Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/60851

⸱

13 Mart 2020

 ,  ,  , 
1Research and Innovation, Murdoch University, 2Centre for Digital Agriculture, Curtin University, 3Centre for Integrative Metabolomics and Computational Biology, School of Science, Edith Cowan University, 4Centre for Computational and System Medicine, Health Futures Institute, Murdoch University, 5Department of Primary Industries and Regional Development, 6State Agricultural Biotechnology Centre, Murdoch University

Bu makalede

Özet

Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.

Özet

Tarım uygulamalarında genler, çevre ve yönetim arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Metabolomik veriler, bu etkileşimlerin belirli bir anda okunmasını sağlar ve bir organizmanın biyokimyasal durumu hakkında bilgilendiricidir. Ayrıca, bireysel metabolitler veya metabolitlerin panelleri verim ve kalite tahmini ve yönetimi için hassas biyobelirteçler olarak kullanılabilir. Bitki metabolom fizyolojik özellikleri ve biyomarker keşif içine bir biyokimyasal anlayış için bir fırsat sağlamak çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce içerdiği tahmin edilir. Bunu kullanmak için, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaç tek bir analiz içinde mümkün olduğunca çok fizikokimyasal çeşitliliğin yakalamaktır. Burada tarlada yetişen buğday tanesinin analizi için sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tabanlı hedefsiz metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem üçüncü bir mobil faz tanıtmak için sıvı kromatografi quaternary solvent yöneticisi kullanır ve bir lipid-münakaşa gradyanı ile geleneksel ters faz gradyanı birleştirir. Tane hazırlama, metabolit ekstraksiyonu, enstrümantal analiz ve veri işleme iş akışları ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kütle doğruluğu ve sinyal tekrarlanabilirliği gözlendi ve yöntemiyonizasyon modu başına biyolojik olarak yaklaşık 500 özellik verdi. Ayrıca buğday çeşitleri arasında anlamlı olarak farklı metabolit ve lipid özelliği sinyalleri belirlendi.

Giriş

Tarımda genler, çevre ve yönetim uygulamaları arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Bitki metabolitleri genom, çevre (iklim, yağış vb.) gibi faktörlerden ve tarım ortamında, bitkilerin yönetilme şeklinden (örneğin, gübre, mantar ilacı vb.) etkilenir. Genomun aksine, metabolom tüm bu faktörlerden etkilenir ve bu nedenle metabolomik veriler bu etkileşimlerin belirli bir zamanda biyokimyasal parmak izini sağlar. Metabolomik temelli bir çalışmanın iki amacından biri vardır: birincisi, organizmanın biyokimyasını daha iyi anlamak ve fizyolojiye göre tedirginlik (abiyotik veya biyotik stres) yanıt mekanizmasını açıklamaya yardımcı olmak; ve ikincisi, biyobelirteçleri çalışma altındaki tedirginlikle ilişkilendirmek. Her iki durumda da, bu bilgiye sahip olmanın sonucu, geliştirilmiş verim büyüklüğü ve kalitesi hedefine ulaşmak için daha hassas bir yönetim stratejisidir.

Bitki metabolom çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce1 içerdiği tahmin edilir. Şu anda, hiçbir metabolomik platformlar (ağırlıklı olarak kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tek bir analizde tüm metabolom yakalayabilir. Metabolomun tek bir analitik çalışma içinde mümkün olduğunca geniş bir kapsama alanı sağlayan bu tür tekniklerin (numune hazırlama, metabolit ekstraksiyonu ve analizi) geliştirilmesi, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaçtır. Buğday tanesinin önceki hedeflenmemiş metabolomik analizleri, birden fazla kromatografik ayrım ve edinim kutuplarından elde edilen verileri birleştirmiş ve/veya daha fazla metabolom kapsama alanı için enstrümantasyon almıştır. Ancak, bu örneklerin her modalite için ayrı ayrı hazırlanması ve elde edilmesi gerekmektedir. Örneğin, Beleggia ve ark.2 polar analitlerin GC-MS analizi için türev leştirilmiş bir örnek hazırladı. Das ve ark.3 analizlerinde kapsama alanını iyileştirmek için hem GC hem de LC-MS yöntemlerini kullanmaktadır; ancak, bu yaklaşım genellikle yukarıda açıklandığı gibi ayrı örnek hazırlıkları yanı sıra iki bağımsız analitik platformlar gerektirir. GC-MS2,3,3,4 ve LC-MS3kullanarakbuğday tanelerinin önceki analizleri,GC-MS için 50 ila 412 (55 tanımlı) özellik, kombine GC-MS ve LC-MS için 409 ve LC-MS lipidomik analizi için birkaç bin adet ilerler.5 Tek bir analiz de en az iki mod birleştirerek, genişletilmiş metabolom kapsama sağlanabilir, biyolojik yorumlama zenginliğini artırırken aynı zamanda hem zaman hem de maliyet tasarrufu sunan.

Tersine faz kromatografisi ile lipid türlerinin geniş bir yelpazede verimli ayrılmasına izin vermek için, modern lipidomics metodolojileri genellikle elüsülasyon solvent yüksek oranda izopropanol kullanın6, aksi takdirde kromatografi tarafından çözülmemiş olabilir lipid sınıfları için olanaklar sağlayan. Verimli bir lipid ayrıştırma için, başlangıç mobil faz da çok organik kompozisyondaha yüksektir 7 tipik ters faz kromatografik yöntemler, hangi moleküllerin diğer sınıfları dikkate. Degradenin başlangıcındaki yüksek organik bileşim, bu yöntemleri diğer moleküllerin sınıflarına daha az uygun hale getirir. En önemlisi, ters faz sıvı kromatografisi, çoğunlukla sulu bir bileşimle başlayan ve kromatografinin elüsyon mukavemeti arttıkça organik içerikte artan ikili bir çözücü degradesi kullanır. Bu amaçla, metabolitlerin hem lipid hem de lipid olmayan sınıflarının ayrılmasını tek bir analizde elde etmek için iki yaklaşımı birleştirmeye çalıştık.

Burada, üçüncü bir mobil faz kullanan ve tek bir örnek hazırlama ve bir analitik kolon kullanarak kombine geleneksel ters faz ve lipidomics-uygun kromatografi yöntemi sağlayan bir kromatografik yöntem salıyoruz. Daha önce ağırlıklı olarak klinik metabolomik çalışmalarda uygulanan kalite kontrol önlemleri ve veri filtreleme adımlarının çoğunu benimsedik. Bu yaklaşımlar, yüksek teknik tekrarlanabilirlik ve biyolojik önemi olan sağlam özellikleri belirlemede yararlıdır ve bu kriterleri karşılamayanları hariç tutar. Örneğin, havuzlu QC örnek8,QC düzeltme9,veri filtreleme9,10 ve eksik özellikleri nputasyon tekrar analizi açıklar11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu yöntem 30 numune (numune başına yaklaşık 150 tohum) için uygundur. Burada on farklı tarlada yetişen buğday çeşidinin üç biyolojik kopyaları kullanılmıştır.

1. Tahılların hazırlanması

  1. -80 °C depolamadan numune (tam taneler) alın.
    NOT: Numuneler birden fazla mevsimden toplanıyorsa, tohumların hasattan kısa bir süre sonra dondurulması önerilir. Bu depolama değişen dönemlerden sonra oluşabilir metabolit konsantrasyonu herhangi bir değişiklik en aza indirir. Bunu yapmak için, 15 mL plastik santrifüj tüp (yaklaşık 300 tohum tüp dolduracak) ve alüminyum folyo ile kapsayacak tohum transferi. Bir iğne kullanarak folyo iki-üç kez delin ve bir gecede (yaklaşık 24 saat) tüm taneleri kuru dondurma. Numuneler bu aşamada -80 °C'lik dondurucuya geri döndürülebilir veya bir sonraki adım yapılabilir.
  2. 20 s için yüksek modda iki çalışır için bir laboratuvar blender kullanarak tohumları grind.
    NOT: Bu protokol için kullanılan blender bıçak yüksekliğine blender doldurmak ve nispeten homojen zemin tane örneği vermek için yaklaşık 150 tohum en az gerektirir.
  3. Blender'ı tabandan çıkarın ve numunenin yüzeyine kaba öğütülmüş taneleri getirmek için blender'ın yan tarafına dokunun. Kaba malzeme atılabilir veya saklanabilir.
  4. Toz benzeri ince zemin malzemesini blender'dan 2 mL plastik mikrosantrifüj tüpe aktarın.
    NOT: Blender'ı deiyonize su ile yıkayın ve numuneler arasında LC-MS sınıfı MeOH ile durulayın. Bir sonraki numuneye geçmeden önce blender'ın tamamen kuru olduğundan emin olun.
  5. İnce öğütülmüş tahıl örneklerini dondurucuya geri döndürveya bir sonraki adıma (metabolit ekstraksiyonu) geçin.

2. Ekstraksiyon çözücühazırlanması

NOT: Ekstraksiyonları gerçekleştirirken aynı gün ekstraksiyon çözücüsi hazırlayın.

  1. Her standarttan en az 2 mL 1 mg/mL hazırlayın. 2-aminoantracen, mikonazol ve d6-transcinnamic asit hazırlamak için asetonitril (ACN) kullanın. 13C6-sorbitol hazırlamak için su kullanın.
  2. Her 1 mg/mL standarttan 2 mL alın ve 100 mL hacimsel şişeye ekleyin.
  3. Hacimsel şişeyi asetonitril ile çizgiye doldurun. 100 mL asetonitrilin her bir iç standarttan 20 μg/mL içerdiğinden emin olun: 2-aminoantracen, mikonazol, 13C6-sorbitol, d6-transsinnamik asit.

3. Metabolit çıkarma

  1. 2 mL mikrosantrifüj tüp içine ince öğütülmüş tahıl 200 mg tartın.
  2. 200 mg ince öğütülmüş tane numunesine 500 μL çıkarma çözücüsi ekleyin.
  3. 6.500 rpm 20 s 2 çalışır için bir homogenizer kullanarak karıştırın.
  4. Santrifüj 4 °C'de 5 dk 16.100 x g.
  5. Supernatant'ı 2 mL plastik tüpe aktarın.
  6. Yaklaşık 1,5 mL toplam supernatant hacim vermek için 3,1 ila 3,5 iki kez daha fazla adımlardan bu yordamı tekrarlayın.
  7. Girdap supernatant karıştırmak için.
  8. Havuzlanmış tane özü örneği yapmak için her ekstresin eşit hacmi (55°L) ayrı bir 2 mL boruya aktarın.
  9. Ekstrenin 50 μL'lik aliquot'ünü cam bir şişeye aktarın.
    NOT: Ekstreler bu noktada dondurulabilir (-80 °C) veya bir sonraki adıma geçerek LC-MS analizine kadar devam edebilir.

4. LC-MS analizi için çözümlerin hazırlanması

DİkKAT: Konsantre asit için her zaman suya/çözücüye asit ekleyin.

  1. 1 M amonyum formatı stok çözeltisi 50 mL hazırlayın. 3.153 g amonyum formatı ağırlığında ve 50 mL hacimsel şişeye aktarın. LC-MS grade H2O ile çizgiye hacimsel şişe doldurun.
  2. 10 mM amonyum formatı, %0,1 formik asitiçeren mobil faz A'nın 1 L'sini hazırlayın. Bunu yapmak için, 1 L hacimsel şişeye yaklaşık 500 mL LC-MS sınıfı su ekleyin. 10 mL 1 M amonyum formatı stok ve formik asit 1 mL ekleyin. LC-MS sınıfı H2O. 1 L şişeye transfer ve degas için 15 dakika sonicate ile çizgiye hacimsel şişe doldurun.
  3. 79:20:1 asetonitile 10 mM amonyum formatı oluşan mobil faz B 1 L hazırlayın: izopropil alkol:su, 0.1% formik asit oranı. 1 L hacimsel şişeye 200 mL isopropanol ekleyin. 10 mL 1 M amonyum formatı stok ve formik asit 1 mL ekleyin. Hacimsel şişeyi asetonitril ile çizgiye doldurun. Degas için 15 dakika için 1 L şişe ve sonicate aktarın.
    NOT: ACN'yi eklemeden önce 1 M amonyum formatını izopropil alkole (IPA) seyreltin. Amonyum formatı CAN'da çözünmez.
  4. 89:10:1 izopropil alkol:asetonitril:su oranında 10 mM amonyum formatı içeren 1 L mobil faz C hazırlayın. Bunu yapmak için, yaklaşık 500 mL izopropanol, 1 0 m amonyum formatı stok 10 mL ve 1 L volumetrik şişe ye 100 mL asetonitril ekleyin. Isopropanol ile çizgiye doldurun. Degas için 15 dakika için 1 L şişe ve sonicate aktarın.
  5. LC-MS sistem yıkama solventlerinin hazırlanması
    1. Pompa kafası yıkama solüsyonunu taze çözeltiile değiştirin. %50 metanol, %10 izopropil alkol veya üretici nin önerdiği gibi diğer kullanın.
    2. Numune enjeksiyonundan önce ve sonrasında enjeksiyon akışkanlarını yıkamak için güçlü ve zayıf iğne yıkama solüsyonları hazırlayın. Güçlü yıkama için eşit hacimlerde ACN ve IPA ekleyin. Zayıf yıkama için, ayrı şişelerde %10 ACN (bu protokol ve numune sayısı için sırasıyla güçlü ve zayıf yıkamaların her biri için yaklaşık 500 mL ve 1 L gerektiren) bir çözelti hazırlayın.
    3. İğne yıkama hacimlerini güçlü ve zayıf yıkamalar için sırasıyla 600 μL ve 1800 μL olarak ayarlayın.

5. LC-MS analizi için numunelerin hazırlanması

  1. 400 ng/μL lösin enkephalin hazırlanması için üreticilerin standart çalışma prosedürüne göre, pipet 7.5 mL su içeren 12 mL ll lösin-enkephalin vial 3 mg lösin-enkephalin. 50°L aliquots -80 °C'de dondurun.
  2. 200 ng/mL lösin-enkephalin içeren %5 ACN'lik 100 mL hazırlayın (50 μL 400 ng/μL lösin enkephalin). LC-MS analizi ile aynı gün hazırlanın.
  3. Adım 3'ten hazırlanan 50 μL numune aliquot'a enjeksiyon standardı lösin-enkephalin içeren %5 asetonitrilin 950 μL'sini ekleyin.
  4. Hazırlanan numuneyi karıştırmak için girdap.

6. LC-MS kurulumu

NOT: Üreticinin kullanım kılavuzunda enstrüman ve satın alma yöntemi kurulumunun ayrıntılı bir açıklaması açıklanmıştır. Genel bir kılavuz ve bu protokole özgü ayrıntılar aşağıda özetlenmiştir. Aşağıdaki adımlar, verileri almadan önce herhangi bir zamanda tamamlanabilir.

  1. Bir LC-MS donanım profili açın.
  2. Tablo 1'deözetlenen kromatografik yöntemi ayarlayın. LC sisteminin bu degradeyi kurmak için bir kuaternary solvent yöneticisi ile donatılmış olduğundan emin olun.
    NOT: IPA viskoz bir çözücüdür. Kompozisyon %98.0'a yükseltilmeden önce düşük akış hızında kullanılmalı ve yeterli bir denge süresi kullanılmalıdır. Bu adımlar, LC sisteminin aşırı baskı ve durmasını önler.
  3. M/z aralığı 50-1.300 üzerinde pozitif ve negatif ToF-MS modlarının her biri için kütle spektrometre kazanım yöntemlerini ayarlayın.
    NOT: Burada sunulan çalışma için kullanılan alet, olumlu ve olumsuz yöntemlerin tek tek kalibre edilip çalıştırılmasını gerektirir (yani bir yöntem içinde polarite geçişi mümkün değildir).
  4. LC sütunu yeniyse, kolon üreticinin önerisine göre koşullandırma.
    NOT: Aşağıdaki adımlar veri toplamadan önce doğrudan tamamlanmalıdır.
  5. 'Yalnızca MS' donanım profilinde, kütle spektrometresini üreticinin önerilerine göre kalibre edin. Her satın alma modundan önce bu adımı tamamlayın ve sistemin kalibrasyondan önce verilen her modalitede stabilize olmasını sağlar.
  6. LC-MS sınıfı çözücüler kullanarak LC akışkan sistemini mobil faz ve yıkama çözücüleri de dahil olmak üzere temizle ve temizle.
  7. LC sistemini LC yöntemiyle dengeleyin ve kolon basıncının dengelenmesini sağlar.
  8. Cihazın kalibrasyonunun kontrol edilebiyi kontrol etmek için numune dizisinin başına sodyum formatı (%90 IPA'da 0,5 mM) enjekte edin.
  9. Önce çözücü ve preparative (ekstraksiyon) boşlukların analiz edilmesi için alet sıra tablosunu ayarlayın; sistem klima için havuzlu QC örnekleri (6-10) takip; daha sonra QC örnekleri ile randomize örnek listesi düzenli aralıklarla (örneğin, her beş enjeksiyon) teknik çoğaltma olarak çalıştırın. Dizinin sonunda iki QC örneği çalıştırın.
    NOT: Örnek dosya adı ve örnek kimlik namenin yanı sıra tarih ve enjeksiyon/satın alma siparişini de eklemek yararlı olacaktır. Örneğin: YYYY çoğaltmanumber_Variety_Biological MMDD_Injection. Başlatmadan önce, LC sütun basıncının kararlı olduğundan ve LC'nin MS'e bağlı olduğundan emin olun.

7. Veri işleme

NOT: Genel bir veri işleme iş akışı Şekil 1'desunulmuştur.

  1. Sıra çalışırken veri kalitesini (iç standart kütle doğruluğu (aşağıda hesaplama) ve sinyal tekrarlanabilirliğini kontrol edin. Sinyal tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için, overlaid spectra görsel muayene yeterli olmalıdır.
    NOT: Kütle hatası (ppm) = ((Teorik kütle – ölçülen kütle) / teorik kütle) x 106
  2. Örnekler x iç standartlarını içeren hizalanmış bir tepe yoğunluk matrisi oluşturun (bekletme süresi ve m/z değerlerine göre hizalanır).
    1. Veri işleme yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu). Ana Sayfa > Aç, Veri'yitıklatın. Uygun dosya konumuna gidin ve tüm veri dosyalarını açın.
    2. Ana Sayfa > Sıra > İşlem Türüaltında açılan menüden Nicelik'i seçin.
    3. Ana Sayfa > Yöntem > Quanaltında Kalibrasyon Bileşenleri'nitıklatın. Tablo 2'deverilen ayrıntıları kullanarak her alanı doldurun. Tamam'ıtıklatın.
    4. Veri dosyalarının yanındaki sütunlarda sol panelde, hücreye sağ tıklayarak ve Bilinmeyen'iseçerek örnek türünü doldurun. Düzeyi n/aolarak doldurun.
    5. Ana Sayfa > İşlemealtında , Sıra'yıseçin. Sırayı kaydetmek için bir konum seçin ve ardından İşlem'itıklatın.
    6. Ana Sayfa > Sonuçlaraltında, Quan'ıseçin. Quan görüntüleyicisinden, matris çözümleyicisine Dışa Aktar'ıseçin.
    7. Matris çözümleyicisi sonuçları görüntüleyiciden, aktarım'dan csv'ye aktar'ıtıklatın. Dosyayı elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.
    8. Elektronik tablo yazılımında, her iç standardın yoğunluğunun (tepe alanının) ortalamasını, standart sapması ve göreli standart sapması hesaplayın.
  3. Örnekler x hedeflenmemiş özellikleri içeren hizalanmış bir tepe yoğunluk matrisi oluşturun (bekletme süresi ve m/z değerlerine göre hizalanır).
    1. Küçük molekül bulma çözümleme yazılımını açın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve yeni bir deneme oluşturmak için Dosya > Yeni'yi seçin. Denemeyi adlandırın ve deneme dosyalarını kaydetmek ve depolamak için konumu seçin. İleri'yitıklatın.
    2. Kullanılan enstrüman türünü (yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi), veri biçimini (profili) ve polariteyi (pozitif veya negatif) seçin. İleri'yitıklatın. Kitaplıkta bulunan tüm adduct'ları seçin ve gerektiğinde adduct kitaplığını edin. Deneme Oluştur'utıklatın. Yeni bir sayfa, veri işlemenin geri kalanının devam edeceği/gerçekleşeceği yere yüklenir.
    3. Veri dosyalarını içe aktarın. Dosya biçimini seçin ve sonra içe aktar'ı seçin. Veri konumuna göz atın ve aktak edilecek veri dosyalarını seçin. İlerleme, sayfanın sol panelindeki her dosya için gösterilir.
    4. Veri dosyaları alındıktan sonra Otomatik İşlemi Başlat'ıseçin. Hizalama başvurusu seçmek için bir yöntem seçin. Ya yazılım uygunluk için tüm çalışır değerlendirmek, uygun örneklerin bir listesini vermek (yani, QC örnekleri) ya da referans en uygun yani bir orta sıra QC örnek seçin. Evet'i seçin, koşularımı otomatik olarak hizala > Sonraki.
    5. Deneme tasarımı sayfasında İleri'yi seçin (bu daha sonra ayarlanabilir).
    6. En Yüksek Çekme'yi Gerçekleştir'i seçin ve ardından Parametreleri Ayarlayın. Tepe Çekme Sınırları sekmesinin altında Mutlak Iyon Yoğunluğu'nu seçin ve 100girin. En az tepe genişliğini uygula'yı seçin ve 0,01 dk. Ok > Finish'iseçin. İşlem tamamlandığında Kapat'ıseçin.
      NOT: Tepe toplama sınırları gerektiğinde diğer veri dosya türleri için optimize edilebilir.
    7. Ekranın sağ alt kısmında Bölüm Tamamlandı'yıseçin. Hizalanmış çalıştırmaları gözden geçirin ve her örneğin başvuruya hizalandığından emin olun. Burada sunulan veriler için hizalama puanları >%90 idi. Bölüm Tamamlandı'yıseçin.
    8. Bir sonraki sayfada, konu tasarımı arasında seçim belirleyin. Tasarımı söyle. Çalıştırmaları el ile Grupla'yı seçin ve tasarım oluşturun. Koşul ekleyin, Koşul 1'e tıklayın ve grubu uygun şekilde adlandırın. Bölüm Tamamlandı'yatıklayın.
      NOT: Yazılım içindeki istatistikleri kullanmaya uygun koşullar eklemeye devam edin. Yazılımı yalnızca hedeflenmemiş bir matris oluşturmak için kullandığımıziçin , 'hepsi' etiketli tek bir koşul kullandık.
    9. Sonraki sayfada Bölüm Tamamlandı'yıseçin. Tepe toplamayı yeniden yapmayın.
    10. Deconvolution gözden geçirin ve sonra Bölüm Tamamlandı'yıtıklatın.
    11. Dosyaya Git > Bileşik Ölçümleri Dışa Aktar. Çıktıda istenmeyen tüm özellikleri seçin. Tamam'ıtıklatın. .csv dosyasını kaydetmek için bir konum seçin. Kaydet > Dosyayı Aç > Klasörü Aç veya Kapat'ıtıklatın.
  4. Eserleri (elektronik tablo yazılımını) kaldırmak için ayıklama boşluklarını kullanarak verileri filtreleyin.
    1. Her RT x m/z özelliği için, yeni bir sütunda, çıkarma boşluklarındaki ortalama yanıtı hesaplayın.
    2. Her RT x m/z özelliği için, diğer tüm örneklerdeki (QC örnekleri dahil) ortalama yanıtı hesaplayın.
    3. Örneklerdeki boşlukların % tepe yoğunluğunu hesaplayın (örneklerdeki boş/ortalama yanıttaki ortalama yanıt x 100).
    4. Yüzde katkı sütununu en düşük değerlerden en yüksek değerlere sıralayın.
    5. Boşluklardan >%5 yoğunluk katkısı olan özellikleri kaldırın.
  5. Eksik değerleri filtreleyin ve özellik sinyallerini havuzlu QC örneklerindeki sinyallere doğru şekilde düzeltin.
    1. Veri işleme yazılımını açın (Malzeme Tablosu). MatrixAnalyzer'ı Görüntüle düğmesini tıklatın. Veri Dosyasını Aç düğmesini tıklatın.
    2. Her örnek için RT x m/z özelliklerinin en yüksek yoğunluğunu içeren .csv dosya konumuna gidin (hedeflenmemiş matris). Aç'ıseçin.
    3. QC örnekleri sekmesinin altında, her parametreyi gerektiği gibi doldurun. Burada açıklanan veri kümesi için QC category=QC, ignore categories=boş, impute type=none, kapsama eşiği=80, ölçeklendirme kullanma=ölçeklendirme, işaret dönüştürmeyi açma, doğru kullanma=yumuşatma spline, smoothing=0,25 kullanın.
    4. Matris panelinin sağ üst kısmında, oynatma düğmesi QC düzeltmetıklayın.
    5. Düzeltme matris panelinin sağ üst kısmında yapıldıktan sonra Sonuçları Kaydet'itıklatın. Uygun bir konuma gidin ve .csv sonuç dosyasını kaydedin.
  6. QC örneklerinde >%20 RSD olan özellikleri kaldırmak için verilere filtre uygulayın.
    1. Verileri, örneklerin satırlar halinde ve özelliklerin sütunlarda olması için düzenleyin.
    2. Yeni bir sütunda, QC örnekleri için ortalama tepe yoğunluğunu hesaplayın.
    3. Yeni bir sütunda, QC örnekleri için en yüksek yoğunluğun standart sapması hesaplayın.
    4. QC örnekleri için pik yoğunluğun göreli standart sapması hesaplayın: (QC standart sapma/QC ortalaması) x 100.
    5. Özellikleri en düşük %RSD'den en yüksek %'ye doğru sıralayın ve QC RSD >%20 olan özellikleri kaldırın.
  7. Düşük RSDörneği/RSDQC oranlarına (örneğin, <1) sahip özellikleri kaldırmak için verileri filtreleyin.
    1. Yeni bir sütunda, örneklerin ortalama tepe yoğunluğunu hesaplayın.
    2. Yeni bir sütunda, örnekler için en yüksek yoğunluğun standart sapması hesaplayın.
    3. Numunelerin pik yoğunluğunun göreli standart sapması hesaplayın: (örnek standart sapma/örnek ortalaması) x 100.
    4. Yeni bir sütunda, rsd örneklerini QC RSD'ye bölün.
    5. Değerleri (RSDörnek /RSDQC oranları) en yüksekten en düşüke sıralayın ve bir oran <1 ile özellikleri kaldırın.
  8. Eksik değerleri (çevrimiçi olarak kullanılabilen çeşitli yöntemler) impute edin.
    1. Elektronik tabloyu, örneklersatırve özellikler sütunlarda olacak şekilde biçimlendirin. İlk sütun örnekleri dosya adı olmalıdır. Dosya adlarının yanında ek bir sütun oluşturun ve örnek gruplandırmaları girin. Bu durumda, örnekler çeşitli olarak gruplandı.
    2. Elektronik tabloyu .csv dosyası olarak kaydedin.
    3. Yüksek işlemmetabolomics için web tabanlı analitik boru hattı için ana sayfaya gidin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve Başlamak için Buraya tıklayın.
    4. İstatistiksel Analiz'itıklatın. Verilerinizi Yükle'ninaltında Veri Türü'nü seçin: en yüksek yoğunluk tablosu, Biçim: Satırdaki örnekler (eşleşmemiş) ve ardından Dosya'yı seçin.
    5. .csv dosyasına gidin, Aç'ı seçin ve sonra Gönder'iseçin.
    6. Sonraki sayfada Eksik Değer Tahmini'niseçin. Adım 1'i kaldırın (bu AnalyzerPro XD'de gerçekleştirildi). Adım 2'de, eksik değerleri tahmin etmek için bir yöntem seçin.
      NOT: Burada sunulan veriler için - 'KNN' ile 'tahmini eksik değerler' seçilmiştir.
    7. Bu aşamada, veri matrisi indirilebilir (web sayfasının sol panelinden İndir'i seçin) veya daha fazla istatistiksel analiz yapmaya devam edebilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bitki metabolom genomu ve çevre bir arada etkilenir, ve ayrıca bir tarımsal ortamda, ürün yönetimi rejimi. Buğday çeşitleri arasındaki genetik farklılıkların metabolit düzeyinde gözlemlenebildiği, burada 500'den fazla ölçülen bileşiğin sadece tahıldaki çeşitler arasında anlamlı olarak farklı konsantrasyonlar gösterdiğini gösteriyoruz. İyi kütle doğruluğu (<10 ppm hatası) ve iç standartların sinyal tekrarlanabilirliği (< RSD) hem negatif hem de pozitif iyonizasyon modları için gözle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, buğday tanesi nin analizi için LC-MS tabanlı hedeflenmemiş metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem, ters faz degradesine üçüncü bir mobil faz getirerek dört kazanım modunu (ters faz ve lipid-amenable ters faz ile pozitif ve negatif iyonizasyon) iki modda birleştirir. Birleşik yaklaşım, iyon polaritesi başına yaklaşık 500 biyolojik olarak ilgili özellik vermiştir ve bunların kabaca yarısı buğday çeşitleri arasındaki yoğunluk açısından önemli ölçüde farklılık göstermiş. Farklı buğday çeşitlerinin tanelerinde metab...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Batı Avustralya Premier Tarım ve Gıda Bursu programı (İş Bölümü, Turizm, Bilim ve Yenilik, Batı Avustralya Hükümeti) ve Premier Fellow, Profesör Simon Cook (Merkezi kabul etmek istiyorum Dijital Tarım, Curtin Üniversitesi ve Murdoch Üniversitesi). Saha denemeleri ve tahıl numunesi toplama, Batı Avustralya'nın Bölgeler için Telif Hakları programı hükümeti tarafından desteklendi. Grantley Stainer ve Robert French'i saha denemelerine katkılarından dolayı kabul ediyoruz. NCRIS tarafından finanse edilen Bioplatforms Avustralya ekipman finansmanı için kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
13C6-sorbitolMerck Sigma-Aldrich605514
2-aminoantrasenMerck Sigma-AldrichA38800-1 g
AsetonitrilThermoFisher ScientificFSBA955-4Optima LC-MS sınıfı
Amonyum formatMerck Sigma-Aldrich516961-100 mL>99.995%
Analist TFSciexSürüm 1.7
AnalyzerPro yazılımıSpectralWorks Ltd.Adım 7.2 için kullanılan veri işleme yazılımı. Sürüm 5.7
AnalyzerPro XD sortwareSpectralWorks Ltd.Adım 7.5 için kullanılan veri işleme yazılımı. Sürüm 1.4
DengeSartorius. Hassas Teraziler Pty. Ltd.
d6-transsinnamik asitIsotec513962-250 mg
Formik asitAjax Finechem Pty. Ltd.A2471-500 mL%99
Dondurarak kurutucu (Freezone 2.5 Plus)Labconco7670031
Cam Schott şişeleri (100 mL, 500 mL, 1 L)
Cam şişeler (2 mL) ve vidalı kapaklar (ön yarık)Velocity Scientific SolutionsVSS-913 (şişeler), VSS-SC91191 (kapaklar)
Sciex TripleToF için kurulum kitiSciexp/n 4456736
İzopropanolThermoFisher ScientificFSBA464-4Optima LC-MS sınıfı
Laboratuvar blenderiWaring ticariModel HGBTWTS3
Lösin-enkefalinSularıp/n 700008842Tuning çözümü
Metaboanalysthttps://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtmlYüksek verimli metabolomikler için web tabanlı analitik boru hattı. Ücretsiz, web tabanlı bir araç. Sürüm 4.0.
MetanolThermoFisher ScientificFSBA456-4Optima LC-MS sınıfı
MikonazolMerck Sigma-AldrichM3512-1 g
Mikrosantrifüj (Eppendorf 5415R)Eppendorf (Crown Scientific Pty. Ltd. tarafından dağıtılmıştır.)5426 No. 0021716
Mikrosantrifüj tüpleri (2 mL)SSIbio1310-S0
Microsoft Office ExcelMicrosoft
Peak View yazılımıSciexSürüm 1.2 (64 bit)
Pipet uçları (200 uL, 100 uL)ThermoFisher ScientificMBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)
Pipetler (200 uL, 1000 uL)ThermoFisher Scientific
Plastik santrifüj tüpleri (15 mL)ThermoFisher ScientificNUN339650
Progenesis QIDoğrusal Olmayan DinamikSamll molekül keşif analiz yazılımı. Sürüm 2.3 (64 bit)
Sciex 5600 üçlü ToF kütle spektrometresiSciex
Seramik boncuklu vidalı kapaklı lizis tüpleri (2 mL)Bertin Technologies
Sodyum formatMerck Sigma-Aldrich456020-25 g
Doku lizör/homojenizatörBertin TechnologiesSerial 0001620
Hacimsel şişeler (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)
Vorteks karıştırıcıIKA Works Inc. (Crown Scientific Pty. Ltd. tarafından dağıtılmaktadır.)001722
SuThermoFisher ScientificFSBW6-4Optima LC-MS sınıfı
Suyun Doğruluğu Kuaterner pompalarla donatılmış LC sistemiSular
Suyun Kapasitesi UPLC 100mm HSST3 C18 sütunSularp / n 186005614

Kaynaklar

  1. Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
  3. Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
  4. Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
  5. Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
  6. Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
  7. Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
  8. Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
  9. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  10. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72(2018).
  11. Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
  12. Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
  13. Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
  14. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  15. Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hedefsiz MetabolomikBu day Tanesi AnaliziMetabolit EkstraksiyonuEnstr mantal AnalizVeri lemeSinyal Tekrarlanabilirli iK tle Do rulu uBiyolojik zellikler
Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.