Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeni Doğal Ürünleri Ortaya Çıkarmak İçin Bir Araç Olarak Kütle Spektrometresi Güdümlü Genom Madenciliği

10.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60825

⸱

12 Mart 2020

 ,  ,  , 
1Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP), 2Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC (UFABC)

Bu makalede

Özet

Burada bir kütle spektrometresi güdümlü genom madenciliği protokolü oluşturulmuş ve tanımlanmıştır. Genom dizilimi bilgileri ve LC-MS/MS analizine dayanan bu analiz, kompleks mikrobiyal ve bitki özlerinden moleküllerin belirlenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Özet

Doğal ürünlerin kapsadığı kimyasal alan çok büyüktür ve yaygın olarak tanınmaz. Bu nedenle, doğadaki işlevlerinin ve potansiyel insani yararlarının (örneğin, uyuşturucu keşif uygulamaları için) geniş kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi için uygun metodolojiler isteilmektedir. Bu protokol, genom madenciliği (GM) ve moleküler ağ (MN) kombinasyonunu tanımlar, bu yaklaşım, tüm genom dizilimindeki gen küme kodlu ek açıklamaları ile metabolik ham ekstrelerin kimyasal yapı imzalarıyla eşleşen iki çağdaş yaklaşımdır. Bu, yeni doğal varlıkların keşfine giden ilk adımdır. Bu kavramlar, birlikte uygulandığında, burada MS güdümlü genom madenciliği olarak tanımlanır. Bu yöntemde, ana bileşenler daha önce belirlenmiş (MN kullanılarak) ve yapısal olarak ilişkili yeni adaylar genom dizisi ek açıklamaları (GM kullanılarak) ile ilişkilidir. GM ve MN'nin birleştirilmesi, zaten bilinen bileşiklerden analogları belirlemek için yeni molekül omurgalarını hedeflemek veya metabolik profilleri toplamak için karlı bir stratejidir.

Giriş

Sekonder metabolizmanın araştırılması genellikle belirli biyolojik faaliyetler için ham ekstrelerin taranması ve ardından aktif fraksiyonlara ait bileşenlerin saflaştırılması, tanımlanması ve karakterizasyonundan oluşur. Bu süreç, çeşitli kimyasal varlıkların izolasyon teşvik verimli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, günümüzde bu, özellikle yeniden keşif yüksek oranları nedeniyle mümkün olarak görülüyor. İlaç endüstrisi, özel metabolitlerin rol ve işlevleri hakkında bilgi sahibi olmadan devrim yarattıkça, bunların tanımlanması doğayı tam olarak temsil eden laboratuvar koşulları altında gerçekleştirilmiştir1. Bugün, doğal sinyal etkileri, salgılanması ve tespit edilemeyen düşük konsantrasyonlarda çoğu hedefin varlığı daha iyi bir anlayış vardır. Ayrıca, sürecin düzenlenmesi akademik topluluğun ve ilaç endüstrisinin bu bilgiden yararlanabilmelerine yardımcı olacaktır. Ayrıca sessiz biyosentetik gen kümeleri (BGCs)2ile ilgili metabolitlerin doğrudan izolasyon içeren araştırma yararlanacaktır.

Bu bağlamda genomik dizilimdeki gelişmeler mikroorganizma metabolitlerinin taranmasına olan ilgiyi yenilemidir. Bunun nedeni, ortaya çıkarılan biyosentetik kümelerin genomik bilgilerinin analiz edilmesi, laboratuvar koşullarında gözlemlenmeyen veya üretilmemiş yeni bileşikleri kodlayan genleri ortaya çıkarabilebilir. Birçok mikrobiyal bütün genom projeleri veya taslakları bugün mevcuttur, ve sayısı her yıl artıyor, genom madenciliği yoluyla yeni biyoaktif molekülleri ortaya çıkarmak için büyük umutları sağlayan3,4.

Biyosentetik Gen Kümeleri Atlası, Ortak Genom Enstitüsü (JGI IMG-ABC)2Entegre Mikrobiyal Genom Platformu'nun bir bileşeni olarak otomatik olarak çıkarılan gen kümelerinin mevcut en büyük koleksiyonudur. En son, Biyosentetik Gen Kümeleri için Minimum Bilgi (MIBiG) Standardizasyon Girişimi, son derece küratörlü referans dataset5sağlayarak, BGCs manuel reannotation teşvik etmiştir. Günümüzde, genetik verilerin hesaplamalı madenciliğini ve bunların bilinen ikincil metabolitlerle bağlantısını sağlamak için birçok araç mevcuttur. Farklı stratejiler de yeni biyoaktif doğal ürünlere erişmek için geliştirilmiştir (yani, heterolog ifade, hedef gen silme, in vitro reconstitution, genomik dizi, izotop güdümlü tarama [genomistopik yaklaşım], yerel ve küresel düzenleyicilerin manipülasyonu, direnç hedef tabanlı madencilik, kültür bağımsız madencilik, ve daha yakın zamanda, MS güdümlü / kodyaklaşımları 2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).

Tek bir strateji olarak genom madenciliği, tek veya küçük bir molekül grubuna açıklama yapmak için çaba gerektirir; böylece, izolasyon ve yapı açıklanma için yeni bileşiklerin öncelik lendirildiği süreçteki boşluklar devam etmektedir. Prensip olarak, bu yaklaşımlar deney başına sadece bir biyosentetik yolu hedefleyerek yavaş bir keşif hızına yol açacaktır. Bu anlamda, moleküler ağ yaklaşımı ile birlikte GM kullanarak doğal ürün araştırma için önemli bir ilerleme temsil eder14,15.

Sıvı kromatografi-kütle spektrometresinin (LC-MS) çok yönlülüğü, doğruluğu ve yüksek hassasiyeti onu bileşik tanımlama için iyi bir yöntem haline getirin. Şu anda, çeşitli platformlar hedeflenmemiş metabolomics16, 17,18,,1919,20için algoritmalar ve yazılım paketleri yatırım yaptık. Bu programların çekirdeği, bir dizi örnek arasında aynı özelliklerin eşleşmesine ve desenlerin aranmasına olanak tanıyan özellik algılama (tepe toplama)21 ve tepe hizalama içerir. MS desen tabanlı algoritmalar22,23 karakteristik parçalanma desenleri karşılaştırın ve yapısal özellikleri paylaşan moleküler aileler üreten MS2 benzerlikler maç. Bu özellikler daha sonra vurgulanmış ve kümelenmiş olabilir, hızla tandem MS2tarafından karmaşık bir biyolojik ekstresi bilinen ve bilinmeyen molekülleri keşfetmek için yeteneği conferring,24,25. Bu nedenle, tandem MS aynı anda büyük miktarda veri bulunan çeşitli kemotiplerin yapısal bilgi elde etmek için çok yönlü bir yöntemdir.

Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)26 algoritması, benzerliklerin bir kosinüs fonksiyonu kullanılarak karşılaştırıldığı çok boyutlu vektörler oluşturmak için normalleştirilmiş parça iyonyoğunluğunu kullanır. Farklı üst iyonlar arasındaki ilişki, her parçalanmanın bir düğüm (daire) olarak görüntülendiği ve her düğümün ilişkililiğinin bir kenar (çizgiler) ile tanımlandığı bir diyagram gösteriminde çizilir. Moleküllerin tek bir kaynaktan küresel görselleştirilmesi moleküler ağ olarak tanımlanır. Yapısal olarak farklı moleküller bu parçayı benzersiz olarak oluştururken, ilgili moleküller birlikte kümelenirler. Kümeleme chemotypes biyosentetik kökenleri benzer yapısal özelliklerivarsayımsal bağlantı sağlar.

Hem kemotip-to-genotip ve genotip-to-chemotype yaklaşımları birleştirerek BGCs ve küçük molekül ürünleri arasında biyoinformatik bağlantılar oluştururken güçlüdür27. Bu nedenle, MS güdümlü genom madenciliği hızlı bir yöntem ve düşük malzeme tüketen bir stratejidir ve farklı metabolik ve çevresel koşullar altında bir veya daha fazla suşwgs tarafından ortaya ebeveyn iyonları ve biyosentetik yollar köprü yardımcı olur.

Bu protokolün iş akışı(Şekil 1)WGS verilerinin antiSMASH28,29,30gibi biyosentetik gen kümesi açıklama platformuna aktarılmasından oluşur. Genom tarafından kodlanmış bileşiklerin çeşitliliğinin ve sınıfının tahmin edilebilen bir şekilde tahmin edilebilen bir yapıya yardımcı olur. İlgi kimyasal bir varlık kodlama bir biyosentetik gen kümesi hedef bir strateji kabul edilmelidir ve BGC içeren vahşi bir tür gerginlik ve / veya heterolog suşu kültür özleri GNPS26kullanarak benzerliklere dayalı kümelenmiş iyonlar oluşturmak için analiz edilebilir,31. Sonuç olarak, hedeflenen BGC ile ilişkilendirmek ve veritabanında kullanılamaz yeni molekülleri belirlemek mümkündür (özellikle bilinmeyen analogları, bazen düşük titreleri üretilen). Kullanıcıların bu platformlara katkıda bulunabileceğini ve biyoinformatik ve MS/MS verilerinin kullanılabilirliğinin hızla arttığını ve karmaşık özlerin moleküllerle verimli bağlantılarını yönlendirmek için etkili hesaplama araçları nın ve algoritmalarının sürekli olarak geliştirilmesine ve yükseltilmesine yol açmaktadır.

figure-introduction-1
Şekil 1: Tüm iş akışına genel bakış. Gösterilen biyoinformatik bir örnektir, klonlama, ve moleküler ağ adımları tanımlanan MS güdümlü genom madenciliği yaklaşımında yeni metabolitleri tanımlamak için yer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, genom madenciliği ve moleküler ağ lağımını doğal ürün keşif boru hattı için başlangıç noktası olarak birleştirmek için hızlı ve verimli bir iş akışını tanımlar. Birçok uygulama bir ağda MS-algılanabilir moleküllerin bileşimi ve ilgililiğini görselleştirmek mümkün olmasına rağmen, birkaç yapısal olarak benzer kümelenmiş molekülleri görselleştirmek için burada kabul edilmiştir. Bu strateji kullanılarak Streptomyces sp. CBMAI 2042 metabolik ekstrelerinde gözlenen yeni siklopsipeptid ürünleri başarıyla tanımlanmıştır. Genom madenciliği rehberliğinde, valinomycins için tüm biyosentetik gen küme kodlama tanınan ve üretici suşu Streptomyces coelicolor M1146 içine klonlanmış. Son olarak, MS desen tabanlı moleküler ağ lama sonrasında, MS tarafından saptanan moleküller biyogenez32'densorumlu BgC'lerle ilişkilidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Biyosentetik gen kümeleri için genom madenciliği

  1. MS güdümlü genom madenciliği için biyosentetik gen kümesi (BCG) seçmenin ilk adımı olarak tüm genom dizilemi (WGS) gerçekleştirin. Ilgi (bakteri) suş tüm genom taslağı illumina MiSeq teknolojisi ile yüksek kaliteli genomik DNA aşağıdaki kullanılarak elde edilebilir: av tüfeği TruSeq PCR-Free kütüphane hazırlık ve Nextera Mate Pair Kütüphane Hazırlık Kiti33.
    NOT: Sıralamadan sonra, Illumina av tüfeği kütüphanesi ve Illumina mate çifti kütüphanesi Newbler v3.0 (Roche, 454) assembler programı (bulunan ) ve FgeneSB dayalı bir boru hattı kullanılarak açıklamalı (bulundu ), daha önce açıklandığı gibi33. Mikrobiyoloji Kaynak Duyuruları (MRA), mevcut bir depoda (bulunan ) herhangi bir mikrobiyolojik kaynağın kullanılabilirliğini yayınlayan makaleleri içeren tamamen açık erişimli bir dergidir. Aday protein kodlama genleri RAST sunucu ek açıklama34kullanılarak tanımlanır ve Tüm Genom Shotgun (WGS) projesi DDBJ/ENA/GenBank (bulunan ) ve Gold (bulunan ) veritabanlarında bulunur.
  2. Sekonder metabolizma gen kümeleri ek açıklamaları hakkında silico bilgi almak için tam bir dizili genomdan dizili dosyasını (GenBank/EMBL veya FASTA formatı) bir antiSMASH platformuna (bulunan ) gönderin.
  3. Bilinen en benzer kümeyi temel alan çıktı verilerinden(Şekil 2)ilgi gen kümesini seçin.
    NOT: İlk olarak, hangi fonksiyonların istenilen biyosentetik gen gruplarıyla ilişkili olduğunu değerlendirmek için gen-by-gene'i araştırmak ve bireysel aramalar (blastp) yapmak rutindir. Bu yordam, düşük bir yüzde olsa bile, hangi BGC'nin istenilen bileşiğin üretimiyle ilişkili olduğunu belirlemeye de yardımcı olabilir. Bir antiSMASH tahmini, hedeflenen BGC için küresel bir düşük benzerlik yüzdesini temsil edebilir yüzde kapsama yapmak için bir küme içinde tüm genleri dikkate alır. Ancak, gen-by-gen analiz ederken, en benzer bilinen küme kullanarak daha doğru bilgi elde etmek mümkündür. İkinci olarak, antiSMASH bir arama rafine etmek için iki seçenek vardır: 1) algılama sıkılık: biyosentetik gen kümesi bir hit olarak kabul edilmelidir hangi sıkılık derecesi. Bu seçenek için, kullanıcı aşağıdaki parametreleri kullanmalıdır: a) katı: sadece iyi tanımlanmış kümeleri tüm gerekli bölgeleri içeren algılar, genetik bilgi ile ilgili hatalara karşı duyarlı; b) rahat: kısmi kümeleri bir veya daha fazla işlevsel bölge eksik algılar, aynı zamanda sıkı özelliği tespit etmek için çalışır; veya c) gevşek: yanlış pozitif veya kötü tanımlanmış BGC'lerin ortaya çıkmasına yol açabilecek, birincil metabolitlerle eşleşen kötü tanımlanmış kümeleri ve kümeleri algılar. Diğer seçenek ise 2) ekstra özelliklerdir: platformun araması ve çıktıda göstermesi gereken bilgi türü. Genel olarak, bu iki seçenek tahminden sonra zamandan tasarruf edebilir. Ancak, antiSMASH iş daha uzun bir süre gerektirir.

figure-protocol-1
Şekil 2: AntiSMASH platformundan çıktı. Tüm genom dizisi ek açıklamalarından siliko analizinde sekonder metabolizma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. BGC'nin DNA dizilimi bilgilerine dayanarak, esac(E. coli/Streptomyces Artificial Kromozom) kütüphane taraması için gen kümesini çevreleyen tasarım astarları (20-25 nt).
    NOT: Tüm biyosentetik gen kümesini DNA'dan yakalamak için35,36 farklı yöntemler kullanılabilir. Burada kullanılan yöntem, streptomyces sp. CBMAI 2042~95 kb ortalama boyutu parçaları ile klonlar içeren bir temsilci ESAC kütüphane37,,38 inşaat.

2. ESAC kütüphanesinden tüm biyosentetik gen kümesinin heterolog ekspresyonu

  1. ESAC vektörü E. coli DH10B'den E. coli ET12567'ye üçlü çekim32ile taşıyın.
    1. Luria-Bertani (LB) içeren 5 mL luria-Bertani (LB) ortamında E. coli ET12567 (CamR), TOPO10/pR9604 (CarbR), DH10B/ESAC4H (AprR) kloramfenikol (25 g/mL), karbenillin (100 μg/mL) ve apramisin (5g/mL) içeren ortamaşın.
    2. Kültürü bir gecede 37 °C ve 250 rpm'de kuluçkaya yatırın.
    3. Yarım konsantrasyonlu antibiyotik içeren 10 mL LB orta sında gece kültürünün 500 μL'sini aşılama.
    4. Kültürü 37 °C ve 250 rpm'de kuluçkaya yatırın ve 0.4-0.6'lık A600'e ulaşın.
    5. 5 dk için 2.200 x g santrifüj ile hücreleri hasat.
    6. Hücreleri 20 mL LB orta ile iki kez yıkayın.
    7. LB orta 500 μL hücreleri resuspend.
    8. Bir mikrosantrifüj tüp her suşun 20 μL karıştırın ve LB orta antibiyotik yoksun bir agar plaka içine damla.
    9. Plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    10. Yetiştirilen hücreleri antibiyotik içeren taze bir LB agar plakasına yerleştirin ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

3. Streptomyces/E. coli çekimi

  1. Rekombinant heterolog organizma elde etmek için, ESAC vektörü içeren E. coli ET12567 arasında konjugasyon32 gerçekleştirmek, yardımcı plazmid pR9604, ve Streptomyces coelicolor M1146 veya başka bir seçilmiş konak suşu39.
  2. 1. Gün: S. çölist M1146'nın izole kolonilerini 25 mL'lik TSBY orta sında, 30 °C'de inox-spring ve 48 saat boyunca 200 rpm ile donatılmış 25mL Erlenmeyer şişesinde inoküle edin.
  3. 2/3 Gün: ET12567/ESAC/pR9604'ü kloramfenikol (25 g/mL), karbenicillin (100 μg/mL) ve apramisin (50 μg/mL) geceboyunca 37 °C ve 250 rpm'de içeren 5 mL LB orta yılında aşılayın.
  4. Gün 3/4: Yarım çalışma konsantrasyonları içeren 2TY 'nin 10 mL'sinde (50 mL konik tüpte) gece kültürünün 500 μL'sini aşılayın. 37 °C ve 250 rpm'de 0.4-0.6'lık A600'e ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.
  5. 10 dk için 2200 x g'de kültürleri (ET12567/ESAC/pR9604 ve M1146) santrifüj edin.
  6. Peletleri 20 mL 2TY orta ve 2TY 500 μL'de yeniden askıya alın.
  7. Aliquot 200 μL S. çölrengi M1146 süspansiyon ve seyreltik 500 μL 2TY (süspansiyon A).
  8. Aliquot 200 μL süspansiyon A ve seyreltik 500 μL 2TY (süspansiyon B).
  9. Aliquot 200 μL süspansiyon B ve seyreltik 500 μL 2TY (süspansiyon C).
  10. Aliquot 200 μL ET12567/ESAC/pR9604 süspansiyon ve 200 μL süspansiyon C ile karıştırın.
  11. SFM agar plakası üzerindeki konjugasyon karışımının 150 μL'lik plakası antibiyotikten yoksun.
  12. 30 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
  13. 1 mL antibiyotik çözeltisi içeren kapak plakaları (plazmid direncine göre). Kurutuktan sonra 30 °C'de 4-7 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Burada 1.0 mg/mL tiyoston ve 0.5 mg/mL nalidixic asit içeren bir çözelti hazırlandı.
  14. SFM agar plakaları üzerine seri putkonjugantler tiyostrepton içeren (50 mg/mL) ve nalidixic asit (25 mg/mL). 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
  15. Sadece nalidixic asit içeren bir SFM agar üzerine Streak ekskonjugantler.
  16. Tüm gen kümesinin S. çölicolor M1146 ana bilgisayarına aktarıldığını doğrulamak için izole kolonilerle PCR analizi yapın.

4. Süzme tarım

  1. Metabolik profili elde etmek için, suş öncesi kültürün 1/100'ü uygun fermantasyon ortamlarında ve uygun kültür koşullarında aşılamak.
  2. 10 dk için 2200 x g santrifüj kültürleri.
  3. Faiz bileşik sınıfına göre çıkarma gerçekleştirin40.

5. Kütle spektrumları elde etmek ve GNPS analizine hazırlık

  1. MS/MS verilerini elde etmek için, kontrol yazılımını kullanarak uygun HPLC ve kütle spektrometresi yöntemlerini program. Hem yüksek hem de düşük çözünürlüklü veriye bağlı kütle spektrometresi analizi (DDA) analiz edilebilir.
    NOT: Genellikle kompleks ham ekstresi örneklerinin 1 mg/mL çözeltisi idealdir. Seyreltmeler daha az karmaşık özler için gereklidir. MS/MS ağının, verilen kütle spektrometrik koşullarında tespit edilebilen moleküler ağ olduğu unutulmamalıdır.
  2. Proteowizard'dan MSConvert kullanarak kütle spektrumlarını .mzXML biçimine dönüştürün (bulunan ). Dönüştürme için giriş parametreleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Hemen hemen tüm şirketlerin yazılım verileri uyumludur.

figure-protocol-2
Şekil 3: MS dosyalarını mzXML uzantısına dönüştürmek için MsConvert kullanma. GNPS çözümlemesi için doğru parametre görüntülenir. Talimatlar aşağıdaki gibidir: tüm MS dosyalarını 1 kutusuna ekleyin ve 2 no'lu kutuya Tepe Toplama filtresini ekleyin; bu filtre için algoritma satıcısını kullanın; başlat tuşuna basın ve dönüşüm süreçleri takip edecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Dönüştürülmüş LC-MS/MS dosyalarını GNPS veritabanına yükleyin. İki seçenek mevcuttur: bir dosya aktarım protokolü (FTP) kullanarak veya doğrudan bir tarayıcıda çevrimiçi platform üzerinden.
    NOT: Verilerin GNPS'ye nasıl yüklendiği ve aktarılacak larına ilişkin ayrıntılı bilgiye adresinden ulaşılabilir.

6. GNPS analizi

  1. GNPS'de bir hesap oluşturduktan sonra (bulunan ), oluşturulan hesapta oturum aç arak Moleküler Ağ Oluştur'useçin. Bir iş unvanı ekleyin.
  2. Temel seçenekler: moleküler ağı gerçekleştirmek için mzXML dosyalarını seçin. Altı gruba kadar organize edilebilirler. Çoğaltma yordamı için kitaplıkları seçin (Şekil 4).
    NOT: Bu gruplar moleküler ağ yapımına müdahale etmez. Bu bilgiler yalnızca grafik gösterimi için kullanılacaktır.

figure-protocol-3
Şekil 4: Moleküler ağ analizi yapmak için çevrimiçi GNPS platformlarını kullanmak. mzXML dosyalarının seçimi 1 no'lu kutuya tıklayarak yapılır. Açık iletişim kutusunda, dosyalar kişisel klasörden (kutu 2) seçilebilir veya sürükle ve bırak dosya yükleyicisi (20 MB'dan az) kullanılarak ikinci sekmede yüklenebilir. Dosyalar en fazla altı gruba gruplandırılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Sırasıyla 0,02 Da ve 0,05 Da öncül iyon kütle toleransı ve parça iyon kütle toleransını seçin.
    NOT: GNPS 1) MS/MS verilerinin ne kadar doğru olduğuna ve 2) ilişkilendirme nin ne kadar doğru olması gerektiğine bağlı olarak farklı türde katılıkları vardır. Temel seçenekler: Bu klasörde, Öncül Ion Kütle Toleransı ve Fragment Ion Kütle Toleransı ayarlamak mümkündür. Bu parametreler öncül iyon ve parça iyonne ne kadar hassas olması gerektiğini belirlemek için kılavuz olarak kullanılır. Seçilen kütle toleransları kullanılan kütle spektrometresinin çözünürlüğüne ve doğruluğuna bağlıdır.
  2. Gelişmiş ağ seçenekleri: Parametreleri Şekil 5'egöre seçin. Bu parametreler ağ kümesi boyutunu ve biçimini doğrudan etkiler. Kalan sekmeler bölümündeki bir diğer parametre gelişmiş kullanıcılar içindir; böylece, varsayılan değerleri bırakın.
    NOT: Gelişmiş parametreler GNPS belgelerinde okunabilir (http://lt;https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/>) bulunabilir.

figure-protocol-4
Şekil 5: Moleküler ağ analizi (gelişmiş seçenekler) gerçekleştirmek için GNPS kullanarak. Min Pair Cos kümelerin boyutunu doğrudan etkileyecektir, çünkü yüksek değerler yakından ilişkili bileşiklerve uzak ilişkili bileşiklerin birleştirilmesinde düşük değerleri birleştirmeye neden olacaktır. Çok düşük değerler kullanmaktan kaçınılmalıdır. En az eşleşen parça iyonları, ağda bağlanacak iki parçalanma spektrumu arasındaki paylaşılan parça sayısını temsil eder. Birlikte, her iki parametre ağ biçimini yönlendirir; daha düşük değerler daha uzak ilişkili bileşikler ve tersi küme olacaktır. Uygun değerleri kullanarak büyük ölçüde bileşik açıklanma yardımcı olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. İş bittiğinde uyarı almak için bir e-posta adresi seçin ve işi gönderin.

7. GNPS sonuçlarının analizi

  1. GNPS'ye giriş yapın. İş İlanları > Yayımlanmış iş > İşi açmak için yapılır. Şekil 6'dagösterildiği gibi bir web sayfası açılacaktır. Moleküler ağdan elde edilen tüm sonuçlar görüntülenir.
  2. Tüm ağ kümelerini görmek için Spektral Aileleri Görüntüle 'yi (Tarayıcı Ağı Görselleştiricisinde) seçin (kırmızı kutu, Şekil 6).

figure-protocol-5
Şekil 6: Moleküler ağ sonuçlarını görselleştirmek için GNPS kullanılması. İlgili tüm bileşik kümeler görünüm spektral ailelerde (kırmızı kutu) görülebilir. Yalnızca kitaplık isabetlerini görselleştirmek için "tüm kitaplık isabetlerini görüntüle" (mavi kutu) seçilmelidir. Moleküler ağ sonuçlarının daha iyi grafik gösterimi için "Direct Cytoscape Preview" (sarı kutu) indirilmeli ve Cytoscape'in en son sürümü kullanılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Oluşturulan tüm moleküler ağ kümeleriyle birlikte bir liste görüntülenir. Bulguları oluşturmak için bir kitaplık araması seçilirse, geçici moleküllerin tanımlanması AllID'lerde görüntülenir. Görselleştirmek için Göster'i seçin.
    NOT: Veri analizleri diğer sonuçlar için yönlendirilebilir (örneğin, genom madenciliği, biyolojik tahliller, kütüphane dereplik molekülleri, vb.).
  2. Moleküler ağ kümesini analiz etmek için Visualize Network'ünüseçin.
    NOT: Her küme, sırasıyla molekülleri ve moleküler benzerliği temsil eden düğümler (daireler) ve kenarlardan oluşur. Dereplicated molekülleri online tarayıcı ağ görselleştirici bir mavi düğüm olarak vurgulanır.
  3. Düğüm etiketleri kutusunda, üst kitleyi seçin (kırmızı kutu, Şekil 7).
  4. Kenar etiketleri kutusunda, düğüm benzerliğini veya düğümler arasındaki kütle farkını gözlemlemek için Sırasıyla Cosine veya DeltaMZ'yi seçin (sarı kutu, Şekil 7).
  5. Çok gruplu analizlerde, her düğümün her grupta görünme sıklığını gözlemlemek için düğüm boyama kutusundaki pastaları çiz'itıklatın (mavi kutu, Şekil 7).
    NOT: Diğer seçenekler mümkündür, ancak yukarıda önerilenler küme düğümlerini açıklama ve yapılarını çözmek için en uygun seçenektir.

figure-protocol-6
Şekil 7: Moleküler küme sonuçlarını görselleştirmek için GNPS kullanılması. Daha iyi veri görselleştirme için moleküler kümeleri açtıktan sonra aşağıdakiler seçilmelidir: düğüm etiketleri (kırmızı kutu) olarak "Üst kütle"; Kenar etiketleri (sarı kutu) olarak "DeltaMZ" ve düğüm boyama (mavi kutu) olarak "Pasta çizin". Moleküler küme de gezinmek ve tüm düğümleri açıklama deneyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Tüm kitaplık isabetlerini görmek için tüm kitaplık isabetlerini görüntüle 'yi (mavi kutu, Şekil 7)seçin.
    NOT: Ayrıca, MNW "Direct Cytoscape Preview/Download" (sarı kutu, Şekil 7)indirilebilir ve dosya grafik yapısında daha fazla seçenek için Cytoscape platformunda (bulunan ) açılabilir.
  2. Dereplicated bileşiklerin manuel onayı ve ilgili bileşiklerin yapı açıklaması gereklidir. Parçalanma spektrumlarını doğrudan GNPS platformunda veya orijinal ham dosyalarda açın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol, yeni özel valinomisin analoglarına erişmek için genom madenciliği, heterolog ekspresyon ve MS güdümlü/kod yaklaşımlarının bir kombinasyonu kullanılarak başarıyla örneklendi. Hedef için genom-molekül iş akışı, valinomisin (VLM), Şekil 8'detemsil edilmektedir. Streptomyces sp. CBMAI 2042 taslak genomu silico'da analiz edildi ve VLM gen kümesi tespit edilerek heterolog bir konaka aktarıldı. Heterolog ve yabani tip suşları uygun fermantasyon koşulları kullanılarak trikülat ola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün en güçlü avantajı, yeni moleküllerin, özellikle yapısal analogların yapılarını açıklığa kavuşturmak için metabolik profilleri hızla çoğaltma ve genomik bilgileri MS verileriyle birbirine bağlama yeteneğidir2. Genomik bilgilere dayanarak, polikeltidler (PK), nonribosomal peptidler (NRP) ve glikoziküllü doğal ürünler (GNP) gibi farklı doğal ürünler kemotipleri ve şifreli BGC'ler incelenebilir. Böylece, bir BGC moleküler ağ tarafından keşfedilen benzerlikler tarafından kolaylaştırılan, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışmanın mali desteği São Paulo Araştırma Vakfı - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 ve 2014/50249-8' den L.G.O'ya; 2013/12598-8 ve 2015/01013-4 r.s.; ve 2019/08853-9'dan C.F.F.A.'ya). B.S.P, C.F.F.A., ve L.G.O. Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Gelişim Konseyi'nden burs aldı - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4 ve 313492/2017-4). L.G.O. ayrıca Women in Science (2008, Brazilian Edition) programı tarafından sağlanan hibe desteği için minnettardır. Tüm yazarlar Capes (Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi Için Koordinasyon) Brezilya'da mezuniyet sonrası programları desteklemek için kabul.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonitrilTediaAA1120-048HPLC sınıfı
AgarOxoidLP0011NA
ApramisinSigma AldrichA2024NA
KarbenisilinSigma AldrichC9231NA
SantrifüjEppendorfNA5804
KloramfenikolSigma AldrichC3175NA
Sütun C18Agilent TechnologiesNAZORBAX RRHD Genişletme-C18, 80 inç, 2,1 x 50 mm, 1,8 ve mikro; m, 1200 bar basınç limiti P/N 757700-902
KanamisinSigma AldrichK1377NA
Manitol P.A.- A.C.S.SynthNANA
MikrosantrifüjEppendorfNA5418
Nalidiksik asitSigma AldrichN4382NA
Phusion Flash Yüksek Sadakatli PCR Master MixThermoFisher ScientificF548SNA
Q-TOF kütle spektrometresiAgilent teknolojileriNA6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose PA- ACSSynthNANA
Çalkalayıcı/İnkübatörMarconiMA420NA
Sodyum KlorürSynthNAPA - ACS
Soya özüNANANA
SükrozSynthNAPA - ACS
Termal DöngülerEppendorfNAMastercycler Nexus Gradyan
ThiostreptonSigma AldrichT8902NA
TriptonOksoitLP0042NA
Tripton Soya SuyuOksoitCM0129NA
UPLCAgilent TechnologiesNA1290 Infinity LC Sistemi
Maya özüOksoitLP0021NA

Kaynaklar

  1. Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
  2. Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8), 988-1005 (2016).
  3. Zerikly, M., Challis, G. L. Strategies for the Discovery of New Natural Products by Genome Mining. ChemBioChem. 10 (4), 625-633 (2009).
  4. Gomez-Escribano, J. P., Bibb, M. J. Heterologous expression of natural product biosynthetic gene clusters in Streptomyces coelicolor: from genome mining to manipulation of biosynthetic pathways. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 41 (2), 425-431 (2014).
  5. Medema, M. H., et al. Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster. Nature Chemical Biology. 11 (9), 625-631 (2015).
  6. Lautru, S., Deeth, R. J., Bailey, L. M., Challis, G. L. Discovery of a new peptide natural product by Streptomyces coelicolor genome mining. Nature Chemical Biology. 1 (5), 265-269 (2005).
  7. Chiang, Y. -M., et al. Molecular Genetic Mining of the Aspergillus Secondary Metabolome: Discovery of the Emericellamide Biosynthetic Pathway. Chemistry & Biology. 15 (6), 527-532 (2008).
  8. Huang, T., et al. Identification and Characterization of the Pyridomycin Biosynthetic Gene Cluster of Streptomyces pyridomyceticus NRRL B-2517. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20648-20657 (2011).
  9. Udwary, D. W., et al. Genome sequencing reveals complex secondary metabolome in the marine actinomycete Salinispora tropica. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10376-10381 (2007).
  10. Gross, H., et al. The Genomisotopic Approach: A Systematic Method to Isolate Products of Orphan Biosynthetic Gene Clusters. Chemistry & Biology. 14 (1), 53-63 (2007).
  11. Spohn, M., Wohlleben, W., Stegmann, E. Elucidation of the zinc-dependent regulation in Amycolatopsis japonicum enabled the identification of the ethylenediamine-disuccinate ([S,S ]-EDDS) genes. Environmental Microbiology. 18 (4), 1249-1263 (2016).
  12. Thaker, M. N., Waglechner, N., Wright, G. D. Antibiotic resistance-mediated isolation of scaffold-specific natural product producers. Nature Protocols. 9 (6), 1469-1479 (2014).
  13. Katz, M., Hover, B. M., Brady, S. F. Culture-independent discovery of natural products from soil metagenomes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 43, 129-141 (2016).
  14. Quinn, R. A., et al. Molecular Networking as a Drug Discovery, Drug Metabolism, and Precision Medicine Strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (2), 143-154 (2017).
  15. Yang, J. Y., et al. Molecular Networking as a Dereplication Strategy. Journal of Natural Products. 76 (9), 1686-1699 (2013).
  16. Lommen, A. MetAlign: Interface-Driven, Versatile Metabolomics Tool for Hyphenated Full-Scan Mass Spectrometry Data Preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
  17. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
  18. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395(2010).
  19. Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
  20. Kuhl, C., Tautenhahn, R., Böttcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
  21. Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158, 318-328 (2007).
  22. Liu, W. -T., et al. Interpretation of Tandem Mass Spectra Obtained from Cyclic Nonribosomal Peptides. Analytical Chemistry. 81 (11), 4200-4209 (2009).
  23. Ng, J., et al. Dereplication and de novo sequencing of nonribosomal peptides. Nature Methods. 6 (8), 596-599 (2009).
  24. Liaw, C., et al. Vitroprocines, new antibiotics against Acinetobacter baumannii, discovered from marine Vibrio sp. QWI-06 using mass-spectrometry-based metabolomics approach. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  25. Kang, K. B., et al. Targeted Isolation of Neuroprotective Dicoumaroyl Neolignans and Lignans from Sageretia theezans Using in Silico Molecular Network Annotation Propagation-Based Dereplication. Journal of Natural Products. 81 (8), 1819-1828 (2018).
  26. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  27. Doroghazi, J. R., et al. A roadmap for natural product discovery based on large-scale genomics and metabolomics. Nature Chemical Biology. 10 (11), 963-968 (2014).
  28. Medema, M. H., et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acids Research. 39, 339-346 (2011).
  29. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43, 237-243 (2015).
  30. Blin, K., et al. antiSMASH 5.0: updates to the secondary metabolite genome mining pipeline. Nucleic Acids Research. 47, 81-87 (2019).
  31. Watrous, J., et al. Mass spectral molecular networking of living microbial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (26), 1743-1752 (2012).
  32. Paulo, B. S., Sigrist, R., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. New Cyclodepsipeptide Derivatives Revealed by Genome Mining and Molecular Networking. ChemistrySelect. 4 (27), 7785-7790 (2019).
  33. Gonzaga de Oliveira, L., Sigrist, R., Sachetto Paulo, B., Samborskyy, M. Whole-Genome Sequence of the Endophytic Streptomyces sp. Strain CBMAI 2042, Isolated from Citrus sinensis. Microbiology Resource Announcements. 8 (2), 1-2 (2019).
  34. Aziz, R. K., et al. The RAST Server: Rapid Annotations using Subsystems Technology. BMC Genomics. 9 (1), 75(2008).
  35. Nah, H. -J., Pyeon, H. -R., Kang, S. -H., Choi, S. -S., Kim, E. -S. Cloning and Heterologous Expression of a Large-sized Natural Product Biosynthetic Gene Cluster in Streptomyces Species. Frontiers in Microbiology. 8, 1-10 (2017).
  36. Zhang, J. J., Tang, X., Moore, B. S. Genetic platforms for heterologous expression of microbial natural products. Natural Product Reports. 36 (9), 1313-1332 (2019).
  37. Alduina, R., et al. Artificial chromosome libraries of Streptomyces coelicolor A3(2) and Planobispora rosea. FEMS Microbiology Letters. 218 (1), 181-186 (2003).
  38. Jones, A. C., et al. Phage P1-Derived Artificial Chromosomes Facilitate Heterologous Expression of the FK506 Gene Cluster. PLoS One. 8 (7), 69319(2013).
  39. Gomez-Escribano, J. P., Bibb, M. J. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology. 4 (2), 207-215 (2011).
  40. Cannell, R. J. P. Natural Products Isolation. , Humana Press. Totowa, NJ. (1998).
  41. Kersten, R. D., et al. A mass spectrometry-guided genome mining approach for natural product peptidogenomics. Nature Chemical Biology. 7 (11), 794-802 (2011).
  42. Kersten, R. D., et al. Glycogenomics as a mass spectrometry-guided genome-mining method for microbial glycosylated molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (47), 4407-4416 (2013).
  43. Liu, W., et al. MS/MS-based networking and peptidogenomics guided genome mining revealed the stenothricin gene cluster in Streptomyces roseosporus. The Journal of Antibiotics. 67 (1), Tokyo. 99-104 (2014).
  44. Duncan, K. R., et al. Molecular Networking and Pattern-Based Genome Mining Improves Discovery of Biosynthetic Gene Clusters and their Products from Salinispora Species. Chemistry & Biology. 22 (4), 460-471 (2015).
  45. Cao, L., et al. MetaMiner: A Scalable Peptidogenomics Approach for Discovery of Ribosomal Peptide Natural Products with Blind Modifications from Microbial Communities. Cell Systems. , (2019).
  46. Chen, L. -Y., Cui, H. -T., Su, C., Bai, F. -W., Zhao, X. -Q. Analysis of the complete genome sequence of a marine-derived strain Streptomyces sp. S063 CGMCC 14582 reveals its biosynthetic potential to produce novel anti-complement agents and peptides. PeerJ. 7 (1), 6122(2019).
  47. Kim Tiam, S., et al. Insights into the Diversity of Secondary Metabolites of Planktothrix Using a Biphasic Approach Combining Global Genomics and Metabolomics. Toxins. 11 (9), 498(2019).
  48. Özakin, S., Ince, E. Genome and metabolome mining of marine obligate Salinispora strains to discover new natural products. Turkish Journal of Biology. 43 (1), 28-36 (2019).
  49. Trivella, D. B. B., de Felicio, R. The Tripod for Bacterial Natural Product Discovery: Genome Mining, Silent Pathway Induction, and Mass Spectrometry-Based Molecular Networking. mSystems. 3 (2), 00160(2018).
  50. Maansson, M., et al. An Integrated Metabolomic and Genomic Mining Workflow To Uncover the Biosynthetic Potential of Bacteria. mSystems. 1 (3), 1-14 (2016).
  51. Blin, K., Kim, H. U., Medema, M. H., Weber, T. Recent development of antiSMASH and other computational approaches to mine secondary metabolite biosynthetic gene clusters. Briefings in Bioinformatics. 20 (4), 1103-1113 (2019).
  52. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS-NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  53. Tatsuno, S., Arakawa, K., Kinashi, H. Analysis of Modular-iterative Mixed Biosynthesis of Lankacidin by Heterologous Expression and Gene Fusion. The Journal of Antibiotics. 60 (11), Tokyo. 700-708 (2007).
  54. Helfrich, E. J. N., Piel, J. Biosynthesis of polyketides by trans-AT polyketide synthases. Natural Product Reports. 33 (2), 231-316 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Moleküler Ağ OluşturmaTüm Genom DizilemeBiyosentetik Gen KümeleriHeterolog EkspresyonLC-MS/MS AnaliziGNPS VeritabanıKimyasal Yapı Aydınlatma
Yeni Doğal Ürünleri Ortaya Çıkarmak İçin Bir Araç Olarak Kütle Spektrometresi Güdümlü Genom Madenciliği
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.