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Cam slayt | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Isıtmalı Parafin Gömme Modülü - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histolojik kutu | Marfour | LN.138747 | |
| Hidrofobik kalem | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratuvar terazisi | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X yazılımı | Leica Biosystems | NA | |
| Metal kalıp | Marfour | CP.5105 | |
| Steril gazlı bez | NA | NA | |
| Steril makas | NA | NA | |
| Steril cımbız | NA | NA | |
| Doku işlemcisi - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| güçlü >Reaktifler< / güçlü > | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzen sülfonik asit | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 ikincil antikoru | Abcam | ab96886 | |
| ER & alfa; birincil antikor | Abcam | ab75635 | |
| ER ve beta; birincil antikor | Abcam | ab3576 | |
| Etanol | Avantor Performans Malzemeleri Polonya | 396480111 | |
| Formaldehit | Avantor Performans Malzemeleri Polonya | 432173111 | |
| GPER birincil antikoru | Abcam | ab39742 | |
| Hidroklorik asit | Avantor Performans Malzemeleri Polonya | 575283421 | |
| Hidrojen peroksidaz | Avantor Performans Malzemeleri Polonya | 885193111 | |
| izofluran (foran) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal keçi serumu | Gibco | 16210064 | |
| Parafin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie çanak | Yuva Bilimsel | 705001 | |
| Fosfat tampon salin | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Fizyolojik tuzlu su | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiyotik) | DAPI ile invitrojen | ant-pm-1 | |
| ProLong Elmas Antifage Mountant DAPI ile (DAPI ile gliserol bazlı sıvı) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodyum klorür | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodyum sitrat | Avantor Performans Malzemeleri Polonya | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performans Malzemeleri Polonya | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ksilen | Avantor Performansı Malzemeler: Polonya | BA0860119 |
Kaynaklar
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
