Bir protokol mesane, prostat, cinsel organlar, kemik, kas ve ayak derisi de dahil olmak üzere fare alt vücut, yerinde perfüzyon için açıklanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Alt Karın Organları nın ve Arka Ekstremitelerin Situ Kapalı Devre Perfüzyonunun Oluşturulması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Ex vivo perfüzyon izole organların işlevini incelemek için önemli bir fizyolojik araçtır (örneğin karaciğer, böbrekler). Aynı zamanda, fare organlarının küçük boyutu nedeniyle, kemik ex vivo perfüzyon, mesane, cilt, prostat, ve üreme organları zor ya da mümkün değildir. Burada, ilk kez yukarıdaki dokuları içeren farelerde bir in situ alt vücut perfüzyon devresi rapor, ancak ana temizleme organları atlar (böbrek, karaciğer, ve dalak). Devre iliak arter ve ven üzerinde abdominal aort ve inferior vena kava cannulating ve periferik kan damarları cauterizing tarafından kurulur. Perfüzyon perfusate akışı ile peristaltik bir pompa ile yapılır 2 saate kadar. Floresan lektin ve Hoechst çözeltisi ile yerinde boyama mikrovaskülatür başarıyla perfüzyon olduğunu doğruladı. Bu fare modeli patolojik süreçlerin yanı sıra ilaç dağıtım mekanizmaları, tümör içine / tümör den dolaşımdaki tümör hücrelerinin göç / metastaz ve perfüzyon organ ve dokular ile bağışıklık sisteminin etkileşimleri incelemek için çok yararlı bir araç olabilir.
Giriş
İzole organ perfüzyonu ilk olarakorganfizyolojisi 1,2,3olmak üzere geliştirilmiş ve diğer vücut sistemlerinden müdahale edilmeden organların fonksiyonlarının anlaşılmasını sağlamıştır. Örneğin, izole böbrek ve kalp perfüzyonu hemodinamik ve vazoaktif ajanların etkileri nin temel ilkelerini anlamada son derece yararlı oldu, karaciğer perfüzyonu metabolik fonksiyonu anlamak için önemli olduğu ise, sağlıklı ve hastalıklı doku ilaç metabolizması da dahil olmak üzere4,5,6,7. Buna ek olarak, perfüzyon çalışmaları transplantasyon alabilme amaçlı organların canlılığını ve işlevini anlamada kritik öneme sahip oldu. Kanser Researchearch yılında, izole tümör perfüzyon fare kullanarak çeşitli gruplar tarafından tarif edilmiştir, sıçan, ve taze rezeke insan dokuları8,9. Bazı izole tümör perfüzyon, tümör mezenter arter10kan damarları temin eden tümörün büyümesini zorlamak için yumurtalık yağ pedi implante edildi. Jain grubu tümör hemodinamik ve metastazanlamakiçin kolon adenokarsinomların izole perfüzyon kullanarak öncü çalışmalar yaptı 8,11,12,13. Diğer yenilikçi mühendislik ex vivo kurulumları kültür birincil insan multipl miyelom hücreleri14 ve mühendislik kemik iliği mimarisi ve fonksiyon araştırma15için modüler bir akış odası için 96-iyi plaka tabanlı perfüzyon cihazı içerir.
Fizyoloji ve patoloji çalışmalarının yanı sıra, organ perfüzyonu ilaç dağıtımının temel ilkelerini incelemek için de kullanılmıştır. Böylece, bir grup izole sıçan ekstremite perfüzyonu açıklanan ve implante sarkomlarda lipozombirikimi okudu16, başka bir grup nano tanecikleri endotel hedefleme çalışması için insan böbrek perfüzyon diseksiyon yapıldı17. Ternullo ve ark. yakın-in-in vivo cilt ilaç penetrasyon modeli olarak izole perfüzyon insan deri flep kullanılır18.
Büyük organ ve dokuların perfüzyonbu gelişmelere rağmen, farelerde situ perfüzyon modellerinde hiçbir rapor olmuştur: a) karaciğer, dalak ve böbrekler gibi sızma temizleme organları; b) pelvik organlar, deri, kas, üreme organları (erkek), mesane, prostat ve kemik iliği içerir. Bu organların küçük boyutu ve temin vaskülatür nedeniyle, ex vivo kanülasyon ve perfüzyon devresi kurulması mümkün olmamıştır. Fare kanser ve immünoloji araştırmalarında en önemli hayvan modeli, ve ilaç teslim. Küçük fare organları perfuse yeteneği bu organlara ilaç teslimi ile ilgili ilginç sorular sağlayacak, pelvis implante tümörler de dahil olmak üzere (mesane, prostat, yumurtalık, kemik iliği), cevaplanması, yanı sıra temel fizyoloji ve bu organların hastalıkların immünoloji çalışmaları. Bu eksikliği gidermek için, farelerde doku yaralanmasını önleyebilecek ve izole organ perfüzyonuna göre fonksiyonel araştırmalar için çok daha uygun olan bir in situ perfüzyon devresi geliştirdik.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm yöntemler Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Perfüzyon sistemini önceden ısıtın
- Şekil 1A'daözelleştirilmiş bir konfigürasyonda gösterildiği gibi tüm su ceketli bileşenler (perfusate rezervuar, nemli hazne ve kapak) için 37 °C sirkülasyon su banyosu başlatarak ameliyattan önce perfüzyon sistemini hazırlayın. Tüpün temiz olduğundan emin olun ve gerekirse değiştirin. Perfusate hacmini sınırlamak için, perfusate rezervuarı olarak nemli bir hazne içinde bir kabarcık kapanı kullanın(Şekil 1B-6).
2. Vasküler kateterizasyon
- 8-10 haftalık BALB/c faresinde %3-5 izofluran ve oksijen akış hızı 0,3 L/dk olan bir isofluran veteriner anestezi makinesi kullanarak anestezi yi tirin. Alternatif olarak ketamin/ksilazin veya başka bir intraperitoneal anestezi türünü kullanın. Anestezinin derinliğini 2 yöntemle değerlendirin: ayak ucutu ve kornea refleksi.
- Önceden 4-0 ipek dikiş ile iğne ile çift distile suda.
- Anestezili fareyi, başı cerraha bakacak şekilde strafor tahtasıüzerinde bir supine pozisyonda yerleştirin ve ön uvsi ve arka uzuvları bantla hareketsiz hale getirin. Isopropil alkol ile karın silin ve makas ile bir "T" şeklinde orta hat boyunca karın kesti. Elektrokoagülasyon (koterizasyon) ile kesi kenarına doğru kanamayı durdurun.
- Karın aort ortaya çıkarmak için karın sağ tarafına mide, jejunum ve kolon itin, vena kava, ve yaygın iliak ve iliolombbar arterler ve damarlar.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, bulmak ve erkek iliolombbar arter / ven, ve yumurtalık arter / ven ve kadın iliolombbar arter / ven kullanarak 4-0 ipek sütür(Şekil 2 sarı çizgiler).
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, abdominal aort ve inferior vena kava altında iki 4-0 ipek dikişdöngü (iliak arter ve ven üzerinde yaklaşık 1 cm, 1 mm arayla, Şekil 2), ve iliak damarlara en yakın dikiş gevşek bir düğüm yapmak(Şekil 2, beyaz noktalı çizgi). Alternatif olarak, bir 6-0 ipek dikiş bu düğüm için kullanılabilir.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, yatay hizalamak ve porte-aiguille ile hem inferior vena kava ve abdominal aort germek. Karın aortuna saplamak için 24 G kanatlı i.V. kateter kullanın, iğne çekirdeğini geri çekmek için düğmeye basın ve kateteri damara yaklaşık 5 mm takın.
- Inferior vena kava ile aynı işlemi tekrarlayın ve kateterize damarların etrafında her iki sütür düğümkadar kravat.
NOT: İğne kolayca kan damarı ile delinebilir; bu nedenle, damarları gerilmiş ve iğne damar ile paralel tutun. İğne yaklaşık 1 mm'lik damara girer girmez iğne çekirdeğini geri çekin. Abdominal aort inferior vena kava altında ve çok daha ince ve daha elastik nedeniyle bağ dokusu kaplı olması. Bu nedenle, aort kateter "tutun" ve böylece kateter kayma olasılığını azaltmak için vena kava önce kateterize edilmelidir.
- Inferior vena kava ile aynı işlemi tekrarlayın ve kateterize damarların etrafında her iki sütür düğümkadar kravat.
- Kateterleri erector spinae'ye hareketsiz hale getirmek için anlık tutkal uygulayın, karın organlarını değiştirin ve anesteziyi sürdürürken ameliyatı sonlayın.
NOT: Karın boşluğuna tamamen değiştirilemeyen organların perfüzyon işlemi sırasında perfüzyon ortamı ile periyodik olarak nemlendirilmesi gerekir.
3. Perfüzyon sistemini kurmak
- Fareyi silikon ped üzerinde 37 °C'ye ısıtılan su ceketli nemli hazneye aktarın ve kateter kanatlarını 19 G iğneyle pede yerleştirin.
- Arteriyel kateterin ucunu (giriş) önceden ısınmış perfüzyon tamponuyla doldurun (Ringer'ın laktat çözeltisi %5 BSA ile desteklenir) ve ardından kateter ucunu vidalı konektör kullanarak giriş perfüzyon borusuyla bağlayın(Şekil 1B, kırmızı ok).
NOT: Konektörü hemostatik forceps ile tutun ve kateterlerin hareket etmesini önlemek için tüpü bantla hareketsiz hale getirin. - Peristaltik akış hızını 0,6 mL/dk'ya ayarlayın ve perfüzyon çıkışını(Şekil 1B, mavi ok) 5-10 dakika açık uçlu tutun venöz kateterden kanı temizleyin. Çıkış kateterinde pıhtılar olacak; perfüzyon devresini kapatmadan önce pıhtıları perfusate tamponu ile dışarı atın.
- Venöz kateterin ucunu vidalı konektör kullanarak çıkış borusu ile bağlayın ve devreyi kapatın(Şekil 1B). Bu noktada, CO2 gaz ötenazi yapmak ve göğüs delinmesi veya başka bir yöntemle doğrulayın.
- Isıtılmış kapak ile nemli haznesini kapatın. Perfusate düzeyini periyodik olarak kontrol edin ve gerekirse daha fazlasını ekleyin. Perfüzyon 2 saate kadar yapılabilir.
NOT: Kapalı perfüzyon sistemini kurmak için 5 mL perfusat eki gerekecektir. Sızıntı veya ödem yoksa perfusat hacmi 1 mL'den az azalır ve ek tampon gerekmez. Periferik sirkülasyon trombüsünün neden olduğu ödemi önlemek için perfüzyonun ilk 10 dakikasında %0.002 heparin içeren perfüzyon tamponu kullanılabilir, ancak kesilerin kenarında sızıntıyı önlemek için heparin olmadan tampon olarak değiştirilmelidir. - Gerekirse, perfüzyon rezervuarına veya enjeksiyon portuna herhangi bir zamanda tercih edilen bir reaktif ekleyin(Şekil 1B-5). Örneğin, perfüzyon bitmeden önce hücre çekirdeğini 2 saat veya perfüzyon un bitiminden 30 dakika önce vasküler endotel hücrelerini lekelemek için 1 mg/mL DyLight 649-lektin 50 μL'lik 10 mg/mL Hoechst33342'nin 10 μL'si perfusata eklenebilir.
NOT: Kemik iliği ile Hoechst solüsyonu lekelemeye çalışılırsa, farelere ameliyattan 30 dakika önce önceden enjekte edilmesi gerekir. - Floresan reaktifler ile perfüzyon sonra, arka plan floresan en aza indirmek için başka bir 10 dakika perfüzyon tampon ile yıkayın.
4. Perfüzyon organlarının analizi
- Testis, prostat, mesane, uyluk kemiği, kas ve deri (örneğin, ayak) gibi organları toplayın. Yaklaşık 1 mm3 organ bir parça excise ve iki cam slaytlar arasında düzleştirin.
- DAPI/Cy5 uyarma ve emisyon filtrelerini kullanarak ters floresan konfokal mikroskop altında çalışma (uyarma lazerleri : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). 0,45 sayısal diyafram açıklığı ile en az 200x büyütme hedefi kullanın.
- Alternatif olarak, 24 saat için% 4 formaldehit çözeltisi ile organları düzeltmek ve hematoksilin-eozin boyamagerçekleştirmek 19.
- Bozulmamış kemik iliği gözlemi için bir kemik penceresi oluşturmak için, femur veya tibia her iki ucunu immobilize ve periost ortaya çıkarmak için bir 19 G iğne lateral kenarı ile kortikal kemik kazımak; kalıntı kemik ince bir tabaka tutmaya özen. Yukarıda açıklandığı gibi DAPI ve Cy5 kanallarını kullanarak ters floresan konfokal mikroskopla cam ve görüntüye bakan pencere ile bir kapak fişinin üzerine kemik yerleştirin. Kemik iliği boşluğundaki hücreler ve vasküler ağ kolayca gözlemlenebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Perfüzyon tamponunun hacmini 10 mL'den az tutarken abdominal aort ve 8-10 haftalık farelerin inferior vena kavasının kanülasyonu ile kapalı devre perfüzyon sistemi kurduk. Şekil 3A, Ringer'ın Hoechst 33342 ve DyLight 649-lektin içeren çözeltisi ile dokuları perfüzyonladıktan sonra konfokal görüntüler gösterir. Kas, kemik iliği, testis, mesane, prostat ve ayak derisi etkili nükleer ve vasküler boyama göstermektedir. Şekil 3B, normothermik perfüzyondan 3 saat sonr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Açıklanan devre çeşitli araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir, örneğin ilaç dağıtımında farklı serum bileşenleri ve doku bariyerlerinin rolü, ya da bağışıklık ve kök hücre ticareti. Farklı ilaç dağıtım sistemleri (örneğin, lipozomlar ve nano tanecikleri) teslimatta fizyolojik ve biyokimyasal faktörlerin rolünü anlamak için perfusata eklenebilir. Perfüzyon süresi, incelenen doku, bilimsel hedefler ve perfusat bileşimine bağlı olarak değişebilir. Ringer'ın laktat ve albumin ile çözeltisini içeren temel perfüz...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Çalışma NIH hibe CA194058 tarafından DS, Skaggs School of Pharmacy ADR tohum hibe programı (DS) desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 31771093), Jilin Eyaleti Uluslararası İşbirliği Projesi (No.201180414085GH), Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları, JLU Bilim ve Teknoloji Yenilikçi Araştırma Ekibi Programı (2017T-27, 2019TD-36).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman< / güçlü > | |||
| 3.5x-90x stereo zoom mikroskop, LED ışıklı bom standında | Amscope SKU | : SM-3BZ-80S | |
| Karbondioksit, USP | Airgas sağlık | 19087-5283 | |
| Konfokal mikroskop | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| FIAB | ile Tek Kullanımlık Steril Koter Kalemi | F7244 | |
| Nemli hazne kabarcık tuzağı (Şekil 1'deki bölüm 6) | Harvard Aparatı | 733692 | Perfisate kabı olarak özelleştirilmiş; ayrıca sabit basınç perfüzyonunu da etkinleştirdi |
| Kuvars pencereli nemli hazne kapağı (Şekil 1'deki bölüm 3) | Harvard Aparatı | Odanın sıcaklığını korumak | 733524 |
| Metal borulu ısı eşanjörlü nemli oda | Harvard Aparatı | 732901 | Perfüzat ve fare sıcaklığını korumak için kapaklı su ceketli nemli hazne |
| Sütür kesicili Olsen-Hegar iğne tutucular | Güzel Bilim Araçları (FST) | 125014 | |
| Oksijen sıkıştırılmış, USP | Airgas sağlık hizmetleri | C2649150AE06 | |
| Makaralı pompa (Şekil 1'deki bölüm 4) | Harvard Nemli | haznedeki | |
| kanüle perfüzat vermek 730113 aparatıSCP plugsys servo kontrolü F/Perfüzyon (Şekil 1'deki bölüm 1) | Harvard Aparatı | 732806 | purfüzyon hızını kontrol edin |
| Silikon ped | Harvard Aparatı | ||
| Silikon boru seti (Şekil 1'deki oklar) | Harvard Aparatı (TYGON) | 733456 | |
| Öğrenci standart desen forseps | Güzel Bilim Araçları (FST) | 91100-12 | |
| Cerrahi Makas | Güzel Bilim Araçları (FST) | 14001-14 | |
| Nemli oda için masa | Harvard Aparatı | 734198 | |
| Termorekatör (Şekil 2'deki bölüm 1) | Harvard Aparatı | 724927 | tüm su ceketli bileşenler için sirkülasyonlu su banyosu |
| Üç musluk (Şekil 1'deki bölüm 5) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veteriner anestezi makinesi | Yayla | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide iğnesi | BD | 305186 | Insyte Autoguard Kanatlı iğneyi hareketsiz hale getirmek ve kortikal kemiği çizmek için |
| 4-0 ipek sütürler | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 ipek sütürler | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filtresi ( 0.2 ve mikro; m) | ThermoFisher | 42225-CA | Filtresi S |
| Kalıcı işaretleyici | Staedtler | 342-9 | |
| Şırınga (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Şırınga (60 mL) | BD | 309653 | %5 BSA-RINGER' için filtre S |
| Reaktifler< / güçlü> | |||
| % 1 Evans mavisi (w / v ) fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.5) içinde | Sigma | 314-13-6 | |
| %10 tamponlu formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c fareler (8-10 haftalık) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex laktat Ringer'ın çözümü | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Sığır serum albümini | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | Krazy Tutkal | ||
| DyLight-649-lektin | Vektör Laboratuvarları, Inc. | ZB1214 | |
| Etanol (%70 (hacim/hacim)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Yaşam Teknolojileri | H3570 | |
| İzofluran | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Fosfat tamponlu tuzlu su | Gibco | 10010023 |
Kaynaklar
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
