Burada bir kütle spektrometresi güdümlü genom madenciliği protokolü oluşturulmuş ve tanımlanmıştır. Genom dizilimi bilgileri ve LC-MS/MS analizine dayanan bu analiz, kompleks mikrobiyal ve bitki özlerinden moleküllerin belirlenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yeni Doğal Ürünleri Ortaya Çıkarmak İçin Bir Araç Olarak Kütle Spektrometresi Güdümlü Genom Madenciliği
Bu makalede
Özet
Özet
Doğal ürünlerin kapsadığı kimyasal alan çok büyüktür ve yaygın olarak tanınmaz. Bu nedenle, doğadaki işlevlerinin ve potansiyel insani yararlarının (örneğin, uyuşturucu keşif uygulamaları için) geniş kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi için uygun metodolojiler isteilmektedir. Bu protokol, genom madenciliği (GM) ve moleküler ağ (MN) kombinasyonunu tanımlar, bu yaklaşım, tüm genom dizilimindeki gen küme kodlu ek açıklamaları ile metabolik ham ekstrelerin kimyasal yapı imzalarıyla eşleşen iki çağdaş yaklaşımdır. Bu, yeni doğal varlıkların keşfine giden ilk adımdır. Bu kavramlar, birlikte uygulandığında, burada MS güdümlü genom madenciliği olarak tanımlanır. Bu yöntemde, ana bileşenler daha önce belirlenmiş (MN kullanılarak) ve yapısal olarak ilişkili yeni adaylar genom dizisi ek açıklamaları (GM kullanılarak) ile ilişkilidir. GM ve MN'nin birleştirilmesi, zaten bilinen bileşiklerden analogları belirlemek için yeni molekül omurgalarını hedeflemek veya metabolik profilleri toplamak için karlı bir stratejidir.
Giriş
Sekonder metabolizmanın araştırılması genellikle belirli biyolojik faaliyetler için ham ekstrelerin taranması ve ardından aktif fraksiyonlara ait bileşenlerin saflaştırılması, tanımlanması ve karakterizasyonundan oluşur. Bu süreç, çeşitli kimyasal varlıkların izolasyon teşvik verimli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, günümüzde bu, özellikle yeniden keşif yüksek oranları nedeniyle mümkün olarak görülüyor. İlaç endüstrisi, özel metabolitlerin rol ve işlevleri hakkında bilgi sahibi olmadan devrim yarattıkça, bunların tanımlanması doğayı tam olarak temsil eden laboratuvar koşulları altında gerçekleştirilmiştir1. Bugün, doğal sinyal etkileri, salgılanma....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Biyosentetik gen kümeleri için genom madenciliği
- MS güdümlü genom madenciliği için biyosentetik gen kümesi (BCG) seçmenin ilk adımı olarak tüm genom dizilemi (WGS) gerçekleştirin. Ilgi (bakteri) suş tüm genom taslağı illumina MiSeq teknolojisi ile yüksek kaliteli genomik DNA aşağıdaki kullanılarak elde edilebilir: av tüfeği TruSeq PCR-Free kütüphane hazırlık ve Nextera Mate Pair Kütüphane Hazırlık Kiti33.
NOT: Sıralamadan sonra, Illumina av tüfeği kütüphanesi ve Illumina mate çifti kütüphanesi Newbler v3.0 (Roche, 454) assembler programı (bulunan ) ve FgeneSB dayalı bir boru hattı kullanılarak açıklamalı (bulundu ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokol, yeni özel valinomisin analoglarına erişmek için genom madenciliği, heterolog ekspresyon ve MS güdümlü/kod yaklaşımlarının bir kombinasyonu kullanılarak başarıyla örneklendi. Hedef için genom-molekül iş akışı, valinomisin (VLM), Şekil 8'detemsil edilmektedir. Streptomyces sp. CBMAI 2042 taslak genomu silico'da analiz edildi ve VLM gen kümesi tespit edilerek heterolog bir konaka aktarıldı. Heterolog ve yabani tip suşları uygun fermantasyon koşulları kullanılarak trikülat ola.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün en güçlü avantajı, yeni moleküllerin, özellikle yapısal analogların yapılarını açıklığa kavuşturmak için metabolik profilleri hızla çoğaltma ve genomik bilgileri MS verileriyle birbirine bağlama yeteneğidir2. Genomik bilgilere dayanarak, polikeltidler (PK), nonribosomal peptidler (NRP) ve glikoziküllü doğal ürünler (GNP) gibi farklı doğal ürünler kemotipleri ve şifreli BGC'ler incelenebilir. Böylece, bir BGC moleküler ağ tarafından keşfedilen benzerlikler tarafından kolaylaştırılan, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışmanın mali desteği São Paulo Araştırma Vakfı - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 ve 2014/50249-8' den L.G.O'ya; 2013/12598-8 ve 2015/01013-4 r.s.; ve 2019/08853-9'dan C.F.F.A.'ya). B.S.P, C.F.F.A., ve L.G.O. Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Gelişim Konseyi'nden burs aldı - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 ve 313492/2017-4). L.G.O. ayrıca Women in Science (2008, Brazilian Edition) programı tarafından sağlanan hibe desteği için minnettardır. Tüm yazarlar Capes (Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi Için Koordinasyon) Brezilya'da mezuniyet sonrası programları desteklemek için kabul.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Asetonitril | Tedia | AA1120-048 | HPLC sınıfı |
| Agar | Oxoid | LP0011 | NA |
| Apramisin | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Karbenisilin | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Santrifüj | Eppendorf | NA | 5804 |
| Kloramfenikol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Sütun C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Genişletme-C18, 80 inç, 2,1 x 50 mm, 1,8 ve mikro; m, 1200 bar basınç limiti P/N 757700-902 |
| Kanamisin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | NA | 5418 |
| Nalidiksik asit | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash Yüksek Sadakatli PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF kütle spektrometresi | Agilent teknolojileri | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose PA- ACS | Synth | NA | NA |
| Çalkalayıcı/İnkübatör | Marconi | MA420 | NA |
| Sodyum Klorür | Synth | NA | PA - ACS |
| Soya özü | NA | NA | NA |
| Sükroz | Synth | NA | PA - ACS |
| Termal Döngüler | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradyan |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Tripton | Oksoit | LP0042 | NA |
| Tripton Soya Suyu | Oksoit | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC Sistemi |
| Maya özü | Oksoit | LP0021 | NA |
Kaynaklar
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
