Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion
Bu makalede
Özet
Özet
Klamidya trachomatis genetik olarak manipüle etmek tarihsel olarak zor olmuştur zorunlu bir hücre içi patojendir. C. trachomatis oluşturmak ve ayrıcalıklı bir hücre içi niş korumak için kullandığı mekanizmaları açıklığa kavuşturma kesin ilerleme genetik araçların eksikliği nedeniyle sınırlı olmuştur. Neyse ki, son zamanlarda genetik manipülasyon teknikleri birkaç yeni gelişmeler olmuştur. Bunlar arasında floresan bildirilen allelik değişim mutagenezinin (FRAEM) gelişimi bulunmaktadır. Bu yöntem, antibiyotik direnci ni kodlayan bir seçki kaseti ve yeşil floresan protein (GFP) ile birleştiğinde hedeflenen gen silme işlemine olanak sağlar. Polikistronik operoniçindeki genleri hedef alırken bu stratejiye güvenmek, akım üstü genler üzerindeki polar etkilerin potansiyeli nedeniyle karmaşık olabilir. Floxed kaset allelic değişim mutagenezi (FLAEM), burada açıklanan protokol, kaset kaynaklı polar etkileri hafifletmek için geliştirilmiştir. FLAEM, allelik değişim ile hedeflenen silme işleminden sonra seçim kasetini çıkarmak için Cre-loxP genom düzenlemesini kullanır. Ortaya çıkan suşlar, bir veya daha fazla kodlama dizisinin belirteçsiz gen silmelerini içerir. Bu teknik gen fonksiyonunun doğrudan değerlendirilmesini kolaylaştırır ve C. trachomatis genetik manipülasyon için araçların repertoire genişletir.
Giriş
Klamidya trachomatis bakteriyel cinsel yolla bulaşan hastalığın önde gelen nedenidir ve insan sağlığı için önemli bir yük temsil eder. 100 milyondan fazla insan her yıl C. trachomatis1ile enfekte. Kadınlarda enfeksiyonların yaklaşık % 70'i pelvik inflamatuar hastalık, ektopik gebelik ve/veya kısırlık gibi zararlı üreme sağlığı etkilerine rağmen asemptomatiktir. Hastalık sekeli doğrudan C. trachomatis enfeksiyonu2tarafından başlatılan immünopatoloji ile ilişkilidir. Etkili bir aşı henüz geliştirilmemiştir; bu nedenle, bakteriyel virülans faktörlerinin ve diğer bakteriyel gen ürünlerinin işlevini....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. İlgi Genine Özgü Homoloji Kolları ile pSUmC-4.0'ın Tasarımı ve Montajı
- Homolog rekombinasyon için 5' ve 3' homoloji kolları olarak hizmet vermek üzere silme hedeflenen genin ~3 kb bölgelerini doğrudan yukarı ve aşağı doğru tanımlayın(Şekil 1).
- Tasarım PCR astarlar 1) klamydial genomik DNA 3 kb 5'homoloji kolu yükseltmek ve 2) 15-30 bp çıkıntı pSUmC-4.0 sindirilir zaman Sall restriksiyon enzim sitesinde özgü içerir. pSUmC-4.0 ile örtüşen astar bölgelerinin 55 °C'lik erime sıcaklıklarına ve tüm astar için saç tokası erime sıcaklıklarının <35 °C olduğundan emin olun.
- Tasarım PCR astarlar 1) klamydial genomik ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
FLAEM kullanan C. trachomatis'te belirtilamayan gen delemesi yöntemi dikkatli klonlama ve dönüşüm tekniklerine bağlıdır. Başarılı allelic rekombinasyon önemli bir ilk adımdır ve pSUmC-4.0 klonlama vektörüne homoloji kollarının tanımlanmasını ve yerleştirilmesini gerektirir(Şekil 1). Belirtilmeden gen delemesi için önemli bir ikinci adım, Şekil 2'detemsil edilen Krem-lox genom düzenleme ile floresan muhabirinin ve antibiyotik seçim kasetinin çıkarılmasıd.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
FLAEM tarafından C. trachomatis'de belirtilmeyen gen silmelerin üretimi için burada açıklanan protokol, gereksiz genlerin hedefli silinmesine izin verir ve kasetin neden olduğu polar etkileri ortadan kaldırır. Protokol, pSUmC 4.0 intihar vektörüne yerleştirilen 5' ve 3' homoloji kollarının dikkatli tasarımına, C. trachomatis'in etkin dönüşümüne ve izole mutant suşlarının dikkatli bir şekilde taranmasına dayanır. Bu yöntemle başarılı genom mühendisliği, floresan olmayan ve hedeflenen gen delemesi yerinde.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, NIAID (a1065530 ve Al124649 hibe) K.A. Fields Halk Sağlığı Servisi hibe tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Moleküler Biyoloji Sınıfı |
| Anhidrotetrasiklin hidroklorür | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Tampon | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Kalsiyum Klorür Dihidrat | ||
| Kalsiyum Klorür Dihidrat | Sigma | C7902-500G | Hücre kültürü |
| için uygunSikloheksimid | Sigma | 7698-1G | |
| baraj-/dcm- Yetkili E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Steril filtrelenmiş hücre kültürü test edildi |
| Glutamik asit | Sigma | G8415-100G | L-Glutamik asit |
| Büyüme Ortamı #1 | RPMI 1640 ortamı% 10 (hacim / hacim) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir. | ||
| Büyüme Ortamı #2 | RPMI 1640 ortamı, %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve 1 & mikro ile desteklenmiştir; g / mL sikloheksimid | ||
| Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Isıyla İnaktive Fetal Sığır Serumu Nitelikli Tek Atış (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Hücreleri | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plazmid Miniprep Kiti | New England BioLabs | T1010S | Küçük ölçekli DNA saflaştırması |
| NaH < sub > 2 < / sub>PO < sub>4< / sub> | Sigma | S3139-250G | Sodyum fosfat monobazik |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma | S5136-500G | Sodyum fosfat dibazik |
| NEB 10-beta Elektroyetkin E. coli< / em> Hücreler | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA montajı Klonlama Kiti | Yeni İngiltere BioLabs | E5520S | Gibson Montaj Kiti |
| Penisilin G sodyum tuzu | Sigma | P3032-10MU | Hücre kültürüne uygun biyoreaktif |
| QIAGEN Plazmid Maxi Kiti | QIAGEN | 12162 | Büyük ölçekli DNA saflaştırması |
| Q5 Sıcak Başlangıç Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz | New England BioLabs | M0515 | Fragman PCR Polimeraz |
| RPMI 1640 Orta (1x) | Gibco | 11875-093 | 2mM L-glutamin |
| içeren Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Seçim Ortamı # 1 | RMPI 10% FBS, 1 ve mikro; g / mL sikloheksimid, 500 &mikro; g / mL spektinomisin ve 50 ng / mL susuz tetrasiklin DMSO | ||
| Seçim Ortamı # 2 | RMPI % 10 FBS, 1 & mikro; g / mL sikloheksimid, 500 &mikro; g/mL spektinomisin | ||
| Seçim Ortamı #3 | RPMI %10 FBS, 1 & g / mL sikloheksimid, 50 ng / mL aTc ve 0.6 & mikro; g / mL penisilin | ||
| Sodyum Asetat Tampon Çözeltisi | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Büyüme Ortamı | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spektinomisin dihidroklorür pentahidrat, Hücre Kültürü Sınıfı | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sükroz | Sigma | S1888-1KG | Hücre kültürüne |
| uygun biyoreaktifSükroz-Fosfat-Glutamat Tamponu (SPG) | 37.5g sükroz, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2Psub4, 500 ml doku kültürü dereceli su için 0.36 glutamik asit | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure sınıf |
| Tripsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | %0.25 |
| Su | Sigma | W3500-500ML | Steril filtreli, BioReagent, Hücre kültürü için uygun |
Kaynaklar
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
- Stephen, R. S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
