Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

6.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/60848

⸱

30 Ocak 2020

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Özet

Klamidya trachomatis genetik olarak manipüle etmek tarihsel olarak zor olmuştur zorunlu bir hücre içi patojendir. C. trachomatis oluşturmak ve ayrıcalıklı bir hücre içi niş korumak için kullandığı mekanizmaları açıklığa kavuşturma kesin ilerleme genetik araçların eksikliği nedeniyle sınırlı olmuştur. Neyse ki, son zamanlarda genetik manipülasyon teknikleri birkaç yeni gelişmeler olmuştur. Bunlar arasında floresan bildirilen allelik değişim mutagenezinin (FRAEM) gelişimi bulunmaktadır. Bu yöntem, antibiyotik direnci ni kodlayan bir seçki kaseti ve yeşil floresan protein (GFP) ile birleştiğinde hedeflenen gen silme işlemine olanak sağlar. Polikistronik operoniçindeki genleri hedef alırken bu stratejiye güvenmek, akım üstü genler üzerindeki polar etkilerin potansiyeli nedeniyle karmaşık olabilir. Floxed kaset allelic değişim mutagenezi (FLAEM), burada açıklanan protokol, kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için geliştirilmiştir. FLAEM, allelik değişim ile hedeflenen silme işleminden sonra seçim kasetini çıkarmak için Cre-loxP genom düzenlemesini kullanır. Ortaya çıkan suşlar, bir veya daha fazla kodlama dizisinin belirteçsiz gen silmelerini içerir. Bu teknik gen fonksiyonunun doğrudan değerlendirilmesini kolaylaştırır ve C. trachomatis genetik manipülasyon için araçların repertoire genişletir.

Giriş

Klamidya trachomatis bakteriyel cinsel yolla bulaşan hastalığın önde gelen nedenidir ve insan sağlığı için önemli bir yük temsil eder. 100 milyondan fazla insan her yıl C. trachomatis1ile enfekte. Kadınlarda enfeksiyonların yaklaşık % 70'i pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve/veya kısırlık gibi zararlı üreme sağlığı etkilerine rağmen asemptomatiktir. Hastalık sekeli doğrudan C. trachomatis enfeksiyonu2tarafından başlatılan immünopatoloji ile ilişkilidir. Etkili bir aşı henüz geliştirilmemiştir; bu nedenle, bakteriyel virülans faktörlerinin ve diğer bakteriyel gen ürünlerinin işlevini anlamak önemli ve acil bir araştırma sorusudur.

Hücre içi bakteriler olarak, konak hücre istilası, hücre içi replikasyon, singeny salınımı, ve konak immünolojik yanıtların kaçamak kritik süreçlerdir. C. trachomatis hücre içi gelişim için bir inklüzum olarak adlandırdığı parasitophorous membran bağlı vauol oluşturur. Dahil edilmesi ve diğer birçok kritik sürecin oluşturulması, efektör proteinlerin tip III salgı sistemi (T3SS)3ile salgılanması ile sağlanır. Bu gizli efektörlerin işlevlerini açıklamak C. trachomatisgenetik inatçılığı nedeniyle uzun yıllar sınırlı kaldı. E. coliaksine, birçok klasik klonlama teknikleri Klamidyaiçin geçerli değildir. Birkaç büyük sınırlamalar dönüşüm verimliliği, sacB gibi karşı seçim muhabirleri eksikliği ve plazmid bakım içerir. E. coli plazmidler genellikle çoğaltma ve uygun seçici basınç kaynağı ile süresiz olarak muhafaza edilebilirken, C. trachomatis plasmids l2 serovar içinde yerli pL2 plazmid bulunan bakım için ek sekiz açık okuma çerçeveleri(pgp1-8) gerektirir4.

Son yıllarda chlamydia eşsiz biyoloji karşılamak birden fazla genetik araçlar üretilmiştir, henüz hala sınırlamalar vardır5,6,7. Etil metansülfonat (EMS) tedavisi ile kimyasal mutagenez yanlış mutasyonlar ortaya çıkarabilir, ya da (daha az sıklıkta) nükleotit geçişleri saçma bir mutasyon verim için erken bir stop codon tanıtan neden olabilir8. Transposon ekleme gen bozulması için verimli, ancak Klamidya araştırma mevcut teknoloji zahmetli ve zaman alıcı9. Hem EMS tedavisi hem de transposon mutagenez teknikleri rastgele mutasyonlar oluşturur ve mutant suşları izole etmek için sıkı tarama yöntemleri gerektirir. Grup II intronlar (örneğin, TargeTron) yerleştirerek genleri bozmak için bir yöntem yönlendirilmiş mutagenezi sağlar; ancak, bu yöntem verimlilik ile sınırlıdır ve ekleme sitesi her zaman düzgün10tahmin edilmez.

Floresan bildirilen allelic değişim mutagenez (FRAEM) antibiyotik direnci ve floresan muhabiri11sağlayan bir seçim kaset ikime ile birleştiğinde hedeflenen gen silme için kullanılan bir stratejidir. Ancak FRAEM, özellikle poliksit operonlar içindeki genleri hedef alırken, kasetin indüklediği polar etkilerin akıntı genleri üzerindeki potansiyeli ile karmaşıktır. Floxed kaset allelic değişim mutagenez (FLAEM) daha önce FRAEM seçim kaseti 12 ile gözlenen kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için geliştirilen yeni bir genetik yaklaşımdır12. FLAEM, seçim kasetini kaldırmak ve akış aşağı genlerin ekspresyonunu geri getirmek için Cre-loxP genom düzenlemesini kullanır. Antibiyotik direnci ve yeşil floresan protein (GFP) içeren seçim kaseti, yan loks p siteleri ile yeniden yapılandırılır. Bu loxP siteleri Cre rekombinaz varlığında yeniden birleşebilir ve genom13kaseteksizyonu ile sonuçlanabilir. Bu strateji silme için tmeA hedeflenirken kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için gösterilmiştir12,14.

Hem FRAEM hem de FLAEM yöntemleri pgp6'nın indüklenebilir ekspresyonu ile koşullu olarak muhafaza edilebilen aynı intihar vektörü olan pSUmC 4.0'ı kullanır. Pgp6 ekspresyonu daha önce plazmid tutma için gerekli olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle plazmid bakım kontrol etmek için kaldıraçlı11,15. C. trachomatis pgp6 ekspresyonu indüklemek için susuz tetrasiklin (aTc) ile desteklenen ortamda yetiştirilen zaman, vektör korunur. ATc yokluğunda, vektör kaybolur. Hedeflenen gen deleksiyonu, genin seçilim kaseti için allelik değişimi ile elde edilir. Hedeflenen genin 3 kb bölgesi doğrudan yukarı ve aşağı akım rekombinasyon için homoloji kollar olarak hizmet vermektedir. Bu kollar seçilim kasetini çevreleyen pSUmC 4.0 vektörüne klonlanır. Başarılı C. trachomatis dönüşümü ve rekombinasyon olayları floresan raporlama ile gözlenmektedir. Vektör omurgave gfp üzerinde mCherry ifadesi seçim kaset ivedikırmızı ve yeşil floresan eklemeler verim. ATc kültür medyasından çıkarıldıktan sonra, sadece yeşil eklemeler intihar vektörünün kaybı ve seçim kasetinin bakteri genomuna entegrasyonu ile başarılı rekombinasyon olaylarını gösterir.

FLAEM, Cre rekombinaz ifade eden vektör pSU-Cre'nin yeni oluşturulan mutant türüne dönüştürülmesi yoluyla FRAEM'in bir uzantısını temsil eder. Cre rekombinaz loxP siteleri arasında rekombinasyon ve seçim kaseteksizyonu kolaylaştırır. Rekombinasyon olayları floresan raporlama ile gösterilir. pSU-Cre vektörü mCherry'yikodlar; böylece, gfp-ifade içermeler kırmızı floresan eklenmesi ile başarılı dönüşüm gösterilir. LoxP sitelerinde Cre aracılı rekombinasyon ile kaset sonuçları için seçici basınç yokluğunda ekimi ve kaset kaybı kırmızı sadece eklemeler ile gösterilir. pSUmC-4.0'da olduğu gibi pGP6'nın indüklanabilir ifadesi pSU-Cre'yi koşullu olarak korumak için kullanılır. ATc ve antibiyotik seçimi çıkarıldıktan sonra, plazmid tedavi edilir, ve ortaya çıkan markerless silme zorlanma nonfloresan olduğunu. Bu yöntem, kasetkaynaklı polar etkiler sorununu ele adatır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İlgi Genine Özgü Homoloji Kolları ile pSUmC-4.0'ın Tasarımı ve Montajı

  1. Homolog rekombinasyon için 5' ve 3' homoloji kolları olarak hizmet vermek üzere silme hedeflenen genin ~3 kb bölgelerini doğrudan yukarı ve aşağı doğru tanımlayın(Şekil 1).
  2. Tasarım PCR astarlar 1) klamydial genomik DNA 3 kb 5'homoloji kolu yükseltmek ve 2) 15-30 bp çıkıntı pSUmC-4.0 sindirilir zaman Sall restriksiyon enzim sitesinde özgü içerir. pSUmC-4.0 ile örtüşen astar bölgelerinin 55 °C'lik erime sıcaklıklarına ve tüm astar için saç tokası erime sıcaklıklarının <35 °C olduğundan emin olun.
  3. Tasarım PCR astarlar 1) klamydial genomik DNA 3 kb 3'homoloji kolu yükseltmek ve 2) 15-30 bp çıkıntı pSUmC-4.0 için sindirilir zaman SbfI restriksiyon enzim sitesinde özel içerir. pSUmC-4.0 ile örtüşen astar bölgelerinin 55 °C'lik erime sıcaklıklarına ve tüm astar için saç tokası erime sıcaklıklarının <35 °C olduğundan emin olun.
  4. Bir DNA montaj reaksiyonu16sonra pSUmC-4.0 vektöriçine her homoloji kolunun ekleme yükseltmek olacak Tasarım PCR tarama astarları . Ekleme başarısız olsa bile bir PCR ürününün kolay görselleştirilmesine olanak sağlamak için bu astarları kısıtlama sitelerinin dışında ~500 bp'ye tasarlayın(Şekil 1).
  5. 3 kb 5' ve 3' homoloji kollarını pcr tarafından yeni çıkarılan klamydial genomik DNA'dan bir ila iki reaksiyonla yükselterek daha sonraki DNA montajı için yeterli parçayı verimlendirin. Belirli reaksiyon kurulum ve bisiklet koşulları için DNA polimeraz üreticisinin protokolünü uygulayın.
  6. Her iki PCR ürünün de doğru boyutta olduğunu ve reaksiyonların herhangi bir kirletici bant içermediğini doğrulayın. Her PCR reaksiyonunun %1'ini %1'lik bir DNA agarose jelüzerinde çalıştırın.
  7. PCR parçalarını fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltisi ile arındırın ve konsantre edin.
    1. Tüm 3' PCR reaksiyonlarını 1,5 mL'lik bir tüpte bir araya getirin ve nükleaz içermeyen H2O. 5' PCR reaksiyonları için bu işlemi tekrarlayın.
    2. Her tüp ve girdap için 200 μL fenol ekleyin 30-60 s. Oda sıcaklığında 20 dakika için >21.000 x g mikrocentrifuge her tüp spin (RT).
    3. Her tüpün sulu faz üst tabakasını yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın, her tüpe 3 M sodyum asetat hacminin onda birini ekleyin, sonra karıştırmak için hareket ettirin.
    4. Her tüp ve karıştırmak için flick% 100 etanol 3 cilt ekleyin. Her iki tüpü de -80 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.
    5. Her tüpü n için 5 dk için >21.000 x g'de döndürerek DNA'yı peletleyin.
    6. DNA peletini %70 etanolün 100 μL'si ile yıkayın. Her tüpü >21.000 x g'de RT'de 5 dk çevirin.
    7. DNA peletini %100 etanol100 μL ile tekrar yıkayın. Her tüpü 5 dk için >21.000'de döndürün.
    8. Pelet tamamen hava kurumasını bekleyin, sonra 12 μL nükleaz içermeyen H2O'da dna'yı karıştırmak için hareket ettirerek hafifçe yeniden askıya alın.
  8. Üretim protokolüne göre 1 birim Sall ve 1 birim SbfI ile 20°L reaksiyonda 500 ng pSUmC-4.0 vektörünü sindirin. Vektörün tam sindirimini sağlamak için reaksiyonu yaklaşık 3 saat veya gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  9. Daha önce açıklandığı gibi sindirilmiş omurgayı fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltisi ile arındırın ve yoğunlanın (adım 1.7.1-1.7.9).
  10. Sindirilmiş pSUmC-4.0 vektörü ve 5' ve 3' homoloji kolu PCR ürünlerini 0,01 pmol pSUmC-4.0 ile 0.09 pmol her homoloji kolu oranında birleştirin. Parçaları, üretim protokolüne göre DNA montaj reaksiyonunda birleştirin.
  11. 50 μL elektro-beceriksiz E. coli'yi 1 μL DNA montaj reaksiyonu ile dönüştürün. Plaka başına 150 μL yayarak 100 μg/mL spektinomisin içeren LB agar plakaları üzerine dönüştürülmüş E. coli plakasını plakalayın. Plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  12. Ertesi gün, bir epifloresan ters mikroskop kullanarak yeşil ve kırmızı floresan için ekran kolonileri. Agar plakabaşına toplam 5-30 koloni bekleniyor.
  13. 100 μg/mL spectinomisin ile desteklenen 4 mL LB suyu aşılamak için 5-10 koloni seçin. 250 rpm sallayarak 37 °C'de bir gecede kültürleri kuluçkaya yatırın.
  14. Gecede E. coli kültürleri kullanarak, küçük ölçekli DNA arıtma gerçekleştirin. 50 μL çekirdeksiz H2O ile DNA'yı ezle.
  15. Her homoloji kolunun, her eklemeyi yükseltmek için PCR tarama astarlarını (adım 1.4'te tasarlanmış) kullanarak pSUmC-4.0 vektörüne yerleştirilmelerini onaylayın. DNA montajı başarılı olursa, hem 5' hem de 3' kol bölgeleri için %1'lik BIR DNA agarose jelinde ~4 kb PCR ürünü gözlenmelidir. ~1 kb PCR ürün ekleme eksikliğini gösterir.
    NOT: Çift parçalı montaj reaksiyonunda homoloji kollarının takılması başarısız olursa, 5' kol sonra 3' kol, tek tek eklemek için iki montaj reaksiyonu gerçekleştirin. 5' kol ile montaj önce sadece Sall ile vektör sindirin, sonra 3 'kol monte etmek için SbfI ile vektör sindirmek.
  16. Transform baraj-/dcm- pSUmc-4.0 200 ng ile yetkin E. coli her iki homoloji kolları ile monte. Dönüştürülmüş bakterileri, plaka başına 25 μL yayarak 100 μg/mL spektinomisin içeren LB agar plakalarına plakalayın. Plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Toplam 20-200 koloni bekleniyor.
  17. Adım 1.13'te açıklandığı gibi kırmızı ve yeşil floresan koloniler için plakaları tarar.
  18. Kırmızı ve yeşil kolonilerle 100 μg/mL spektinomisin içeren 100 mL LB suyu aşılayarak büyük ölçekli DNA arınması için bir kültür ayarlayın. 250 rpm sallayarak 37 °C'de bir gecede kültürü kuluçkaya yatırın.
  19. Kültürü hasat ve büyük ölçekli DNA arınması kullanarak DNA arındırmak.
    1. NF-H2O'nun 100 μL'inde saflaştırılmış plazmid DNA'sını yeniden askıya alın. C. trachomatis dönüşümü için en az 2 μg/μL toplam DNA verimi idealdir.
    2. Sıra5' ve 3' homoloji kol bölgeleri pSUmC-4.0 içine doğru montaj sağlamak için C. trachomatisdönüştürmeden önce .

2. Allelik Exchange ile Gen Deletion için pSUmC 4.0 + Homoloji Kollar ile C. trahommatis Dönüşümü

  1. Tohum McCoy hücreleri, fare fibroblastlar standart Klamidyayetiştirmek için kullanılan , iki içine 6 kuyu plakaları (1 x 106 hücreleri / iyi) büyüme medya #1. Plakaları 37 °C'de %5 CO2 ile tek tabaka konçerto olana kadar (yaklaşık 24 saat) kuluçkaya yatırın.
  2. 1,5 mL'lik bir tüpte, 2 moi'de 6 kuyuluk 12 kuyuya bulaşmaya yetecek c. trachomatis WT serovar L2 temel gövdelerinin (EBs) bir hacmini ekleyin. Pellet EBs >20,000 x g 30 dk için, sonra supernatant atın.
  3. EB'leri 600 μL CaCl2 tamponunda hafifçe donatarak ve tüpe 24 μg pSUmC-4.0 + homoloji kollarını ekleyerek klamydial dönüşümü başlatın. Yavaşça flicking tarafından çözeltikarıştırın. RTfor 30 dk tüp kuluçka ve her 10 dakika karıştırmak için flick.
  4. Transformasyon çözeltisini Hanks'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 24 mL'sine ekleyin ve hafifçe pipetleme ile karıştırın. 6 kuyu plakasındaki uyumlu McCoy hücrelerinin her kuyuya 2 mL inokül aktarın ve 20 °C'de 1 saat için 900 x g'de santrifüj ile enfekte edin.
  5. Inoculum çıkarın ve 2 mL / iyi RPMI büyüme ortamı #2 ile değiştirin. Plakaları %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. En az 7 saat, ancak en fazla 12 saat sonra, #1 2 mL/well seçim ortamı ile medya değiştirin. Kuluçkaya 37 °C'de 48 saat boyunca enfeksiyon anına devam edin.
  7. Bakterileri mccoy hücrelerinin yeni bir monotabakasına alıp toplayın.
    1. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri ortama kaldırmak için McCoy monolayer'ı nazikçe kazıyın. Her kuyudan malzemeyi 2 mL'lik bir tüpe aktarın. 4 °C'de 30 dk için bir mikrocentrifuge >20.000 x g hücre malzemesi pelet.
    2. Supernatant'ı çıkarın ve atın. HBSS'nin 1 mL'lik hücre peletini hafifçe borulama ile yeniden askıya alın.
    3. 4 °C'de 5 dk için 200 x g'de hücre enkazını peletleyin. Süpernatant'ı yeni bir mccoy hücresi kuyuya aktarın. Toplam 2 mL/kuyu hacmi için her kuyuya 1 mL daha HBSS ekleyin.
    4. 20 °C'de 1 saat için 900 x g'de santrifüj ile enfekte edin. Enfeksiyondan hemen sonra inoculumu seçim ortamı #1 değiştirin.
  8. Kırmızı ve yeşil inklüzumlar epifloresan sokulmuş mikroskop 24 h post-enfeksiyon (24 hpi) kullanılarak tespit edilene kadar mccoy hücrelerinin taze bir monolayer üzerine bakteri passaging devam (bölüm 2.7) üç veya daha fazla pasajlar için her 48 h.
  9. Kırmızı ve yeşil eklemeler algılandıktan sonra, seçim ortamı #2 kullanarak monokatmanı (bölüm 2.7) geçirmeye devam edin.
  10. Sadece yeşil eklemeler tespit edilene kadar monolayer passaging devam 24 hpi (geçiş #3 veya daha sonra), hangi pSUmC-4.0 vektör kaybı ve genom içine loxP seçim kaseti dahil gösterir.
  11. Geçiş yaparak zenginleştirmek için sadece yeşil dahil bir kuyu seçin. Hasat ve aynı zamanda sakaroz-fosfat-glutamat tampon (SPG) sadece yeşil içermeiçeren diğer kuyuları dondurmak.
    1. Sadece yeşil içermeleri zenginleştirmek için, tek katmanı adım 2.7'de yapılan 6 kuyulu bir plakadan geçiş, ancak hücre enkazını (adım 2.7.3) peletledikten sonra, supernatant'ı HBSS'nin 12 mL'lik konik yapısına aktarın. Bu inoculum iyi başına 2 mL ekleyerek iki 6 kuyu plakaları bulaştırmak için kullanın, sonra 20 °C'de 60 dakika için 900 x g plakaları spin.
    2. Ek kuyuları dondurmak için, adım 2.7.1'deki gibi monolayer hasat, ancak HBSS yerine 1 mL KM KM'lik KM'lik peletleri yeniden askıya alın. Hücre enkazını (adım 2.7.3) peletve supernatant'ı 1,5 mL kriyotube'a aktarın. Malzemeyi -80 °C'de dondurun.
  12. 0.5-1.0 (tespit edildikten sonra bir ila iki pasaj) bir MOI yeşil sadece eklemeler zenginleştirdikten sonra, adım 2.11.2 açıklandığı gibi KMT içine monolayers hasat. 1,5 mL tüplerde 50 μL'lik aliquots alın ve -80 °C'de donun.
  13. Titrasyonprotokolü17'yegöre, dahil edilmeyi belirlemek için sadece yeşil bakterileri titre, oluşturan birimler/μL.

3. Seyreltme Sınırlayarak LoxP Kanatlı Seçim Kasetini İçeren Yeşil-sadece C. trachomatis Deletion Mutant Klonal İzolasyon

  1. Tohum 384 iyi doku kültür plaka sı mccoy hücreleri 50 μL ~ 2.000 hücreleri / iyi büyüme medya #1. 37 °C'de ~24 saat veya konfluent olana kadar %5 CO2 ile kuluçkaya yatırın.
  2. 20 mL başına ~50 EBs elde etmek için HBSS'de sadece yeşil bakterilerin bir aliquot seyreltin. Seyreltilmiş inoculumu bir rezervuar tepsisine aktarın.
    1. Tüm plakayı bir atık kabına ters çevirerek ortamı 384 kuyu plakasından çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyuya 50°L C. trachomatis inoculum ekleyin. 20 °C'de 1 saat için 900 x g'de santrifüj ile enfekte edin.
      NOT: Tek katmanlı ayırır o kadar sert flick değil dikkatli olun. Hücreler aşırı kabarık ise, daha kolay ayırılır.
  3. İnokülü flicking yaparak çıkarın ve 50 μL/well growth media #2 değiştirin. 37 °C'de %5 CO2ile kuluçka plakaları .
    NOT: Bu aşamada, seçim kasetinin genoma entegrasyonu stabildir, bu nedenle spektinomisin ile antibiyotik seçimine gerek yoktur.
  4. Plakayı 5-12 gün kuluçkaya yattıktan sonra, epifloresan ters mikroskop veya yüksek içerik tarama platformu kullanarak yeşil floresan dahil olan tek tek kuyuları belirleyin.
  5. Tek tabakayı p-10 ucuyla kazıyarak ve kuyunun tüm içeriğini 2 mL HBSS içeren bir tüpe aktararak sadece yeşil dahil edilen kuyuları hasat edin. Yavaşça karıştırın ve enfeksiyon için 6 iyi plaka taze bir confluent McCoy monolayer için inoculum 2 mL uygulayın.
    NOT: Tek tek kuyuları kapsayıcılarla tanımlarken, dahil etmeler ilk dahil etme dedahil inmeden kaynaklanan genişleme nedeniyle kümede olacaktır. Bir kuyunun birden çok kümesi varsa, başlangıçta birden fazla EB'nin bu kuyuya bulaşması olasıdır. Bu kuyular hasat edilmemelidir ve bazı durumlarda seri seyreltme ile klonal izolasyon birden fazla tur gerekli olabilir.
  6. 20 °C'de 1 saat için 900 x g'de 6 kuyu plakasını santrifüj ile enfekte edin. Inoculum'u 2 mL/kuyu büyüme ortamı #2 değiştirin. 37 °C'de % 5 CO2 ile 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  7. Klonal popülasyonları zenginleştirmek, dondurmak ve titretmek için 2.11-2.13 adımlarını tekrarlayın.
  8. Daha önce açıklandığı gibi qPCR kullanarak klonsal izole C. trachomatis hedefli genlerin silinmesini onaylamak12.

4. C. trachomatis FRAEM Mutant'ın pSU-Cre ile dönüşümü loxP Kanatlı Seçim Kasetinin Çıkarılmasını Başlatacak

  1. Daha önce açıklandığı gibi 6 kuyu plakadönüşüm sürecini tekrarlayın (adımlar 2.1-2.8) klonsal izole C. trachomatis FRAEM mutant kullanarak, pSU-Cre vektör, ve seçim medya #3.
    NOT: Başarılı bir dönüşüm kırmızı ve yeşil floresan eklemeler ile gösterilir.
    1. Tek katmanlı, sadece kırmızı dahil ler, seçim kasetinin (iki ya da üç pasaj) kaybını gösteren bir epifloresan ters mikroskop kullanılarak tespit edilene kadar geçiş yapın. Kırmızı yalnızca eklemeler ~0,5 MOI'ye zenginleştirilene kadar monokatmanı aktarmaya devam edin.
  2. Daha önce açıklandığı gibi 384 kuyuplakasında seyreltme sınırlayarak yalnızca kırmızı dahil leri klonlama (adım 3.1-3.8); ancak, tüm adımlar için seçim ortamı #3 kullanın.
  3. 0.1 MOI'a kadar geçerek klonal popülasyonları zenginleştirin. Zenginleştirildikten sonra, pSU-Cre vektörünün (yaklaşık 3-4 pasaj) kaybını başlatmak için bölüm ortamını büyüme ortamı #2 değiştirin.
  4. Klonsal olarak floresan olmayan bakterileri izole etmek (adım 3.1-3.8); ancak, eklemeleri algılamak için plakayı parlak alan mikroskobuyla elle taz.red. Bakterileri zenginleştirin ve dondurun (adım 2.11-2.12).
  5. Daha önce açıklandığı gibi kantitatif gerçek zamanlı PCR, Batı lekeleme ve tüm genom DNA Sıralama kullanarak mutant suşu için ekran12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

FLAEM kullanan C. trachomatis'te belirtilamayan gen delemesi yöntemi dikkatli klonlama ve dönüşüm tekniklerine bağlıdır. Başarılı allelic rekombinasyon önemli bir ilk adımdır ve pSUmC-4.0 klonlama vektörüne homoloji kollarının tanımlanmasını ve yerleştirilmesini gerektirir(Şekil 1). Belirtilmeden gen delemesi için önemli bir ikinci adım, Şekil 2'detemsil edilen Krem-lox genom düzenleme ile floresan muhabirinin ve antibiyotik seçim kasetinin çıkarılmasıd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

FLAEM tarafından C. trachomatis'de belirtilmeyen gen silmelerin üretimi için burada açıklanan protokol, gereksiz genlerin hedefli silinmesine izin verir ve kasetin neden olduğu polar etkileri ortadan kaldırır. Protokol, pSUmC 4.0 intihar vektörüne yerleştirilen 5' ve 3' homoloji kollarının dikkatli tasarımına, C. trachomatis'in etkin dönüşümüne ve izole mutant suşlarının dikkatli bir şekilde taranmasına dayanır. Bu yöntemle başarılı genom mühendisliği, floresan olmayan ve hedeflenen gen delemesi yerinde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, NIAID (a1065530 ve Al124649 hibe) K.A. Fields Halk Sağlığı Servisi hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseKSE ScientificBMK-A1705Moleküler Biyoloji Sınıfı
Anhidrotetrasiklin hidroklorürACROS Organics233131000
CaCl2 Tampon10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Kalsiyum Klorür Dihidrat
Kalsiyum Klorür DihidratSigmaC7902-500GHücre kültürü
için uygunSikloheksimidSigma7698-1G
baraj-/dcm- Yetkili E. coliNew England BioLabsC2925H
DMSOATCC4-XSteril filtrelenmiş hücre kültürü test edildi
Glutamik asitSigmaG8415-100GL-Glutamik asit
Büyüme Ortamı #1RPMI 1640 ortamı% 10 (hacim / hacim) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir.
Büyüme Ortamı #2RPMI 1640 ortamı, %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve 1 & mikro ile desteklenmiştir; g / mL sikloheksimid
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (1x)Gibco24020-117
Isıyla İnaktive Fetal Sığır Serumu Nitelikli Tek Atış (FBS)GibcoA38402-02
McCoy HücreleriATCCCRL-1696
Monarch Plazmid Miniprep KitiNew England BioLabsT1010SKüçük ölçekli DNA saflaştırması
NaH < sub > 2 < / sub>PO < sub>4< / sub>SigmaS3139-250GSodyum fosfat monobazik
Na2< / sub>HPO4< / sub>SigmaS5136-500GSodyum fosfat dibazik
NEB 10-beta Elektroyetkin E. coli< / em> HücrelerNew England BioLabsC3020K
NEBuilder HiFi DNA montajı Klonlama KitiYeni İngiltere BioLabsE5520SGibson Montaj Kiti
Penisilin G sodyum tuzuSigmaP3032-10MUHücre kültürüne uygun biyoreaktif
QIAGEN Plazmid Maxi KitiQIAGEN12162Büyük ölçekli DNA saflaştırması
Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli DNA PolimerazNew England BioLabsM0515Fragman PCR Polimeraz
RPMI 1640 Orta (1x)Gibco11875-0932mM L-glutamin
içeren Sall-HFNew England BioLabsR3138S
Sbfl-HFNew England BioLabsR3642S
Seçim Ortamı # 1RMPI 10% FBS, 1 ve mikro; g / mL sikloheksimid, 500 &mikro; g / mL spektinomisin ve 50 ng / mL susuz tetrasiklin DMSO
Seçim Ortamı # 2RMPI % 10 FBS, 1 & mikro; g / mL sikloheksimid, 500 &mikro; g/mL spektinomisin
Seçim Ortamı #3RPMI %10 FBS, 1 & g / mL sikloheksimid, 50 ng / mL aTc ve 0.6 & mikro; g / mL penisilin
Sodyum Asetat Tampon ÇözeltisiSigmaS7899-100ML3M
SOC Büyüme OrtamıNew England BioLabsB9020SVIAL
Spektinomisin dihidroklorür pentahidrat, Hücre Kültürü SınıfıAlfa AesarJ61820
SükrozSigmaS1888-1KGHücre kültürüne
uygun biyoreaktifSükroz-Fosfat-Glutamat Tamponu (SPG)37.5g sükroz, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2Psub4, 500 ml doku kültürü dereceli su için 0.36 glutamik asit
TrisAMRESCO0497-5KGUltrapure sınıf
Tripsin-EDTA (1x)Gibco25200-056%0.25
SuSigmaW3500-500MLSteril filtreli, BioReagent, Hücre kültürü için uygun

Kaynaklar

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239(2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343(2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989(2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817(2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479(2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640(2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142(2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Cre-loxP Genom DüzenlemeHomolog RekombinasyonDNA MontajıEpifloresan MikroskopiKantitatif PCRWestern BlottingTüm Genom Dizileme
Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.