Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi

Hayvanlardaki koku sinyallerini destekleyen kimyasal değişiklikler hakkında çok az şey bilinmektedir¹, ayrıca kokuların uçucu kimyasal profillerinin kaydedilmesi ve ölçülmese metodolojik zorluklar nedeniyle². Son derece karmaşık, kimyasal matrislerle çalışırken birkaç potansiyel tuzak vardır; bunlar koku örneklerini örnekleme ve analiz ederken^{içerir 3}.

Wolverhampton Üniversitesi Rosalind Franklin Bilim Merkezi'nde, kokuların ve koku izlerinin hayvanlar tarafından nasıl kullanılabileceğini anlamak için analizini yapıyoruz. Yarı-biyoseksiktriyi davranışsal ekoloji, endokrinoloji ve sitoloji ile birleştirerek koku sinyallerinin hayvan iletişiminde oynadığı rolü anlamamızı geliştiriyoruz.

Bir metodoloji geliştirdik ve daha sonra birkaç insan dışı primat (yani taçlı lemurlar, kırmızı-fırfırlı lemurlar, Japon makaklar, zeytin babunları, şempanzeler) ve diğer memeliler (örneğin kediler, inekler) dahil olmak üzere çeşitli türlerin kokularını ve işaretlerini analiz ettik. İdrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları da dahil olmak üzere çeşitli örnekleri topladık ve analiz ettik. Bu kokular ve koku işaretleri karmaşık bileşik karışımlarından oluşur ve bu nedenle analizleri için kullanılan herhangi bir metodolojinin bir tür ayırıcı teknik içermesi gerekir. Gösterildiği gibi, ilgi çekici bileşenleri çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektiren bir dizi matriste de ortaya çıkarlar.

Vaglio ve ark.⁴ ve diğer yazarlar tarafından yapılan önceki çalışmalar⁵ gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile dinamik kafa boşluğu ekstraksiyonu (DHS) kullanılırken, doğrudan solvent ekstraksiyonu⁶ ve karmaşık solvent ekstraksiyonları⁷ de kullanılmıştır. Özellikle, dinamik kafa boşluğu örneklemesi, numune matrisi için güçlü bir yakınlık gösterenler (örneğin, sulu numunelerdeki kutup bileşikleri) hariç, sonuçta tüm uçucu bileşikleri kaldıran bilinen bir inert gaz hacmi ile kafa boşluğunun temizlenmesini içerir.

Mevcut metodoloji için, GC-MS ile birlikte headspace katı faz mikroextraction (HS-SPME) tekniğini benimsedik. Özellikle, Vaglio ve arkadaşları tarafından önceki GC-MS laboratuvarında 8 ,^9,10'dazaten kullanılan metodolojiyi geliştirdik ve geliştirdik.

Solventsiz ekstraksiyon teknikleri, küçük, yüksek uçucu bileşikleri analiz etmek için çok etkilidir (aksi takdirde bir numuneden kolayca kaybolabilir) çünkü bu yöntemler bileşikleri kararlı, katı faz desteği üzerinde hareketsiz hale getirebilir. HS-SPME, numune kafa boşluğundaki uçucu bileşikleri yakalamak veya sulu bir biyolojik sıvıya daldırarak çözünmüş bileşikleri çıkarmak için adsorbent polimer ile kaplanmış bir elyaf kullanır^11. Polimer kaplama bileşikleri güçlü bir şekilde bağlamaz, bu nedenle GC'nin enjeksiyon portunda ısıtarak çıkarılabilirler. Bu yöntem solvent ekstraksiyon tekniklerinden daha güçlüdür ve dhs'den daha etkilidir.

Mevcut yaklaşımda numuneler cam şişeler içinde bulunur. Bu şişeler, şişenin baş boşluğunda yer kaplamak için koku işaretinin uçucu bileşenlerini teşvik etmek için hayvan vücut sıcaklığını simüle etmek için 40 ° C sıcaklığa ısıtılır. 65 μm polidimetilsiloksisan/divinylbenzene (PDMS/DVB) sorbent malzeme ile kaplanmış bir SPME elyafı kafa boşluğu ortamına maruz kalır ve numuneden uçucu bileşenler fiberin üzerine adsorbe edilir. Bir GC-MS'in giriş portunda fiberin ısıtılmasında, uçucu bileşenler fiberden desorbe edilir ve daha sonra GC ile ayrılır. MS kullanılarak her bileşen için kütle spektral parçalanma desenleri elde edilir. Bu kütle spektrumlarının kütle spektral veritabanları ile karşılaştırılmasıyla, koku işaretinin bileşenlerini belirsiz bir şekilde tanımlamak mümkün olabilir. Otomatik örnekleyici kullanarak, birden fazla örneği toplu olarak tutarlı bir şekilde analiz edebiliyoruz.

Her bir SPME lifi türünün kutup kimyasalları ile farklı bir yakınlığı olduğu göz önüne alındığında, lif genellikle hedef kimyasal bileşiklerin polaritesine ve / veya moleküler ağırlığına bağlı olarak seçilir. Ek olarak, GC koşulları GC sütununun türüne ve hedef kimyasal bileşiklerin özelliklerine bağlı olarak değiştirilir.

Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz tanımlanmasını sağlayarak koku işaretlerinin uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceğini belirten koku işaretleme bileşenlerini işaretleyebilecek eğilimleri aramak için tepe alanı oranlarının analizine olanak tanır.

Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri şunlardır:

• Analiz edilebilen örnek türleri aralığı.
• Karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyon gerekmez.
• Uçucu bileşenleri analiz etme yeteneği.
• Bir karışımın bileşenlerini ayırma yeteneği.
• Algılanan bileşenleri tanımlayabilmek.
• Tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği.

1. Örnek toplama

1. Aşağıdakilerden biri olan örnek kokular:
   1. Alışılmış çalışma denekleri (örneğin, hayvanat bahçesi primatları) tarafından steril filtre kağıdında (örneğin, koku bezi koku salgıları) veya doğrudan şişelere (örneğin idrar) koku işareti yoluyla kendiliğinden salınanları toplayın.
   2. Eğitim çalışma deneklerinden sonra pozitif takviye eğitimi kullanarak steril pamuklu çubukları ovalayarak toplayın.
   3. Çalışma deneklerinin sedasyonundan sonra steril pamuklu çubukları ovalayarak toplayın.
2. Numuneleri steril 10 mL vidalı şeffaf cam şişelere yerleştirin ve FTFE/ silikon septa içeren vidalı kapaklarla kapatın. Hemen -20 °C'de saklayın.
   NOT: Nitril eldivenler gibi temiz kişisel koruyucu ekipman kullanmak hayati önem taşır; sık sık değiştirin; numuneler ve şişelerle doğrudan cilt temasından kaçının. Yepyeni şişelerin kullanılması tercih edilir; ancak, kullanılmış şişeler durumunda, şişeleri önceden temizlemek ve ardından aynı protokolü kullanmak çok önemlidir.
3. Koku işaretleri her toplandığı zaman çevresel boşluklar alın. Örneğin, örnekleme ortamı (örneğin, filtre kağıdı veya çubuk) ve örnekleme yapılırken ortama maruz kalan bir kafa boşluğu şişesini toplayın.

2. Numune hazırlama

1. Koku işaretli bir filtre kağıdından veya çubuğun başından yaklaşık 10 mm karelik bir bıçakla keserek ve 10 mL vidalı kafa boşluğu şişesine yerleştirerek alandaki örnekleri hazırlayın.
2. Her numune hazırlandıktan sonra, numune alma ortamını kesmek için kullanılan bıçağı uygun bir antibakteriyel mendil ve/veya alkol kullanarak atın veya temizleyin ve iyice kurulayın.
3. Tüm numuneleri -20 °C'de saklayın.
   NOT: -20 °C'de veya sahada mümkün olduğunca düşük bir alanda tercih edilir.

3. Analize hazırlık

1. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve en az 1 saat boyunca doğal olarak oda sıcaklığına ısınmaya bırakın.
2. GC-MS'deki analitik yöntemi aşağıdaki gibi ayarlayın:
   1. SPME analiz koşulları için, ilk kullanımdan önce SPME liflerini koşullandırmak için üreticinin talimatlarını izleyin: fiber ön koşulu (5 dakika için 260 °C), numune inkübasyonu (2 dakika için 40 °C), ekstraksiyon süresi (15 dk), desorpsiyon süresi (2 dk) ve fiber sonrası durumu (20 dakika için 260 °C).
   2. Aşağıdaki GC koşullarını kullanın: sütun (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), enjektör sıcaklığı (270 °C), debi (1 mL/dk), enjeksiyon modu (bölünmez), GC fırın profili (2 dakika için 45 °C; 4 °C/dk ila 170 °C; 20 °C/dk ila 300 °C), MSD transfer hattı (280 °C).
      NOT: Örnek saklama süresi tutarlılığı arasında iyileştirme yapmak için analitik yöntem saklama süresi kilitlidir).
   3. Aşağıdaki MSD koşullarını kullanın: solvent gecikmesi (2,5 dk) ve tarama aralığı (29 ila 400 amu).
      NOT: Önceki protokollerde 10 ila 400 arasında bir aralık kullanılmıştır⁴.
3. Fiber şartlandırma ünitesine giden temizleme gazı kaynağının açık olduğundan emin olun.
   NOT: SPME tertibatın otomatik örnekleyiciye doğru şekilde takılması ve otomatik numune alma tepsilerine, fiber şartlandırma ünitesine ve GC giriş portuna hizalanmış olması çok önemlidir. Yanlış hizalama SPME fiberinin hasar görmesine veya tahrip olmasına neden olabilir.

4. Analiz

1. GC-MS otomatik örnekleyici tepsisinin ilk konumuna boş bir kafa boşluğu şişesi (sistem boş olarak hareket etmek için) yerleştirin. Çevresel boşluğu otomatik örnekleyici tepsisinin ikinci konumuna yerleştirin. Analiz için numuneleri otomatik numune tepsisinin sonraki konumlarına yerleştirin.
2. Örnek tepsisteki her örneği analiz etmek için analitik bir sıra oluşturun.
   1. MassHunter giriş ekranında Sıralı | Yükleme sırası.
   2. Uygun bilgileri ekleyerek tüm boşluklar ve örnekler için sıra tablosunu tamamlayın. Tamamlanan sıra tablosunu kaydedin.
      NOT: Sıra tablosu için kesin bilgiler, tablo için laboratuvar biçimlendirmeye bağlı olacaktır. Minimum bilgiler normalde örnek türü, örnek adı, şişe konumu ve numarası, analitik yöntem ve veri dosyası konumu ve adını içerir (örnek adla eşleşen bir veri dosyası adının ayrılması gelecekteki veri işlemeye yardımcı olur). Analiz sırasında sıraya ek örnekler eklenebilir.
3. Sıra | seçerek sırayı çalıştırma Sırayı çalıştır.
4. Analizden sonra numuneleri mümkün olan en kısa sürede dondurucuya iade edin.
   NOT: Örneklerin yeniden analiz edilmesi mümkün olabilir, ancak bazı uçucu bileşenlerin ilk analiz sırasında tamamen çıkarılmış olabileceği ve bazı bileşiklerin 40 ° C'de termal ve bakteriyel ayrışmaya uğramış olabileceği unutulmamalıdır, bu nedenle ortaya çıkan kromatogram orijinal koku işaretini tamamen temsil etmeyebilir.

5. Veri analizi

NOT: İlk veri analizi, kromatogramların saklama süresi ve pik alan verilerini elde etmek için entegrasyonunu ve ChemStation yazılımı ve NIST (Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü) kütle spektral veritabanlarını, MSD F.01.01.2317 sürümünü kullanarak zirvelerin belirsiz bir şekilde tanımlanmasını içerir. Veri analizi manuel olarak veya yarı otomatik bir yöntemle gerçekleştirilebilir. Yarı otomatik yöntem kullanılırsa, belirsiz tanımlamaları doğrulamak için bir dereceye kadar manuel veri analizi yapmak bazen faydalıdır.

1. Sol gezinti çubuğunda uygun dosyayı tıklatarak veri dosyasını açın. Toplam iyon kromatogramı (TIC) veri analizi ekranının üst penceresinde görüntülenir.
2. RTE entegratörini kullanarak TIC'yi tümleştirmek için Kromatogram | Tümleştirme.
3. Tümleştirme parametrelerini, 3 x taban çizgisi gürültüsünden büyük tepeler entegre olacak şekilde ayarlayın. Kromatogram | Seç MS Sinyal Tümleştirme Parametreleri. Çıkış kutusunda minimum tepe alanını uygun şekilde ayarlayın (1.0 örneklerimizde kabul edilebilir sonuçlar üretir).
4. Zirveleri tanımlamak ve özet rapor oluşturmak için Raporları Dışarı Aktar | XLS'ye kitaplık arama sonuçları raporu.
   NOT: Bir kütüphane araması yapılmadan önce, görüntülenecek kitaplık eşleşmelerinin sayısı ile birlikte aranacak spektral kütüphanelerin yazılım içinde önceden ayarlanabilmesi gerekir.
5. Elde edilen elektronik tablo raporu, her tepe noktası için tümleştirme verileri ve kimlik atamak için belirsiz bir spektral kitaplık eşleşmesi içerir. Genellikle, kitaplık kalitesi/kitaplık eşleşmesi belirsiz tanımlamayı kabul etmek için >80 olmalıdır. Elektronik tabloyu kaydedin.
6. Doğrudan TIC'den bir tepe tanımlayın.
   1. İlginin zirvesini seçin.
   2. Tepe küçükse, sol el fare düğmesini basılı tutarak tepenin etrafına bir kutu çizerek yakınlaştırın, kutuyu tepenin üzerine uzatın ve bırakın.
   3. İmleç çizgisini tepenin en yüksek noktasına (veya hemen sonrasına) yerleşecek şekilde yerleştirin.
   4. Sağ fare düğmesini çift tıklatın ve tepe için kütle spektrumu veri analizi ekranının alt penceresinde görünecektir.
   5. Spektral kitaplıkta arama yapmak için imleci spektral pencerede herhangi bir yere taşıyın ve sağ fare düğmesini çift tıklatın. Kitaplık arama sonuçları yeni bir pencerede görünecektir.
   6. Arka plan gürültüsünü ilgi çekici bir spektrumdan kaldırmak için, önce söz konusu tepedeki sağ fare düğmesini çift tıklatın. Ardından, ilgi zirvesinin hemen önünde zirve olmayan bir alanda sağ fare düğmesini çift tıklatın. Kromatogram | Seç Spectra'ı çıkarın. Çıkarılan spektrum, veri çözümleme ekranının alt penceresinde görüntülenir ve pencere üstbilgislerindeki SCAN verilerinin yanında '(-)' görüntüler.

Bu protokolün ardından, kırmızı-fırfırlı lemurlar (Varecia variegata rubra) tarafından filtre kağıdına kendiliğinden salınan 14 ano-genital koku işaretinin analizinden toplam 32 uçucu kimyasal bileşik belirledik ve koku profillerini sinyalcinin özellikleriyle karşılaştırdık12. Hidrokarbonlar, terpenler, terpene alkolleri ve ketonlar gibi doğal olarak meydana gelen uçucu bileşikler bu profillerde mevcuttu ve daha önce seks feromonları ve diğer hayvan türlerinde fitness ipuçları olarak işlev gören bileşikleri içeriyordu. Belirsiz bir şekilde tanımlanan bileşikler Tablo 1'de listelenmiştir. Temsili kromatogramlar (kontrolden 1 ve lemur kokusu işaretinden 1) Şekil 1'degösterilmiştir. Bileşenlerin sayısı ve göreceli bolluğu, farklı çalışma konularında numuneden örneğe değişmektedir. Bununla birlikte, tüm örneklerde altı bileşik (benzaldehit, 2-etil-1-heksanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecane) mevcuttu.

Bu çalışmanın sonuçları, kırmızı-büzülmış lemurların seks ve kadın yaşı hakkında bilgi aktarmak için koku işareti kullandığını ve ano-genital işaretlemenin sosyo-cinsel iletişimde rol oynadığını öne sürmektedir.

Bu protokolün kullanılmasını takip eden bir başka temsili sonuç, dişi zeytin babunları (Papio anubis) (Vaglio ve ark. yayınlanmamış veriler) tarafından doğurganlık reklamı çalışmamızdı. 385 kadın babun vajinal koku örneğinin analizinden toplam 74 uçucu bileşik tespit ettik. Bu bileşikler ketonlar, alkoller, aldehitler, terpenler, uçucu yağ asitleri ve hidrokarbonlar gibi doğal olarak oluşan bir dizi kokulu uçucu bileşik içeriyordu. Boş kontrolü ve doğurgan ve doğurgan olmayan dönemlerden kadın babun vajinal koku örneklerini karşılaştırmak için kullanılan tipik kromatogramlar Şekil 2'degösterilmiştir. Vajinal koku profilleri ile kadın babunların cinsel duyarlılığı arasındaki ilişkileri inceledik. Sonuçlarımız, toplam vajinal koku miktarının doğurganlıkla farklılık gösterdiğini ve kokunun kadın babun doğurganlığının sinyalini vermede rol oynayabileceğini gösterdi. Ayrıca grup tipleri arasında vajinal koku farklılıkları bulduk ancak grup kompozisyonu, kadın yaşı ve paritesinin etkilerini ayırt edemedik.

Şekil 1. Örnek kromatogramlar; (üst kromatogram -'kontrol') kontrol örneği, kirleticileri gösterir; (alt kromatogram -'lemur kokusu-işareti') bir yetişkin dişi kırmızı-fırfırlı lemur ano-genital koku salgıları, kirleticiler ve anlamlı biyolojik bileşikler gösteren. Kırmızı oklar, tüm örneklerde bulunan altı anlamlı biyolojik bileşiği gösterir: (a) benzaldehit; (b) 2-etil-1hexanol; (c) p-cresol; (d) cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; (e) 2-pinen-4-bir; (f) pentadecane. Bu rakam Janda ve ark.12'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Kirleticileri gösteren örnek kromatogram (üst kromatogram -'kontrol') kontrol örneğinden; (orta kromatogram -'babun verimli olmayan koku') dişi zeytin babun, doğurgan olmayan dönemden vajinal koku örneği; ve (alt kromatogram -'babun verimli koku') dişi zeytin babun, verimli dönemden vajinal koku örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. ChemStation yazılımı ve NIST kütle spektral veritabanları, msd F.01.01.2317 sürümü kullanılarak belirsiz olarak tanımlanan kadın kırmızı-fırfırlı lemur ano-genital koku salgılarından filtre kağıdı örneklerinde bulunan uçucu bileşikler. Bu tablo Janda ve ark.12'den değiştirilmiştir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.