Method Article

C2C12 Myoblast Hücre Hattında Ki Ekstrasellüler Matriks Proteinlerini Kodlayan Genlerin Kararlı Nakavtı Küçük Saç Tokası (sh)RNA

DOI:

10.3791/60824

⸱

February 12th, 2020

 ,  , 
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C2C12 miyoblastlarında küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak hücre dışı matriks (ECM) proteinlerini kodlayan genleri yere sermek için bir protokol sağlıyoruz. ADAMTSL2'yi örnek olarak hedefleyerek, C2C12 miyoblastı sırasında mRNA, protein ve hücresel düzeydeki nakavt etkinliğinin doğrulanması ve miyotube farklılaşması na yönelik yöntemleri tanımlıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri iskelet kas gelişimi ve homeostaz için çok önemlidir. C2C12 miyoblastlarında ECM proteinleri için kodlayan genlerin kararlı nakavt iskelet kas gelişiminde bu proteinlerin rolünü incelemek için uygulanabilir. Burada, C2C12 hücrelerinde küçük saç tokası (sh) RNA kullanarak ECM proteini ADAMTSL2'yi bir örnek olarak tüketen bir protokol uyguluyoruz. shRNA plazmidlerinin transfeksiyonundan sonra, kararlı hücreler puromisin kullanılarak toplu olarak seçilmiştir. Bu hücre hatlarının bakımını ve mRNA ekspresyonu, protein ekspresyonu ve C2C12 farklılaşması ile testotipik analizini de tanımlıyoruz. Yöntemin avantajları istikrarlı C2C12 knockdown hücrelerinin nispeten hızlı nesil ve hücre kültürü ortamda serum tükenmesi üzerine multinükleli miyotüpler içine C2C12 hücrelerinin güvenilir farklılaşması vardır. C2C12 hücrelerinin farklılaşması parlak alan mikroskobu ile ve MiyoD, miyojenin veya miyozin ağır zincir (MyHC) gibi kanonik marker genlerin ekspresyon düzeyleri ölçülerek, C2C12 miyoblastiasyonunun miyotüplere doğru ilerlemesini gösteren izlenebilir. Küçük interferans (si) RNA ile genlerin geçici nakavt aksine, daha sonra C2C12 farklılaşma sırasında veya myotube olgunlaşma sırasında ifade edilen genler daha verimli shRNA ifade C2C12 hücreleri üreterek hedeflenebilir. Yöntemin sınırlamaları, CRISPR/Cas9'a dayalı gen nakavt stratejileri kullanılarak aşılabilecek spesifik shRNA'ya bağlı olarak nakavt verimliliğindeki değişkenlik ve shRNA'nın göz önünde bulundurulması gereken potansiyel hedef dışı etkileridir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matriks (ECM) proteinleri tüm dokular için yapısal destek sağlar, hücre-hücre iletişimine aracılık eder ve hücre kaderini belirler. Oluşumu ve ECM dinamik remodeling böylece doku ve organ homeostaz korumak için önemlidir1,2. ECM proteinleri için kodlayan çeşitli genlerdeki patolojik varyantlar kas distrofilerinden psödomousküler yapıya kadar çeşitli fenotiplerle kas-iskelet sistemi bozukluklarına yol açar3,4. Örneğin, ADAMTSL2 patojenik varyantları son derece nadir kas-iskelet bozukluğu geleofisik displazi neden, hangi psödomus yapı ile ortaya çıkar, yani, iskelet kas kütlesi belirgin bir artış5. Fare ve insanlarda gen ekspresyonu verileri ile birlikte, bu iskelet kas gelişimi veya homeostaz ADAMTSL2 için bir rol göstermektedir6,7.

Burada tanımladığımız protokol, ADAMTSL2'nin hücre kültürü ortamında iskelet kas gelişimini ve/veya homeostazını modüle etme mekanizmasını incelemek için geliştirilmiştir. Murine C2C12 miyoblast hücre hattında ADAMTSL2'yi yere serptik. C2C12 miyoblastlar ve miyotüpler içine farklılaşma iskelet kas farklılaşması ve iskelet kas biyomühendislik için iyi tanımlanmış ve yaygın olarak kullanılan hücre kültürümodeli8,9. C2C12 hücreleri serum çekilmesinden sonra farklı farklılaşma adımlarından geçerek kültürde 3−10 gün sonra çok çekirdekli miyotüplerin oluşmasına neden olur. Bu farklılaşma adımları, MyoD, miyojenin veya miyozin ağır zincir (MyHC) gibi farklı marker genlerinin mRNA düzeylerinin ölçülmesiyle güvenilir bir şekilde izlenebilir. C2C12 hücrelerinde kararlı gen knockdowns üreten bir avantajı C2C12 farklılaşma sonraki aşamalarında ifade edilen genler daha verimli hedeflenebilir, geçici knockdown ile karşılaştırıldığında (si) RNA, genellikle transfeksiyon sonra 5−7 gün sürer, ve transfeksiyon verimliliği etkilenir. Burada açıklandığı gibi protokolün ikinci bir avantajı puromisin seçimi kullanarak C2C12 knockdown hücrelerinin toplu nispeten hızlı nesil. CRISPR/Cas9 aracılı gen nakavtı veya birincil iskelet kas hücresi öncüllerinin insan veya hedef-gen eksikliği olan farelerden izolasyonu gibi alternatifler teknik olarak daha zorludur veya hasta kas biyopsilerinin veya hedef geni eksik farelerin bulunmasını gerektirir. Ancak, diğer hücre kültürü tabanlı yaklaşımlara benzer şekilde, c2C12 hücrelerinin iskelet kas hücresi farklılaşması için model olarak kullanımında sınırlamalar vardır, hücre kültürü kurulumu nun iki boyutlu (2D) doğası ve farklılaşmamış iskelet kas öncül hücrelerinin korunması için kritik olan in vivo mikroortamın eksikliği10gibi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Escherichia coli shRNA Plazmid DNA hazırlanması

  1. ShRNA plazmidleri taşıyan klonal bakteri kolonilerinin üretimi
    1. Hedefe özgü shRNA plazmidleri taşıyan E. coli gliserol stokları ve ticari kaynaklardan bir kontrol plazmidi elde edin(Malzeme Tablosu).
      NOT: Murine Adamtsl2 mRNA'nın farklı bölgelerini hedef alan üç farklı shRNA plazmid kullanıldı. Bir shRNA 3'-untranslated bölge (3'UTR) Adamtsl2 rekombinant tam uzunlukta ADAMTSL2 veya bireysel ADAMTSL2 protein etki alanları kodlama ifade plazmidler ile kurtarma deneyleri kolaylaştırmak için seçildi. Buna ek olarak, bir şifreli shRNA plazmid negatif kontrol olarak dahil edildi. ShRNA dizilerinin ayrıntıları Şekil 1A'daverilmiştir.
    2. Oda sıcaklığında shRNA bakteriyel gliserol stoku çözültün (RT). 100 μg/mL ampisilin (LB-Amp) ile desteklenen bir Luria-Bertani (LB) agar plakaüzerine bakteriyel gliserol stok10 μL transfer.
      NOT: LB-Amp plakalar 1L LB orta otoklavlama tarafından hazırlanır (1 L: 10 g tripto, maya ekstresi 5 g, NaCl 10 g, 7.0 için pH ayarlamak) birlikte 12 g agar. Orta ~50 °C'ye kadar soğumasını ve ampisilin (stok çözeltisi: steril suda 50 mg/mL) ilave edinve son konsantrasyonu μg/mL (LB-Amp agar). Hemen 10 cm Petri kabına ~ 20 mL LB-Amp agar dökün ve agar kullanmadan önce katılaşmak sağlar. 1 L LB-Amp agar genellikle yaklaşık 40 10 cm Petri yemekleri dökmek için yeterlidir. LB-Amp agar içeren petri kapları, karanlıkta 4 °C'de saklanırsa en az bir ay stabil dir.
    3. Tek bakteri kolonileri elde etmek için steril Drygalski spatula veya başka uygun bir yöntem ile yayılır bakteri. 37 °C'de bir gecede bakteri plakalarını baş aşağı kuluçkaya yatırın.
  2. Plazmid hazırlığı
    1. Ertesi sabah, petri kabını tek tek bakteri kolonileriyle çıkarın ve bakteri kolonilerinin büyümesini ve uydu kolonilerinin oluşumunu önlemek için 4 °C'de saklayın. Bir gece veya daha uzun süre saklanırsa Petri kabını kapatın.
    2. Öğleden sonra, bir polipropilen bakteri kültür tüpü içine LB-Amp orta 5 mL ekleyin. Bir pipet ucu ile bir gecede kültürlenmiş Petri kabından tek bir bakteri kolonisi seçin ve LB-Amp ortamı içeren bakteri kültür tüpünde pipet ucunu çıkararak LB-Amp ortamını aşılayın.
    3. 37 °C'de 250 rpm'de bir çalkalayıcıda bir gecede bakteri kültürünü kuluçkaya yatırın ve kapağı gevşek bir şekilde tıkanarak havalandırmaya izin verin.
    4. Ertesi sabah bakteri kültürü tüpünü çıkarın ve bakteriyel büyümeyi önlemek için 4 °C'de tutun. Öğleden sonra, girdap tarafından bakterileri yeniden askıya ve 250 mL konik bir şişe LB-Amp orta 50 mL gecede bakteri kültürünün 1 mL transfer. 37 °C'de 250 rpm'de bir shaker'da bir gece kuluçkaya yatırın.
    5. Ertesi sabah bakterileri 50 mL'lik tek kullanımlık santrifüj tüpüne ve 15 dk.RT'de 6.000 x g'de santrifüj bakterilere aktarın.
      NOT: Plazmid DNA'sı hemen izole edilemiyorsa, santrifüj adımından sonra LB-Amp ortamını çıkarın ve bakteri peletini -20 °C'de saklayın.
    6. Plazmid hazırlama kiti (midi ölçek) için bakteri plazmid DNA ayıklamak için talimatları izleyin. Plazmid DNA kalitesini spektrofotometre kullanarak A260/A280 oranını ölçerek değerlendirin.
      NOT: A260/A280 oranı >1.8 tercih edilir, plazmid DNA preparatının yüksek saflıkta olduğunu gösterir. Daha düşük A260/A280 oranı protein ile kontaminasyon veya ekstraksiyon reaktiflerinin yetersiz çıkarılmasını göstermektedir. Ek plazmid arınma adımları gerekebilir.

2. C2C12 Hücrelerinin Culturing ve Transfeksiyonu ve Püromisin Seçimi

  1. C2C12 hücre kültürü
    1. 37 °C'lik su banyosunda C2C12 hücrelerini(Malzeme Tablosu)hızlı bir şekilde boşaltın ve hücre kültüründe 100 ünite penisilin ve streptomisin antibiyotikler (serumsuz DMEM) ile birlikte 8 mL Dulbecco modifiye Kartal ortamı (DMEM) içeren steril tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpüne hücreleri dökün. RT'de 160 x g'da 3 dk santrifüj hücreleri.
    2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) (komple DMEM) ile birlikte serumsuz DMEM'in 10 mL'lik hücre pelesini aspire etmek ve resuspend. Hücreleri 10 cm doku kültürüne aktarın plastik tabaklar tedavi edilir. %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka yakan hücreler.
    3. Ertesi gün, ortamı taze tam DMEM ile değiştirin.
    4. 3−4 10 cm'lik tabaklarda düşük geçitli C2C12 hücrelerini genişletin. C2C12 hücreleri %50−60 birleştiğinde orta ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile C2C12 hücrelerini durular.
    5. 1 mL% 0.25 trypsin-EDTA ekleyin ve 2 dakika rt. Bir mikroskop altında hücre ayırma izlemek ve hücrelerin çoğu ayrışana kadar, gerekirse kuluçka süresini uzatmak için inkübat.
      NOT: Dikkatle çanak dokunarak hücreleri yerinden yardımcı olabilir.
    6. Hücrelerin çoğu ayrıldığında, tabağa 10 mL tam DMEM ekleyin, hacmi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetle ve hücre süspansiyonu steril tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpe aktarın. Rt. Aspire supernatant 160 x g 3 dakika için santrifüj hücreleri ve donma ortamının 2 mL hücre pelet resuspend (%10 dimetil sülfoksit [DMSO]/90% FBS).
    7. Cryovials 10 cm çanak başına iki 1 mL aliquots aktarın. -80 °C'lik dondurucuda en az 24 saat RT izopropanol dolu bir hücre dondurucu kabında kuluçkaya yatırın ve buz kristallerinin oluşumunu önlemek için dakikada yaklaşık -1 °C donma hızı elde edin. Hücreleri sıvı nitrojenin buhar fazında uzun süreli kullanım için saklayın.
      NOT: Satıcı, 15 numaralı geçide kadar C2C12 hücreleri kullanılmasını önerir. Yazarların deneyimleri de düşük geçiş sayısı hücrelerinin miyotüplere daha tutarlı ve hızlı bir farklılaşma gösterdiğini göstermiştir. C2C12 hücrelerinin erken farklılaşmanın önlenmesi için düşük hücre yoğunluğunda (<%50 birleşme) tutulması esastır. Farklılaşan veya farklılaştırılmış C2C12 hücreleri orijinal miyoblast durumuna geri döndürülemez ve atılmalıdır.
  2. C2C12 hücrelerinin transfeksiyona hazırlanması
    1. Kültür 10 cm'lik bir kapta farklılaşmamış C2C12 hücreleri %50−60'a ulaşana kadar biraraya geldi. Orta, 10 mL PBS ile C2C12 hücreleri durulayın ve 0.25% trypsin-EDTA 1 mL ekleyin. RT'de 2 dakika kuluçka ya da mikroskop altında hücre ayrıştırmasını izleyin ve gerekirse kuluçka süresini, hücrelerin çoğu ayrılana kadar uzatın.
      NOT: Dikkatle çanak dokunarak hücreleri yerinden yardımcı olabilir.
    2. Hücrelerin çoğu koptuğunda, tabağa 10 mL tam DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonu steril tek kullanımlık 15 mL santrifüj tüpe aktarın. Sentrifüj hücreleri 3 dk 160 x g'de RT. Aspire supernatant ve hücre peletini tam DMEM'in 4 mL'sinde yeniden askıya alın.
    3. 10 μL hücre süspansiyonu ile 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde 10 μL'lik trypan mavisini birleştirin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak ve tepki tüpünü dikkatlice hareket ettirerek karıştırın ve hücreleri sayma slaytına aktarın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını/mL'yi belirleyin.
    4. C2C12 hücrelerini 50.000 hücre/mL'ye seyreltin ve bir gecede kuluçkadan sonra yaklaşık %40−50 biraraya gelmek için 6 kuyu plakasında kuyu başına 100.000 hücre (2 mL) tohumlayın. %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçka yakan hücreler.
  3. Polietilenin (PEI) ve püromisin seçimi kullanılarak shRNA plazmid ile C2C12 hücrelerinin transfeksiyonu
    1. PEI stok çözeltisinin hazırlanması
      1. 50 mL'lik steril distile su (stok çözeltisinin konsantrasyonu: 0.32 mg/mL) içinde 16 mg PEI'yi vida kapağıolan 50 mL cam ortam şişesinde çözün. Çözeltiyi 65 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve çözeltiyi kuluçka süresi boyunca birkaç kez şiddetle girdapatarak PEI'yi tamamen eritin.
      2. 50 mL başına 15 μL 1N HCl ekleyerek pH 8'e ayarlayın.
        DİkKAT: HCl aşındırıcıdır. Konsantre HCl duman kaputu altında ele alınmalıdır. Müfettişler uygun kişisel koruyucu ekipman giymelidir.
      3. PEI çözeltisini -80 °C'de gevşek bir şekilde bağlanmış bir kapakla 1 saat dondurun ve çözünürlüğü daha da artırmak için 37 °C'de su banyosunda hızla çözülün. Donma-çözülme döngüsünü 3x tekrarlayın.
      4. PEI stok çözeltisini -20 °C'de tek seferlik kullanım için 0,5 mL aliquots olarak saklayın.
    2. C2C12 hücrelerinin transfeksiyonu
      1. PEI stok çözeltisinin 25,5 μL'lik (8,5 μL/μg plazmid DNA'sını) 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde 100 μL 25 mM NaCl ile birleştirin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Plazmid DNA'sının 3 μg'ını 100 μL 25 mM NaCl ile birleştirin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. Seyreltilmiş PEI reaktifinin tüm hacmini seyreltilmiş plazmid ile birleştirin ve hafifçe yukarı ve aşağı borular ekleyerek karıştırın. 37 °C'de 25 dk kuluçka.
      3. Kuluçka süresi boyunca, FBS veya antibiyotik olmadan DMEM transfeksiyon için amaçlanan C2C12 hücrelerinin orta değiştirin.
      4. PeI/DNA transfeksiyon karışımını C2C12 hücrelerine ekleyin ve hücre kültürü yemeğini dikkatlice hareket ettirerek sürekli karıştırın. %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. 6 saat sonra dmem tamamlamak için orta değiştirin.
    3. Püromisin seçimi
      1. Transfeksiyondan 24 saat sonra orta ve seçim ortamına geçiş yapın (komple DMEM artı 5 μg/mL puromisin). Puromisin dirençli C2C12 hücreleri elde edilene kadar puromisin seçimine devam edin, bu da genellikle 10−14 gün sürer.
      2. 2.1.4−2.1.7 adımlarında açıklandığı gibi, farklılaşmamış durumu ve 6−10 şişenin kriyokorunu korumak için düşük hücre yoğunluğunda (<50−60% birleşimi) puromisin dirençli C2C12 hücrelerini genişletin.
        NOT: Rutin hücre kültürü ve genişlemesi için 5 μg/mL puromisin varlığında puromisin dirençli C2C12 hücrelerini koruyun. Ancak, püromisin farklılaşma deneylerinde atlandı.

3. C2C12 Farklılaşmasının Henotipik Analizi

NOT: Aşağıda açıklanan yöntemler, Batı lekelemesinde kullanılan spesifik antikorları veya kantitatif polimerazda kullanılan gen spesifik astarları değiştirerek C2C12 miyoblast farklılaşmasının miyotubelara genel henotypik analizi için kolayca uyarlanabilir. zincirleme reaksiyon (qPCR) analizi.

  1. C2C12 farklılaşma protokolü ve brightfield mikroskobu
    1. Tohum 150.000 hücreleri / iyi bir 12 kuyu plaka. Kültür puromisin dirençli C2C12 kararlı hücreler 12 iyi plaka seçim ortamında bir nemlendirilmiş inkübatör 37 °C bir% 5 CO2 atmosferde. Kültür C2C12 hücreleri ~% 95 biraraya ulaşana kadar tam DMEM hücreleri.
    2. C2C12 hücrelerinin farklılaşmasını sağlamak için, tam DMEM'i serumsuz DMEM (gün 0 farklılaşma) ile değiştirin. Her iki günde bir orta yıkın ve kameralı ters parlak alan mikroskobu kullanarak C2C12 miyotube oluşumunu takip edin.
      NOT: Birçok protokol, C2C12 hücrelerini miyotüplere ayırmak için %2 at serumu kullanır. Yazarların elinde, serumun çıkarılması da benzer bir etki yarattı. İnsülin C2C12 farklılaşmasını hızlandırmak için hücre kültürü ortamına bir katkı olarak tanımlanır. Ancak mevcut protokolde C2C12 hücreleri serum yoksunluğu ve insülin eklenmesigereksiz bulunduktan sonraki 3−5 gün içinde güvenilir bir şekilde miyotüplere ayrıldı.
  2. Miyozin ağır zincir (MyHC) immünoboya miyotüpleri görselleştirmek için
    1. Tohum 50.000 puromisin dirençli C2C12 hücreleri oda başına tam DMEM 500 μL bir 8 kuyu odası slayt. Kültür hücreleri tam DMEM 'de %95 biraraya ulaşına kadar (yaklaşık 24 saat).
    2. Farklılaşmayı sağlamak için, tam DMEM'den 500 μL serumsuz DMEM'e (gün 0 farklılaşma) geçin. İstenilen zaman noktasında, orta ve durulama hücreleri 3x pbs 0.5 mL ile aspire.
      NOT: RT'de aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin.
    3. PBS'de seyreltilmiş %4 paraformaldehit (PFA) ile 0,2 mL olan hücreleri 15 dakika boyunca durula.
      DİkKAT: PFA tehlikelidir. Uygun önlemleri alın ve paraformaldehit çözeltisi tehlikeli atık olarak atın.
    4. 5 dk. 0,5 mL PBS 3x pbs 3x her biri için 0,5 mL'lik 0,2 mL glisin ile PFA'yı bastırın.
    5. Hücre zarını permeabilize etmek için PBS'de 0,2 mL%0,1 non-iyonik yüzey aktif/deterjan(Malzeme Tablosu)ile inkübat hücreler. PBS'de 0,2 mL%5 büyükbaş serum albumini 1 h. Durulama hücreleri için 0,5 mL PBS 3x 5 dk için bloke edin.
    6. 0.2 mL MyHC antikor (PBS'de 1:200) olan hücreler için 2 saat. 0,5 mL PBS 3x ile 5 dk boyunca durulama hücreleri için.
    7. 0.2 mL keçi-anti fare rhodamine kırmızı konjuge sekonder antikor (PBS 1:200) ile inkübat hücreleri. 0,5 mL PBS 3x ile hücreleri 5 dk boyunca durula.
    8. Kantitatif PBS çıkardıktan sonra, oda başına 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren montaj ortamı bir damla ekleyin. Üreticinin talimatlarına göre kapak kayma ve kür montaj ortamı. Ojeli fok.
    9. Uygun filtre kümesini kullanarak floresan mikroskobu kullanarak C2C12 hücrelerini gözlemleyin.
  3. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile nakavt verimliliğinin değerlendirilmesi
    1. Kültür C2C12 hücreleri bölüm 3.1'de açıklandığı gibi 12 kuyu plakasında farklılaşma koşulları altında.
    2. İstenilen zaman noktasında, farklılaşma ortamını kaldırın, hücreleri 1 mL PBS ile bir kez durulayın ve kuyu başına 0,5 mL RNA ekstraksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Hücreleri dikkatlice yukarı ve aşağı borular ile lyse ve steril bir 1,5 mL reaksiyon tüpü hücre lysate aktarın. Üreticinin protokolünü dikkatle izleyerek RNA'yı yalıtın.
      DİkKAT: RNA ekstraksiyon reaktifi fenol içerir. Duman kaputunun altında kullanılmalıdır. RNA çıkarma reaktif atıklarını toplayın ve tehlikeli atık olarak atın. Müfettişler uygun kişisel koruyucu ekipman giymelidir.
    3. Son RNA peletini 20 μL dietil pirokarbonat (DEPC) ile işlenmiş suda çözün. RNA hazırlığının miktarını ve kalitesini bir spektrofotometre kullanarak belirleyin ve kalite ölçüsü olarak A260/A280 oranını belirleyin.
      NOT: 12 kuyu plakasının 1 kuyusundan tipik bir verim, 1,8−2 A260/A280 oranıile toplam RNA'nın 5−7 μg'sidir.
    4. Kalıntı kosaflaştırılmış genomik DNA'yı sindirmek için, pcr tüpte toplam 8 μL DEPC ile işlenmiş su hacminde 1 μg RNA seyreltin. 1 μL 10x reaksiyon tamponu ve 1 μL DNase I (1 birim/μL)(Malzeme Tablosu)ekleyin ve RT.'de 15 dakika kuluçkaya yatırın. 1 μL stop çözeltisi (25 mM EDTA) ekleyin ve 70 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. CDNA oluşturmak için, 10 μL DNa tedavi edilmiş RNA'yı ters transkriptaz, rasgele astarlar, 4 mM dNTP karışımı (her dATP, dTTP, dGTP ve dCTP) içeren 10 μL 2x ters transkriptaz ana karışımı ile birleştirin ve ters transkriptaz reaksiyon tamponu oluşturun. Üretici tarafından tavsiye edilen programı kullanarak bir termocycler reaksiyon kuluçka. CDNA'yı 1:5 oranında su ile seyreltin.
    6. QRT-PCR reaksiyonu hazırlamak için, 5 μL SYBR yeşil qPCR ana karışımını sırasıyla 0,5 μL gen-spesifik ileri ve ters astarlarla (stok: 10 μM) ve reaksiyon başına 2 μL DEPC ile işlenmiş su ile birleştirin. Pipet qPCR reaksiyonbir kuyuda 96 iyi qRT-PCR plaka ve seyreltilmiş cDNA 2 μL ekleyin. Her biyolojik çoğaltma için üç teknik çoğaltma ayarlayın ve Gapdh veya Hprt1gibi bir temizlik geni içerir.
    7. Aşağıdaki programı kullanarak pcr-PCR termocycler ile PCR ürününün yükseltin: 2 dk için 50 °C (urasil-DNA glikozilaz [UDG] aktivasyonu), 2 dk için 95 °C (çift kilitli DNA polimeraz aktivasyonu), 15 s için 95 °C 40 °C, 30 s için 60 °C ve 1 dk için 72 °C.
    8. Gapdh veya Hprt1gibi bir temizlik genine normalleşen DDCt yöntemini kullanarak qRT-PCR sonuçlarını ölçün.
  4. Batı lekeleme ile nakavt verimliliğinin değerlendirilmesi
    1. Tohum 300,000 puromisin dirençli C2C12 hücreleri batı leke analizi için 6 iyi plaka iyi başına. 24 saat sonra, farklılaşma (gün 0 farklılaşma) başlatmak için serumsuz DMEM orta değiştirin.
    2. İstenilen zaman noktasında, 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde serumsuz iki mL klimalı ortam ve 5 dakika 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca 5 000 x g'de 5 dakika boyunca ayırılmış hücreleri ve hücre enkazını temizlemek için iki mL serumsuz klimalı ortam toplayın.
      NOT: Bu adım, ancak ecm proteinleri veya şartlı ortamdaki diğer salgılanan proteinler incelenirse gereklidir. İlgi proteini sitoplazmada lokalize ise veya membranbağlıysa, hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücre lisis adımlarını uygulayın (3.4.7−3.4.12). Hücre lisisi, proteolitik bozulmayı ve hücre tabakasının uzun süreli depolanmasının diğer istenmeyen sonuçlarını en aza indirmek için serumsuz koşullu ortamdan gelen protein çökeltmesine paralel olarak yapılmalıdır.
    3. Santrifüjden sonra, 1 mL'lik klimalı ortamı yeni bir 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın ve trikloroasetik asit (TCA) ve iyonik olmayan yüzey aktif madde/deterjan karışımından 0,391 mL ekleyerek proteinleri çökeltin. Kısaca karışımı girdap ve buz üzerinde 10 dakika kuluçka.
      NOT: Protein çökeltme karışımını kullanımdan önce %55 TCA'nın 0,252 mL'si ve 0,139 mL'si 0,139 mL'lik iyonik olmayan yüzey aktif/deterjanı mL'de koşullu ortam ve girdap başına kısaca birleştirerek hazırlayın. Çözüm bulanıklaşır.
      DİkKAT: TCA aşındırıcıdır ve uygun şekilde ele alınmalıdır.
    4. 4 °C'de 10 dk için >16.000 x g çökelmiş proteinlerpelet. Supernatant atın.
      DİkKAT: Süpernatant TCA içerir ve ayrı olarak toplanmalı ve tehlikeli madde olarak imha edilmelidir.
    5. Protein peletini buz gibi aseton ve santrifüj ile her seferinde >16.000 x g'de 10 dakika boyunca 4 °C'de yıkayın.
    6. Protein peletini RT'de 3−4 dakika boyunca hava kurutun ve %5 β-mercaptoetan ile desteklenen %5 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) örnek tampon (50 mM Tris pH 6.8, %2 SDS, %6 gliserol ve %0.004 bromofenol mavisi) 50 μL'lik 1x sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde çözünür. Numuneyi 95 °C'de 5 dk kaynatın ve standart prosedürleri kullanarak istenilen hedef proteini tespit etmek için Batı lekeleme için kullanın.
      DİkKAT: β-Mercaptoethanol kokulu ve toksiktir ve duman kaputunda kullanılmalıdır.
    7. Hücre içi ve membrana bağlı proteinler için hücre tabakasını 2 mL PBS ile bir kez durulayın.
    8. 1 mL PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kuyudan sıyrılarak hücreleri yerinden çıkarın. 4 °C'de 3 dk için 3.420 x g'de 1,5 mL reaksiyon tüpünde ve santrifüjde hücreleri toplayın. Hücre peletini 3 x 1 mL PBS ve santrifüj 3.420 x g'de 3 dk 4 °C'de yıkayın.
    9. Hücreleri lyse için, 0.2 mL lysis tampon (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, %1 NP40, %1 sodyum deoksikofat, 2,5 mM sodyum pirofosfat, 1 mM β-glisofosfat ve 1 mM sodyum ortonovaat) 1x EDTA içermeyen proteeaseor kokteyl reaktifi ve inkübate ile birlikte 30 dk buz üzerinde.
    10. Ultrasonicate 15 s buz üzerinde bir güç çıkışı ayarı ile 10 bir çalışma frekansında 23 kHz.
    11. 4 °C'de 20 dk için 13.680 x g'de hücre enkazLarını santrifüj ile çıkarın. Yeni bir 1.5 mL reaksiyon tüpünde supernatant toplayın ve ticari bir Bradford tsay veya başka uygun bir yöntem kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.
    12. Her numune için, 100 μg proteini 5x SDS-PAGE örnek tamponu ile toplam 60 μL hacimde birleştirin ve 95 °C'de 5 dk kaynatın. İstenilen hedef proteinin varlığı için numuneleri standart Batı lekeleme prosedürleri ile analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Puromisin dirençli C2C12 seçimi, transfeksiyondan 10-14 gün sonra dirençli olmayan, yani transfeksiyonsuz hücrelerin etkin bir şekilde ortadan kaldırılması nedeniyle elde edilebilir (Şekil 1B). Tipik olarak, hücrelerin % 80'den fazlası hücre kültürü çanamından uzaklaşıyor ve bu hücreler rutin hücre bakımı sırasında çıkarılır. Kontrol (şifreli) shRNA ifade puromisin dirençli C2C12 hücreleri düşük hücre yoğunluğunda mil şeklinde, uzamış hücre morfolojisi ve miyotüpler içine ay...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada C2C12 miyoblastlarında ECM proteinlerinin kararlı bir şekilde yıkılması ve C2C12 miyoblastlarının miyotüplere farklılaşmasının henotik analizi için bir protokol uyguluyoruz. Deney sonucunu çeşitli faktörler belirler ve dikkatle düşünülmeli. C2C12 hücrelerinin çoğalma aşamasında tutulması, C2C12 hücrelerini miyoblast öncül durumunda tutmak için kritik bir adımdır. C2C12 hücrelerinin sürekli miyotüpler içine ayırt etmek için yeteneğini istinat i) hücrelerin geçiş sayısı, ii) rutin bakım sırasında kültürlü hücrelerin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (Ulusal Artrit ve Kas İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü, NIAMS, hibe numarası AR070748) ve Leni & Peter W. Mayıs Ortopedi Bölümü, Icahn Tıp Fakültesi tohum finansmanı tarafından desteklenir Sina Dağı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AsetonFisher Kimyasal191784
AgarFisher BiyoreaktifleriBP1423
AmpisilinFisher BiyoreaktifleriBP1760-5
Otomatik hücre sayacı Kontes IIInvitrogenA27977
BradfordReaktif Termo BilimselP4205987
C2C12 hücreleriATCCCRL-1772
Oda slaytlarıInvitrogenC10283
KloroformFisher Kimyasal183172
DMEMGIBCO11965-092
DMSOFisher BiyoreaktifleriBP231-100
DNaz I (Amplifikasyon Derecesi)İnvitrojen18068015
Fetal sığır serumuVWR97068-085
GAPDHEMD MilliporeMAB374
GlisinVWR Yaşam Bilimleri19C2656013
Keçi-anti-fare ikincil antikoru (IRDYE 800CW)Li-CorC90130-02
Keçi-anti fare ikincil antikoru (Rhodamine-kırmızı)Jackson BağışıklıkAraştırmaları 133389
HClFisher KimyasalA144S
Kuluçka makinesi (Çalkalayıcı)Denville Scientific Corporation1704N205BC105
MerkaptoetanolAmresco, VWR Yaşam Bilimleri2707C122
Midiprep plazmit ekstraksiyon kitiQiagen12643
Miyozin 4 (miyozin ağır zincir)Invitrojen14-6503-82
Montaj ortamıInvitrogen2086310
NaClVWR Yaşam Bilimleri241
iyonik olmayan yüzey aktif madde/deterjanVWR Yaşam Bilimleri18D1856500
ParaformaldehitMP199983
PBSFisher BiyoreaktifleriBP399-4
PEIPolysciences23966-1
Penisilin / streptomisin antibiyotiklerGIBCO15140-122
PetridishCorning353003
Polipropilen tüplerFisherbrand149569C
Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleriRoche33576300
PuromycinFisher ScientificBP2956100
PCR (Gerçek Zamanlı)Uygulanan Biyosistemler4359284
Reaksiyonu tüplerEppendorf22364111
Ters Transkripsiyon Master MixUygulanan Biyosistemler4368814
RIPA tamponuThermo ScientificTK274910
sh kontrol plazmidiSigma-Aldrich07201820MN
sh 3086 plazmidSigma-AldrichTRCN0000092578
sh 972 plazmidSigma-Aldrich
sh 1977 plazmidSigma-AldrichTRCN0000092582
Spektrofotometre (Nanodrop)Thermo ScientificNanoDrop One C
SYBR Yeşil Reaktif Master KarışımıUygulamalı Biyosistemler743566
Trikloroasetik asitAcros Organics
Trizol reaktifiAmbion
Tripan mavisiGIBCO15250-061
TriptonFisher BiyoreaktifleriBP1421
Tripsin EDTA %0.25Gibco-Life Technology Corporation2085459
Su (DEPC ile muamele edilmiş ve nükleaz içermez)Fisher Bioreagents186163
Western blotting aparatıBioradMini Protean Tetra Hücresi
Maya özüFisher BioreagentsBP1422
TRCN0000092579 30145369 254707

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248(2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298(2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11(2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C2C12 MyoblastsshRNA KnockdownExtracellular Matrix ProteinsPuromycin SelectionCell DifferentiationWestern Blot AnalysisMyosin Heavy ChainSerum Free DMEMBright Field MicroscopyGene Expression Analysis

Related Articles