Yöntem makalesi

Phasic Dopamin'in Ventral Tegmental Alan Reseptör Reseptör Reseptör Düzenlemesini Değerlendirmek için Hızlı Taramalı Döngüsel Voltammetri (CIS-FSCV) ile Kombine infüzyon ve stimülasyon

DOI:

10.3791/60886

⸱

23 Nisan 2020

 ,  ,  , 
1Department of Psychology, Elizabethtown College, 2Department of Psychiatry, Yale University, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, ventral tegmental alan reseptörlerini, alt bölüm dopamin salınımı için katkılarını incelemek için doğrudan manipüle etmektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ventral tegmental alandan (VTA) çekirdek akumbens'e phasic dopamin (DA) salınımı, ödül işleme ve pekiştirme öğreniminde önemli bir rol oynar. VTA kontrol fazsik DA sürümüne gelen çeşitli nöronal girdilerin, ödül işleme ve pekiştirme öğrenimini kontrol eden devrenin daha iyi bir resmini nasıl sağlayabileceğini anlamak. Burada, farmakolojik agonistlerin ve antagonistlerin VTA içi kanül infüzyonlarını, in vivo hızlı tarama siklik voltammetri (FSCV) ile ölçülen stimülasyon çağrılı fazik DA salınımı (kombine infüzyon ve stimülasyon veya BDT) ile birleştiren bir yöntemi açıklıyoruz. Uyuşturulmuş sıçanlarda CIS-FSCV kullanılarak, nükleus akumbens çekirdeğinde kayıt yaparken VTA'yı bir kavunla donatılmış bipolar bir elektrotla elektriksel olarak uyararak fazik bir DA yanıtı çağrılabilir. Farmakolojik agonistler veya antagonistler, belirli VTA reseptörlerinin faik DA salınımını yönlendirmedeki rollerini araştırmak için doğrudan stimülasyon bölgesinde aşılanabilir. CIS-FSCV'nin önemli bir yararı, VTA reseptör fonksiyonunun in vitro çalışmalara dayanarak in vivo olarak çalışılabilmesidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ventral tegmental bölgeden (VTA) çekirdeğe (NAc) phasic dopamin (DA) salınımı ödülle ilgili davranışlarda hayati bir rol oynar. VTA DA nöronları tonik benzeri bir ateşlemeden (3-8 Hz) patlama benzeri bir ateşlemeye (>14 Hz)1'e geçer ve bu da NAc'ta vurgulu DA salınımı üretir. VTA, tonikten patlama ateşlemeye geçişi kontrol etmek için iyi konumlandırılmış çeşitli somatodendritik reseptörleri ifade eder2,3,4,5. Bu reseptörlerden hangisinin ve ilgili girdilerinin belirlenmesi, fazik DA salınımını kontrol etmek, ödülle ilgili devrelerin nasıl düzenlendiği konusundaki anlayışımızı derinleştirmeyecektir. Burada açıklanan metodolojinin amacı, hızlı tarama siklik voltammetri (CIS-FSCV) ile kombine infüzyon ve stimülasyon, VTA reseptörlerinin fazik DA salınımını sürüşteki işlevselliğini hızlı ve sağlam bir şekilde değerlendirmektir.

Kombine infüzyon ve stimülasyon (BDT) terimi, bir grup nöron üzerindeki reseptörleri farmakolojik olarak manipüle etmeyi (burada VTA) ve bu nöronları reseptörün işlevini incelemek için uyarmayı ifade eder. Uyuşturulmuş sıçanda, VTA'yı hızlı tarama siklik voltammetrisi (FSCV) ile ölçülen NAc çekirdeğinde büyük bir fazik DA sinyali (1-2 μM) uyandırmak için elektriksel olarak uyarırız. Stimülasyon yerindeki farmakolojik ilaçların (yani reseptör agonistlerinin/antagonistlerinin) infüzyonları, uyandırılan fazik DA salınımındaki sonraki değişimi gözlemleyerek VTA reseptörlerinin işlevini ölçmek için kullanılabilir. FSCV, hem yüksek uzamsal (50-100 μm) hem de zamansal (10 Hz) çözünürlüğe sahip elektrokimyasal bir yaklaşımdır ve ödülle ilgili, vurgulu DA etkinliklerini ölçmek için çok uygundur6,7. Bu çözünürlük, mikrodiyaliz gibi diğer in vivo nörokimyasal ölçümlerden daha incedir. Bu nedenle, CIS-FSCV birlikte, fazik dopamin salınımının VTA reseptör regülasyonunun değerlendirilmesi için çok uygundur.

VTA reseptör fonksiyonunu araştırmanın yaygın bir yolu, bu reseptörlerin nöronların atış hızını nasıl değiştirdiğini ele alan elektrofizyolojik yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanmaktır1,8. Bu çalışmalar, aktivasyon üzerine DA ateşlemesinde hangi reseptörlerin yer aldığını anlamada oldukça değerlidir. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece akson terminalde (yani bir nörotransmitterin salınmasında) aşağı akışta neler olabileceğini önerebilir. CIS-FSCV, VTA patlama-ateşleme, fazik DA salınımının VTA dendritleri ve hücre gövdeleri üzerinde bulunan reseptörler tarafından nasıl düzenlendiğini cevaplayarak bu elektrofizyolojik çalışmalar üzerine inşa edilir. Bu nedenle, CIS-FSCV bu elektrofizyoloji çalışmaları üzerine inşa etmek için çok uygundur. Örnek olarak, nikotinik reseptör aktivasyonu VTA9'dapatlama ateşlenmesine neden olabilir ve anestezik sıçandaki CIS-FSCV, VTA'daki nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) aktivasyonunun NAc10 , 11'dekifalizIK DA salınımını da kontrol ettiğini göstermek için kullanılmıştır.

Phasic DA regülasyonunun mekanistik incelemesi de yaygın olarak ilaçların banyo uygulaması ile birlikte dilim preparatları kullanılarak incelenir. Bu çalışmalar genellikle hücre gövdeleri genellikle dilimden çıkarıldığı için dopamin terminallerinden phasic DA salınımının presynaptik düzenlemesine odaklanır12. Bu preparatlar dopamin terminalleri üzerindeki presinaptik reseptör etkilerini incelemek için değerlidir, cis-FSCV ise dopamin nöronları üzerindeki somatodendritik reseptör etkilerini ve VTA'ya presynaptik girdileri incelemek için daha uygundur. Bu ayrım önemlidir, çünkü VTA'daki somatodendritik reseptör aktivasyonu NAc presynaptik reseptör aktivasyonundan farklı bir etkiye sahip olabilir. Gerçekten de, NAc'de dopaminerjik presynaptik nAChR'leri bloke etmek, patlama ateşlemesi sırasında phasic dopamin salınımını yükseltebilir13, tam tersi ise VTA somatodendritc nAChRs10,11'de geçerlidir.

CIS-FSCV, VTA reseptörlerinin faik DA salınımını düzenleme yeteneğini incelemek için ideal bir yaklaşımdır. Daha da önemlisi, bu yaklaşım anestezi veya serbest hareket ile bozulmamış bir sıçanda gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım akut çalışmalar için uygundur, temel durumunda reseptör fonksiyonunu incelemek için10,14 ve ilaç maruziyeti veya davranışsal manipülasyondan sonra bir reseptördeki fonksiyonel değişiklikleri değerlendirebilen uzun vadeli çalışmalar11,15.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre yapıldı ve hem Elizabethtown College hem de Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu protokol CIS-FSCV kullanımının uyuşturulmuş sıçan hazırlığına özgüdür.

1. Presurgical hazırlıklar

  1. Elektrot çözeltisi hazırlama
    1. Elektrot dolum çözeltisini yapmak için, 140 mM potasyum klorür16ile 4 M potasyum asetat çözeltisi hazırlayın.
  2. Elektrot hazırlama
    1. Vakum emiş kullanarak, bir borosilikat cam kılcal damara (uzunluk = 100 mm, çap = 1,0 mm, iç çap = 0,5 mm) bir T-650 karbon fiber (7 μm çapında) yerleştirin.
    2. Karbon fiber cam kılcal damarın içine yerleştirildikten sonra, cam kılcal damarı, ısı elemanı kabaca kılcal damarın ortasına olacak şekilde dikey bir elektrot çekeceği içine yerleştirin. Mıknatıs kapalıyken ısıtıcıyı 55'e ayarlayın.
    3. Kılcal damar çekildikten sonra, elektrot ucunun ısıtma elemanı ile çevrelenmeyecek şekilde üst kılcal tutucuyu dikkatlice kaldırın.
    4. Keskin makas kullanarak, kılcal damarın iki parçasını hala bağlayan karbon fiberi kesin. Bu iki ayrı karbon fiber mikroelekrod ile sonuçlanacaktır.
    5. Hafif bir mikroskop altında, maruz kalan karbon fiberi keskin bir neşterle dikkatlice kesin, böylece karbon fiber camın ucunun yaklaşık 75-100 μm ötesine uzanır.
    6. Hafif bir mikroskop kullanarak, elektrotunun kılcal damar boyunca çatlaklardan arındırılmasını sağlayın. Ayrıca karbon fiberin kılcal damardan çıktığı contanın fark etmesinin zor ve çatlaklardan arındırılmış olduğundan emin olun.
      NOT: İyi bir conta, kayıtlar sırasında gürültüyü azaltmaya yardımcı olacaktır. Daha ayrıntılı bir protokol için yayınlanan çalışmalar17,18,19'a bakın.
  3. Referans elektrot imalatı
    1. 5 cm'lik gümüş bir tel için altın bir pim lehim.
    2. Anotları metal bir ataşa veya başka bir iletkene, katot bir pime takın ve ataş ve gümüş tel 0,1 M HCl'ye batırılırken bir voltaj (~2 V) uygulayın.
    3. Gümüş tel üzerinde beyaz bir kaplama (AgCl) göründüğünde voltajı durdurun.
  4. İmplant için elektrot hazırlama
    1. Altın bir pim ince bir yalıtımlı tel (~10 cm uzunluğunda, <0,50 mm çapında) lehimleme.
    2. Altın pimin karşısındaki telden ~5 cm yalıtımı çıkarın.
    3. Elektrot çözeltisi ile elektrot yaklaşık yarıya kadar doldurun.
    4. Elektrota yalıtımlı tel yerleştirin.
      NOT: Tel elektrot içindeki karbon fiber ile temas etmelidir.

2. Elektrot implantasyonları

  1. Yetişkin, erkek, Sprague Dawley sıçanlarına (250−450 g) steril salinde çözünmüş 0,5 g/mL üretan intraperitoneal enjeksiyon (1,5 g/kg veya 1 mL/kg hacim) verin. 1.0−1.2 g/kg'lık ilk üretan dozu ile başlayın. Hayvan, üretan uygulandıktan 20 dakika sonra zararlı uyaran testine (kuyruk sıkışması) hala yanıt veriyorsa, 1,5 g/kg toplam doz için ek 0,3−0,5 g/kg üretan verin.
    NOT: 0,5 g/mL üretan çözeltisinin hazırlanması için 10 g 'a (~10 mL) tuzlu su ekleyin. Üretan bir kanserojendir ve özenle ele alınmalıdır. Üretan, dopamin seviyelerini değiştirmediği için, ketamin / kslazin ve klor hidrat gibi diğer anestezikler gibi önemli bir anesteziktir20,21.
  2. Hayvan derinden uyuşturulduktan ve zararlı uyaranlara (örneğin, parmak sıkışması) yanıt vermedikten sonra, stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Sıçanın her gözüne oftalmik yağlayıcı uygulayın.
    NOT: Bu sağkalımsız bir ameliyattır, ancak iyi bir aseptik teknik teşvik edilir.
  3. Farenin kafa derisini iki aşamalı bir ovma kullanarak temizleyin (yani, bir iodopovidone ovma ve ardından% 70 etanol ovma; 3 döngü tekrarı ile gerçekleştirin).
  4. Sterilize iğne burun cımbızı ve cerrahi makas kullanarak kafa derisi dokusunu kesin. Aşağıda özetlenen çeşitli implantasyonlara yer açmak için önemli miktarda dokuyu çıkarın.
  5. Sterilize edilmiş pamuk ucu aplikatörleri kullanarak kafatası yüzeyini hafifçe temizleyin. Daha sonra lambda ve bregma'yı tanımlamaya yardımcı olmak için 2−3 damla% 3 hidrojen peroksit uygulayın.
  6. Stereotaksik veya el matkabı (1,0 mm, ~20,000 rpm) kullanarak, bregma'ya 2,5 mm ön ve bregmaya 3,5 mm yanal 1,5 mm çapında bir delik açın. Kısmen (yaklaşık yarı yolda, sıkıca yerine geçene kadar) bu deliğe bir vida (1,59 mm O.D., 3,2 mm uzunluğunda) yerleştirin. Termal yaralanmayı önlemek için sondaj yaparken sulamak için steril salin kullanılması önerilir.
  7. Referans elektrot için, sol yarımkürede bregma için 1,5 mm ön ve 3,5 mm yanal 1,0 mm çapında bir delik açın.
  8. Elle, referans teli implante vidanın etrafına ve altına sararken bu deliğe ~2 mm referans teli yerleştirin.
  9. Referans elektrodu yerine sabitleyerek vidayı tamamen yerleştirin.
  10. Sağ yarımkürede, bregma için 1,5 mm çapında 1,2 mm ön ve 1,4 mm yanal delik açın.
  11. Cımbız kullanarak durayı yavaşça çıkarın.
  12. Uyarıcı elektrot için, bregma'ya 5,2 mm arka ve 1,0 mm yanal merkezli kare bir delik (2 mm ön-arka, 5 mm medial-yanal) delin.
  13. Stereotaktik kol çubuklarını kullanarak, bipolar uyarıcı elektrot/ kılavuz kanülini duranın 5 mm altına diraklayın. Elektrodun implantasyonu sırasında kanama olması durumunda, kanamayı en aza indirmek için steril pamuklu çubuklar ve gazlı bez kullanın.
    NOT: Bu yöntemde kullanılan bipolar uyarıcı elektrot, kılavuz bir kolayla(Malzeme Masası)önceden donatılmıştır. Bu madde ile kullanılan iç doğrul, kılavuz damara tam olarak yerleştirildiğinde bipolar uyarıcı elektrot üzerindeki uçlarla yıkanmalıdır. Bu, iç canüllerin yaklaşık 1 mm aralıklarla oturan uyarıcının iki çatalı arasında doğrudan oturmasını sağlayacaktır. Benzer bir protokol başka bir yerde açıklanmıştır14.
  14. Stereotaktik kol çubuklarını kullanarak karbon fiber mikroelektodu dura'nın 4 mm altına 2007'den 2007'den aşağı 2007'den bulabilirsiniz. Bu konum striatumun en dorsal kısmındadır.
  15. Referans telini ve karbon fiberi bir potentiostat'a bağlayın.
  16. 60 Hz'de 15 dakika ve yine 10 Hz'de 10 dakika boyunca üçgen dalga formu (-0,4−1,3 V, 400 V/s) uygulayın.
    NOT: Tipik olarak, beyindeki karbon fiber mikroelekrodlara dalga formları uygulanırken, karbon fiberin yüzeyine oksit grupları eklenir. Bu reaksiyonun dengesine kayıt öncesinde ulaşılmalıdır; aksi takdirde önemli sürüklenme19meydana gelecektir. Elektrotu daha yüksek frekanslarda (60 Hz) bisiklete bindirmek, karbon fiberin dengeyi daha hızlı elde etmesini sağlar.

3. Karbon fiberin optimize edilmesi ve elektrot/kılavuz kolay konumlarının uyarılması

  1. Uyarıcıyı, 60 Hz frekans, 24 darbe, 300 μA akım ve 2 ms/ faz darbe genişliğine sahip iki kutuplu bir elektrik dalga formu üretecek şekilde ayarlayın.
  2. Uyarıcıyı 0,2 mm'lik artışlarla 5 mm'den 7,8 mm'ye düşürelim. Her artışta VTA'yı uyarın.
    NOT: Daha fazla sırt derinliğinde (5−6 mm), beynin uyarılması tipik olarak (~%80) sıçanın bıyıklarının seğirmesine neden olur. Daha derinlerde, bıyıklar seğirmeyi durdurur ve bu da dura'nın 7,5−8,2 mm altında gerçekleşir. Bıyıklar seğirmeyi bıraktığında, uyarıcı elektrot VTA'nın yakınında veya yakınında olacaktır. Bu her sıçanda oluşmaz ve bıyık seğirmesi eksikliği, bipolar uyarıcı elektrot / infüzyon kanülinin yanlış yerleştirildiğinin bir işareti olarak alınmamalıdır. Bıyık seğirmesi tüm anestezikler için (örneğin, izofluran) gerçekleşmeyebilir.
  3. Bir stimülasyon karbon fiber mikroelekrodda (şu anda dorsal striatumda) fazik DA salınımı üretene kadar bipolar uyarıcı elektrot / kılavuz kanül düşürmeye devam edin.
    NOT: Bipolar elektrot VTA'ya yerleştirilirse, dorsal striatumdaki DA salınımı her zaman oluşmaz, ancak VTA stimülasyonu üzerine dorsal striatumda DA salınımının gözlemlenmesi genellikle NAc çekirdeğinde iyi bir sinyal gözlemlanacağının iyi bir işaretidir.
  4. Karbon fiber mikroelekrod'u dura'nın en az 6,0 mm altına indirin. Bu, NAc çekirdeğinin en dorsal kısmıdır.
  5. VTA'yı uyarın ve DA zirvesinin tepe genliğini kaydedin.
  6. En büyük DA sürümünü üreten sahada karbon fiber mikroelekrod'u diriltin veya yükseltin.
  7. DA yanıtının zirvesinin 0,6 V'ta net bir oksidasyon zirvesi ve -0,2 V'ta bir azaltma zirvesi olduğundan emin olun. Bu zirveler savcının göstergesidir.

4. Kombinasyon infüzyon ve stimülasyon FSCV kaydı

NOT: Şekil 1, VTA mikroenfüzyondan önce ve sonra kayıt için zaman çizelgesini gösterir.

  1. Karbon fiber ve uyarıcı elektrot/kılavuz kanül konumu optimize edildikten sonra ~ 20−30 dakika boyunca uyarın.
    NOT: Mevcut stimülasyon parametreleri altında, veziküler yeniden yüklemeye izin vermek için her 3 dakikada bir birden fazla uyarmayın22.
  2. Kararlı bir taban çizgisi elde ettikten sonra (beş stimülasyon üzerinde % <20 varyasyon), iç kanülleri iki kutuplu stimülatöre önceden uygun kılavuz kanüle elle hafifçe küçümser.
  3. Cannula eklemenin çağrıştırılan sinyalde bir değişikliğe neden olmadığından emin olmak için ek 2−3 temel kayıt alın. Bazı durumlarda, iç kanüllerin yerleştirilmesi ve çıkarılması VTA'ya zarar verebilir. Sinyal bu taban çizgisi süresi boyunca büyük ölçüde değişirse (%>20), taban çizgisi yeniden dengelenine kadar ek bir 3−4 kayıt alın.
  4. Şırınga pompası ve mikrosire kullanarak VTA'ya 2 dakika boyunca 0,5 μL çözelti (örneğin, %0,9 salin, N-metil-D-aspartat [NMDA], (2R)-amino-5-fosfonovaleric asit [AP5]) aşıleyin.
  5. Postinfüzyon, çıkarmadan önce iç kanülü en az 1 dakika bekletin.
    NOT: Bazı ilaçlar ilaç kinetiğine dayanarak iç kanülden daha uzun süre ayrılmayı gerektirebilir ve iç kanüllerin çıkarılması ilacın iç kanülden tekrar geçmesine neden olabilir. Endişe varsa, kaydın tamamı sırasında iç canül kılavuzda bırakılabilir. Aksi takdirde, kayıt bu 1 dakikalık aralıktan sonra başlayabilir.
  6. Postenfüzyon etkilerini ölçmek için her 3 dakikada bir kaydetmeye devam edin.
    NOT: Bir kontrol çözeltisi aşılıyorsanız ve herhangi bir etki gözlenmezse, ikinci kez demlenmesi mümkündür10. İç kanül veya tuzlu su infüzyonun yerleştirilmesinin neden olduğu değiştirilmiş DA salınımı varsa, sinyal genellikle 30 dakika içinde taban çizgisine geri yüklenir.

5. Elektrot yerleşiminin histolojik doğrulaması

  1. Deneyin sonunda, karbon fiber mikroelekrod kullanarak kayıt alanında küçük bir lezyon oluşturun.
    1. Elektrot deneyim sonrası kalibrasyon için korunmalıdır, daha sonra kılcal ucun ötesinde ~ 100 μm çıkıntılı bir cam kılcal damar içine yerleştirilmiş bir tungsten teli kullanın. Bu durumda, elektrot beyinden yükseltin, kayıt elektrodünü tungsten elektrot ile değiştirin ve aynı dorsoventral koordinata 2007 yılından bunlarda değiştirin.
      NOT: Karbon fiber, beyni lezyonlamak için de kullanılabilir ve kayıt alanının konumunun daha doğru bir şekilde temsilini sağlayacaktır; ancak, deneyci bu elektrotları kalibre etme yeteneğini kaybedecektir.
  2. Kayıt alanını lezyonlamak için bir güç kaynağı kullanarak voltaj uygulayın. 1 V'dan başlayın ve 10 V'a ulaşılana kadar her 10 sn'de 1 V artırın.
  3. Ölümcül bir intraperitoneal pentobarbital enjeksiyonu (150 mg / kg) kullanarak hayvanı ötenazi edin.
  4. % 4 formalin çözeltisi kullanarak sıçanı perfuse edin.
  5. Keskinleştirilmiş bir giyotin kullanarak başı sıçandan çıkarın.
  6. Rongeurs kullanarak, beyni çevreleyen bağ dokusunu ve kafatasını çıkarın ve beyni kalan herhangi bir dokudan hafifçe çıkarın.
  7. Beyni 1 gün boyunca% 4 formalin içinde saklayın ve ardından% 30 sakkaroza aktarın.
    NOT: % 4 formalin ile perfüzyon lezyon bölgesini görmek için gerekli değildir, ancak en iyi uygulama olarak lezyon bölgesinin yeniden inşasını iyileştirecektir.
  8. Kriyostat kullanarak beynin 30 μm dilimini oluşturun.
  9. Dilimleri slaytlara monte edin ve bir kapak kayması ile örtün.
  10. Hafif bir mikroskop kullanarak karbon fiber mikroelektod lezyonunun ve bipolar stimülatör/infüzyon kanülasyon konumunun yerini gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CIS-FSCV, VTA N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR), nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChRs) ve NAc çekirdeğinde fazik DA salınımının yönlendirilmesinde miskarinik asetilkolin reseptörlerinin (mAChRs) işlevini incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 negatif kontrol için temsili verileri gösterir, %0,9 salin infüzyonu, öncesi (taban çizgisi) ve 9 dk postenfüzyon (salin). Şekil 2, y ekseninde potansiyel, x ekseninde zama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CIS-FSCV, phasic DA salınımı altında kalan VTA reseptör mekanizmalarını araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlar. Doğru bir kayıt sağlamak için iki kritik adım vardır. İlk olarak, uyarılan DA sinyalinde çok az sürüklenme ile kararlı bir taban çizgisi kaydı elde edilmelidir. Kararlı bir kayıt oluşturma olasılığını artırmanın önemli bir yolu, elektrodun hem 60 Hz hem de 10 Hz'de (tipik olarak 60 Hz'de 15 dakika ve 10 Hz'de 10 dakika) döngü yapmak için bolca zamanı olduğundan emin olmaktır. Karbon fiber döngüye alınırken...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmalar Elizabethtown College (R.J.W, M.L. ve L.M.), NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) ve Yale School of Medicine (N.A.) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Elektrot Dolum Çözeltisi / Malzemeleri< / güçlü >
MikropipetDünyası Hassas AletlerMF286-5 (28 ölçer)
Potasyum AsetatSigma236497-100G
Potasyum KlorürSigmaP3911-25G
< güçlü > Elektrot Malzemeleri< / güçlü>
Karbon fiberThornelT650
Elektrot çektirmeNarishige UluslararasıPE-22Not: yatay çektirmeler de kullanılabilir
Cam kılcalA-M sistemleri626000
Elektrotlar için yalıtımlı tellerWeico Tel ve Kablo Anonim ŞirketiUL 1423Uzunluk; 10 cm; çap, 0.4mm; ısmarlama olmalı; yalıtımlı malzeme kapsamalıdır Telin 5 cm'si
Işık Mikroskobu (elektrodu görüntülemek ve kesmek için)Fischer ScientificM3700
PinPhoenix EnterprisesHWS1646Yalıtımlı elektrot teli ve referans elektrodu üzerine lehimlenmek üzere; headstage Putty'ye bağlanır
Alcolin23922-1003Karbon fiberi keserken elektrot yerleştirmek için kullanılır
Scalpal BladeWorld Hassas Aletler500239Karbon fiberi uygun uzunlukta kesmek için
Gümüş TelSigma327026-4G
FSCV Donanım/Yazılım
Faraday KafesiU-LineH-3618 (36" x 24" x 42")
PotansiyostatUniv. of N. Carolina, Elektronik Tesisi
Uyarıcı elektrotPlasticsOneMS303/2-A/SPCsipariş verirken, kaidenin altında 22 mm'lik bir kesim talep edin
TarHeel HDCV YazılımıUniversity of North Carolina-ChapelHill-ahref<="https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/" target="_blank"> https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ sipariş bilgileri için
UEI breakout boxUniv. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ sipariş için bilgi
UEI güç kaynağıN. Carolina Üniversitesi, Elektronik Tesisihttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ sipariş için bilgi
Stimulator Hardware
Nörolog uyaran izolatörüDigitimer Ltd.DS4Neurolog 800A
İnfüzyon/Stimülasyon Malzemeleri
İnfüzyon PompasıYeni Çağ Şırınga PompasıNE-300
Dahili KanülPlastikleriBirC315I/SPC DAHILI 33GA
Mikrolitre ŞırıngaHamilton80308
BoruPlastikleriBirC313CT/ PKG BORU 023 X 050 PE50<
güçlü>Cerrahi Malzemeler
Kanül TutucuKopf Aletleri1776 P-1
Pamuk Uçlu AplikatörlerVitality Medical806
Elektrot TutucuKopf Instruments1770
Isıtma YastığıKent ScientificRT-0501
Povidone İyotVitality Medical29906-004
VidalarÇalmaKemik Ankraj Vidaları / Pkg.of 1001.59 mm OD, 3.2 mm uzunluğunda
InVivo MetricE255Aile Gümüş tel referansı
Vitality Medical441408
StereotaxKopf InstrumentsModel 902 (Çift Kol Çubuğu)
Histolojik Malzemeler< / güçlü >
FormulinSigma1004960700
Güç kaynağıBK Precision9110
SükrozSigma80497
Tungsten mikroelektrotMicroProbesWE30030.5A3
< güçlü > İnfüzyonlar için ilaçlar< / güçlü>
((2 R< / em >) -amino-5-fosfonovalerik asitSigma AldrichA5282
N-metil-D-aspartatSigma AldrichM3262
Mecamilamin hidroklorür (M9020-5mg)Sigma AldrichM9020
Skopolamin hidrobromür (S0929-1g)Sigma AldrichS0929
AgCl Kare Gazlı Bez

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  2. Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
  3. Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
  4. Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
  5. Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
  6. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
  7. Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
  8. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
  9. Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
  10. Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
  11. Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
  12. John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
  13. Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
  14. Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
  15. Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
  16. Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
  17. Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
  18. Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14(2002).
  19. Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
  20. Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
  21. Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
  22. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  23. Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
  24. Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
  25. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  26. Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
  27. Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
  28. Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
  29. Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  30. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  31. Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
  32. Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
  33. Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fazik Dopamin Sal n mKombine nf zyon Stim lasyonuNucleus Accumbens CoreKarbon Fiber MikroelektrotBipolar Stim lasyon ElektroduFarmakolojik Agonistler AntagonistlerIn Vivo Kay t

İlgili makaleler