RNA-Seq Analizi ile İnsan Primer Keratinositlerin In Vitro Farklılaşmasının Karakterizasyonu

İnsan derisinden elde edilen insan birincil keratinositler genellikle epidermisin biyolojisi çalışmak için hücresel bir model olarak kullanılır^1,2,3,4. Epidermisin tabakalaşması keratinosit farklılaşması ile modellenebilir, ya 2D batık monolayer moda veya 3D hava asansörü organotipik model^2,3,5,6,7. Epidermal yapı ve fonksiyonu değerlendirmek için 3D modeller giderek daha önemli hale gelmiş olsa da, 2D farklılaşma modelleri, kolaylıkları ve analizler için çok sayıda hücre üretme olasılığı nedeniyle hala yaygın olarak kullanılmaktadır.

Serum eklenmesi, yüksek kalsiyum konsantrasyonu, düşük sıcaklık ve epidermal büyüme faktörü^{reseptörlerinin}inhibisyonu 2 ,³dahil olmak üzere, 2D keratinosit farklılaşmasıinin indüklemesi için çeşitli koşullar uygulanmıştır. Bu yöntemlerin her biri keratinosit farklılaşma belirteç genleri bir dizi tarafından doğrulanmış ve patolojik koşullar altında da dahil olmak üzere keratinosit farklılaşması değerlendirilmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Ancak, bu indüksiyon koşulları da marker genlerin belirli paneller incelendiğinde onların farklılaşma verimliliği ve kinetik farklılıkları göstermektedir^2,3.

Bu yöntemlerden biri keratinosit kontak inhibisyonu ve kültür ortamı nda büyüme faktörlerinin tükenmesi içerir⁸. Bu keratinositler hücreler tam yoğunluğa ulaştığında kendiliğinden ayırt edebilirsiniz gösterilmiştir.  Kültür ortamındaki büyüme faktörlerinin dışında kılması farklılaşmayı daha da artırabilir. Temas inhibisyonu ve büyüme faktörlerinin tükenmesini birleştiren yöntem, çeşitli epidermal belirteçler kullanırken normal tabakalı epidermis benzer gen ekspresyonu desenleri ile farklılaştırılmış keratinositler oluşturmak için gösterilmiştir³, Bu model normal keratinosit farklılaşması için uygun olduğunu düşündürmektedir. Son zamanlarda, bu modeli kullanarak keratinosit farklılaşması iki kapsamlı gen ekspresyonu analizleri bildirilmiştir^9,10. Araştırmacılar bu modeli moleküler düzeyde doğruladı lar ve normal ve hastalıklı keratinosit farklılaşmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdiler.

Bu protokol, in vitro diferansiyasyon yöntemi ve RNA-seq kullanarak farklılaşmış hücrelerin moleküler analizi için prosedürü açıklar. Ayrıca, farklılaşma günü 0 (proliferasyon aşaması), 2. gün, 4. Diferansiye keratinositlerin epidermal tabakalaşma sırasında hücrelere büyük ölçüde benzeyen gen ekspresyonu desenlerini gösterdiği gösterilmiştir. Bu yöntemin deri patolojisi üzerinde çalışılıp kullanılamayacağını incelemek için, ektoderaktili, ektodermal displazi ve yarık dudak/damak (EEC) sendromu^11,12olan hastalardan elde edilen transkripsiyon faktörü p63 mutasyonlarını taşıyan keratinositleri araştırmak için aynı deneysel ve analiz boru hattını uyguladık. Bu protokol, keratinositlerin in vitro farklılaşmasına ve rna-seq'nin sonraki biyoinformatik analizine odaklanır. RNA çıkarma, RNA-seq numune hazırlama ve kütüphane inşaatı gibi komple yordamdaki diğer adımlar iyi belgelenmiştir ve özellikle yaygın olarak kullanılan birçok ticari kit kullanılırken kolayca takip edilebilir. Bu nedenle, bu adımlar yalnızca kısa bir süre protokolü açıklanır. Veriler, bu boru hattının sağlıklı ve hastalıklı keratinositlerde epidermal farklılaşma sırasında moleküler olayların incelenmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

Deri biyopsileri sağlıklı gönüllülerin veya p63 mutasyonu olan hastaların gövdesinden alınarak primer keratinosit kültürünü nisabı kültürü ne şr; Radboud Üniversitesi Nijmegen Tıp Merkezi ("Komiser Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen") etik komitesi tarafından insan birincil keratinositlerin kurulmasına ilişkin tüm prosedürler onaylanmıştır. Bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Temas inhibisyonu ile insan primer keratinosit farklılaşması

1. Gerektiğinde Keratinosit Bazal Orta(Malzeme Tablosu)keratinosit büyüme ortamı (KGM) hazırlayın.
2. Önceden hazırlanmış stoklar kullanılarak 500 mL proliferasyon ortamı olun (KGM-pro; bkz. Tablo 1).
3. 500 mL farklılaştırma ortamı olun (KGM-dif; bkz. Tablo 2).
   NOT: KgM takviyeleri ile 4 °C'de iki hafta tutulabilir. Daha uzun depolama için -20°C'de saklanabilir.
4. Hücre proliferatif kapasitesine bağlı olarak 5.0-20 x 10³ hücre/cm²yoğunluğunda tohum primer keratinositler. Hücreleri kapsayacak kadar KGM-pro ortam ekleyin.
   NOT: 1) KGM ortamı içinde düzenli hücre kültürünün ayrıntıları Lonza¹³web sitesinde bulunabilir. 2) Tohumlama yoğunluğu her hücre hattı için test edilmelidir. Örneğin, normal bir primer keratinosit hattı 5.0 x 10³ hücre/cm²yoğunlukta tohumlanabilirken, p63 transkripsiyon faktöründe mutasyontaşıyan ve daha az proliferatif olan bir çizgi 20 x 10³ hücre/cm²yoğunlukta tohumlanmalıdır. 3) Deneysel kurulumbağlı olarak, birkaç tabak veya hücre kuyuları çoğaltmalar farklı farklılaşma gün örnekleri toplama sağlamak için tohumlu olmalıdır.
5. KGM-pro ortamı ile hücreleri tohumlamadan sonra iki gün yenileyin (0. günde tohumlama, 3. gün 1^saat için ferahlatıcı). Daha sonra, KGM-pro ortamı ile her gün yenileyin. Hücreleri düzenli olarak kontrol edin, en azından her gün.
6. Hücreler% 90'dan fazla dfluent olduğunda KGM-dif orta değiştirerek hücre farklılaşmasını neden olur. Orta nın KGM-dif olarak değiştirilmesi günü, farklılaşma günü 0 olarak tanımlanır. Daha fazla RNA analizleri için hücreleri ilk olarak DPBS ile 2x yıkayarak, daha sonra lysis arabelleği ekleyerek (RNA ekstraksiyon kitinden) toplayın.
   NOT: Yukarıda bahsedilen tohumlama yoğunluğu ile hücrelerin 7-10 gün içinde biraraya gelmesi gerekir. Hücreler daha erken bir araya ulaşmak için daha yüksek bir başlangıç yoğunluğu ile tohumlanmış olabilir. Hücreler çoğalan değilse, daha uzun süre beklemek tam olarak oluşan hücrelere yol vermeyebilir. Daha yüksek bir tohumlama yoğunluğu gerekebilir.
7. KGM-dif ortamı ile hücreleri her gün yenileyin ve 2, 4. ve daha fazla RNA çıkarma için 7.

2. RNA çıkarma

1. Toplam RNA'yı yalıtın. Bu ticari bir RNA izolasyon kiti (Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA gibi) veya fenol¹⁴kullanılarak yapılabilir. Ancak, DNA kontaminasyonunu ve fenolönlemek için RNA-seq örnekleri için DNA tedavisi içeren bir izolasyon kiti şiddetle tavsiye edilir. Ticari bir RNA izolasyon kiti örneği Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.
2. RNA konsantrasyonu spektrometre ile ölçün. Hem DNA hem de RNA 260 nm'de bir emilim tepe noktasına sahiptir.
   NOT: 1) RNA'nın saflığını değerlendirmek için 260 nm ve 280 nm'deki absorbanslar arasındaki oran kullanılır. 2.0 civarında bir oran genellikle 'saf' RNA olarak kabul edilir. Oran 2,0'dan önemli ölçüde düşükse, numune proteinler, fenoller veya diğer maddeler gibi 280 nm'de emen kirletici maddelerle kontamine olabilir. 2) 260 nm ve 230 nm'deki absorbanslar arasındaki oran nükleik asit saflığını ölçer. 2.0 ile 2.2 arasında bir oran bekleniyor. Oran önemli ölçüde düşükse, numune EDTA, etanol veya diğer maddeler gibi 230 nm'de emilen kirletici maddelerle kontamine olabilir.

3. RNA kalite kontrolü

1. RNA Bütünlük Numarası (RIN) nicel doğrulamak için bir biyoanalizör RNA Pico çip veya nitel bir ölçü için bir jel üzerinde RNA çalıştırın. Genel olarak, en az sekiz rin son derece tavsiye edilir. Ancak, dokulardan RNA çıkarılırken RIN daha düşük olabilir.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, rna malzeme üzerinde qPCR tarafından kalite kontrol yapılabilir.

4. RNA-seq kütüphane hazırlama

NOT: RNA-seq kitaplık hazırlama genellikle ticari bir kit veya ticari ayarları altında yapılır. Açıklanan protokol ticari bir kit uyarlanmıştır, KAPA RNA HyperPrep Kit RiboErase ile (Illumina), gerekli tüm adımları kısa bir açıklama ile: insan ribozomal RNA,RNA parçalanma, birinci iplikçik sentezi, ikinci iplikçik sentezi ve A-kuyruk, ve her adımdan sonra temizlik oligo hibridizasyon ile rRNA tükenmesi¹⁵. Diğer kütüphane hazırlama kitleri de bu amaç için kullanılabilir. Oluşturulan cDNA kitaplığın kalitesi genellikle daha tutarlı olduğundan, bu adımı ticari olarak kullanılabilen bir kit kullanarak gerçekleştirmeniz önerilir. 2) 1x kütüphane hazırlığı için aşağıdaki adımlar açıklanmıştır. Birkaç numune hazırlarken, %10 ekstra hacimli ana karışımlar yapın.

1. Oligo hibridizasyon ve rRNA tükenmesi
   1. Oligo hibridizasyon ana karışımını (toplam = 11 μL, 4,4 μL hibridizasyon tamponu, 4,4 μL hibridizasyon oligosu ve 2,2 μL RNase içermeyen su) ve tükenme ana karışımını (toplam = 5,5 μL, 3,3 μL tükenme tamponu ve 2,2 μL'lik Tükenme seh H) hazırlayın.
   2. PCR reaksiyon programını bir termocycler üzerine ayarlayın: 2 dk için 95 °C; rampa -0.1 °C/s'de 45 °C'ye kadar; 45 °C duraklama; 30 dk için 45 °C; 4 °C sonsuza kadar.
      NOT: Amplifikasyon için gerekenden iki kat daha fazla RNA miktarı ile başlayan düşünün. İlk denemede, aşağıdaki adımları ile devam etmek için miktarın yarısını kullanın. Bu, amplifikasyon döngülerinin yetersiz veya aşırı amplifikatöre dönüşmesi durumunda, bu adımları farklı sayıda döngüyle yinelemek için hala malzeme olduğundan emin olmaktır (bkz.
   3. 10 μL RNAse içermeyen suda 25 ng ile 1 μg arasında toplam RNA kullanın, 10 μL oligo hibridizasyon ana karışımı ekleyin. Numuneleri önceden programlanmış termocycler'a yerleştirin ve programı başlatın.
   4. Program 45 °C'de duraklama adımına ulaştığında, termocycler'dan çıkarmadan 20 μL hibridizasyon reaksiyonuna 5 l'lik tükenme ana karışımı ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın.
   5. Termocycler programına devam edin ve tükenme adımı (30 dk için 45 °C) devam edin.
      NOT: 1) Protokolün bir sonraki bölümü için tükenme adımı sırasında rRNA tükenmesi (örneğin, KAPA saf boncuklar) için boncukları oda sıcaklığına (RT) koyun. 2) Reaktifler doğrudan rRNA tükenmesi temizleme sonra gerekli olduğundan, DNase sindirim ana karışımı (bölüm 4.2 için) hazırlamayı düşünün.
   6. 2.2x boncuk bazlı KAPA Pure Boncuk temizliği yapın: RNA karışımı (25 μL) ve KAPA Pure Boncukları (55°L) birleştirerek, RNA karışımındaki boncukları birkaç kez yukarı ve aşağı boruyla ıslatarak iyice askıya alın.
   7. RNA'nın boncuklara bağlanmasını sağlamak için 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın ve sıvı temizlenene kadar boncukları yakalamak için tüpü mıknatıslı rafa yerleştirin ve 60 μL'lik süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
   8. Tüpü mıknatısın üzerinde tutarak, boncukları etanolle 30 ≥ süre kuluçkaya yatırarak 200 μL %80 etanol ile yıkayın ve etanolatın. İkinci yıkamadan sonra boncukrahatsız etmeden tüm artık etanol kaldırmaya çalışın.
   9. 3-5 dakika veya tüm etanol buharlaşana kadar RT'deki boncukları kurutun.
      NOT: Boncukların aşırı kurutulması verimin azalmasına neden olabilir.
2. DNase sindirim
   1. DNase sindirim ana karışımını hazırlayın (toplam = 22 μL, 2,2 μL DNase tamponu, 2 μL DNase ve 17,8 μL RNase içermeyen su ile) .
   2. Birkaç kez yukarı ve aşağı borulama tarafından DNaAse sindirim ana karışımı (20 μL) boncuk resuspend. RNA'yı boncuklardan çıkarmak için 3 dakika boyunca RT'deki tüpü (ler) kuluçkaya yatırın.
   3. Sıvı temiz olana kadar boncukları yakalamak için tüpü mıknatısrafına yerleştirin ve 20 μL'lik süpernatantı temiz bir tüpe dikkatlice aktarın.
   4. 37 °C'de 30 dakika boyunca tüp(ler) ile tüp(ler) inkübül.
      NOT: Reaktifler Doğrudan DNase sindirim temizliği nden sonra gerekli olduğundan, RNA elüsasyon, parçalanma ve astar ana karışımları (bölüm 4.3 için) hazırlamayı düşünün.
   5. 4.1.6-4.1.9'u takip ederek 2,2 x boncuk bazlı temizlik yapın.
3. RNA elüsasyonu, parçalanma ve astarlama
   1. Fragment, Prime ve Elute Tampon (1x) ana karışımını 11 μL Fragment, Prime ve Elute Tampon (2x) ve 11 μL RNase içermeyen su ile hazırlayın.
   2. Arıları saflaştırılmış, DNase ile işlenmiş RNA ile 22 μL'lik Parçalanma, Prime ve Elute Tampon (1x) ile birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice yeniden askıya alın.
   3. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca cin s kapalı RNAelute, sonra sıvı temizlenir kadar boncuk yakalamak için bir mıknatıs üzerine tüp (ler) yerleştirin.
   4. 20 μL'lik supernatant'ı dikkatlice bir tüpe aktarın. Tüp(ler) boncukile atın.
      NOT: Numuneler -20 °C'de 24 saat ≤ için depolanabildiği için güvenli bir durma noktasıdır.
   5. Tüpü bir termocycler yerleştirin ve 94 °C'de 6 dk boyunca parçalanma ve astarlama gerçekleştirin. Yaklaşık 200-300 bp uzunluğunda parçalar elde edilir.
      NOT: 100-200 bp parçaları için 94 °C'de 8 dk kuluçka. Kısmen bozulmuş RNA kullanırken, bozulmanın şiddetine bağlı olarak 85 °C'de 1-6 dakika arasında parçabölün.
   6. Tüp(ler) buz üzerine yerleştirin ve hemen ilk iplikçik sentezine devam edin.
4. İlk iplikçik sentezi
   1. İlk iplik sentezi ana karışımını hazırlayın (toplam = 12°L, 11 μL ilk ipliksentezi tamponu ve 1 μL KAPA komut dosyası).
   2. PCR reaksiyon programını bir termocycler üzerine ayarlayın: 10 dk için 25 °C; 15 dk için 42 °C; 15 dk için 70 °C; 4 °C sonsuza kadar.
   3. Buz üzerinde, 20 μL parçalı astarlanmış RNA ile 10 μL ilk iplik sentezi ana karışımını birleştirin. Tüp(ler) buz üzerinde tutun, yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez reaksiyon borulama tarafından iyice karıştırın.
   4. Tüpü önceden programlanmış termocycler'a yerleştirin ve programı başlatın.
5. İkinci iplikçik sentezi ve A-kuyruklu
   1. Buz üzerinde ikinci iplikçik sentezi ve A-kuyruklu ana karışımı (toplam = 33°L, 31 μL ikinci iplik sentezi tamponu ve 2 μL ikinci iplikçik sentezi ve A-kuyruklu enzim karışımı) hazırlayın.
   2. BIR termocycler pcr reaksiyon programı ayarlayın: 16 °C 30 dakika için; 10 dk için 62 °C; 4 °C sonsuza kadar.
   3. 30 μL'lik ilk iplik sentezi ürününün 30 μL'lik ikinci ipliksentezi ve A-kuyruklu ana karışımını birleştirin ve buz üzerinde birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.
   4. Tüpü önceden programlanmış termocycler'a yerleştirin ve programı başlatın.
6. Adaptör ligasyonu ve ligasyon sonrası temizleme
   1. Seyreltik stok adaptörleri (NEXTflex DNA barkodları, 25 μM) RNase içermeyen suda 7 μM'ye 3,57 x.
   2. Adaptör ligasyon ana karışımını hazırlayın (toplam = 50°L, 40 μL ligasyon tamponu ve 10 μL DNA ligaz).
   3. 60 μL ikinci iplik sentezi ürününün, 45 μL adaptör ligasyon ana karışımını ve 5 μL seyreltilmiş adaptörleri birleştirin. Buz üzerinde birkaç kez yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak iyice karıştırın.
   4. Tüpleri 20 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ilk ligasyon sonrası temizleme ile hemen devam edin.
   5. Adaptör ligatlı DNA (110 μL) ve KAPA saf boncukları (70°L) birleştirerek 0,63x boncuk bazlı bir temizlik gerçekleştirin, ardından DNA karışımındaki boncukları birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice askıya alın.
   6. Adımları 4.1.7-4.1.9'u yineleyin.
   7. Mıknatıstan tüpleri çıkarın. 10 mM Tris HCL'nin (pH = 8.0-8.5) 50 μL'lik boncukları iyice askıya alın ve boncukları 2 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
   8. Plakayı mıknatısın üzerine yerleştirin ve sıvı temize çıkana kadar bekleyin. Açık süpernatantın 50 μL'sini yeni bir tüpe aktarın.
      NOT: 4 °C'de 24 saatten az bir süre için güvenli durma noktası.
   9. 50 μL boncuk ile saflaştırılmış adaptör ligated DNA'yı 35 μL PEG/NaCL çözeltisi ile birleştirerek 0,7 x boncuk bazlı temizlik yapın. Girdap ile iyice karıştırın.
   10. Temizleme adımlarını 4.1.7-4.1.9 gerçekleştirin. 10 mM Tris HCL'nin (pH = 8.0-8.5) 20 μL'lik kısmını iyice askıya alın ve boncukları 2 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
   11. Plakayı mıknatısın üzerine yerleştirin; sıvı temizlene ne kadar bekleyin. Açık supernatantın 20 μL'sini yeni bir tüpe aktarın ve bölüm 4.7'ye ilerleyin.
       NOT: 4 °C'de 1 haftadan az veya -20 °C'de 1 aydan az bir süre için güvenli durma noktası.
7. Kütüphane amplifikasyon ve temizleme
   1. Kütüphane amplifikasyon ana karışımını hazırlayın (toplam = 33 μL, 27,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix ve 5,5 μL 10x kütüphane amplifikasyon astar karışımı).
   2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak BIR termocycler PCR reaksiyon programı ayarlayın. 45 s için 98 °C; N döngüleri (aşağıdaki nota bakınız): 98 °C 15 s; 30 s için 60 °C; 30 s için 72 °C; 72 °C 1 dk için; ve 4 °C sonsuza kadar.
      NOT: Kitaplık amplifikasyonu için döngüler giriş malzemesine bağlıdır. Kabaca şöyle tahmin edilebilir: RNA = 25-100 ng, N = 11-15 döngüleri ile başlayarak; 100-250 ng, N = 9-12 döngüleri; 250-500 ng, N = 7-10 döngüleri.
   3. Güçlendirilmiş kütüphane DNA'sı (50°L) ve KAPA saf boncukları (40°L) birleştirerek 0,8x boncuk bazlı bir temizlik gerçekleştirin, ardından DNA karışımındaki boncukları birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice askıya alın.
   4. Temizleme adımlarını 4.1.7-4.1.9 gerçekleştirin. 10 mM Tris HCL'nin (pH = 8.0-8.5) 50 μL'lik boncukları iyice askıya alın ve boncukları 2 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
   5. Açık supernatant'ın 50 μL'sini yeni bir tüpe aktarın ve ikinci kütüphane amplifikasyon temizliğine devam edin.
   6. Güçlendirilmiş kütüphane DNA'sı (50°L) ve KAPA saf boncukları (50°L) birleştirerek 1x boncuk bazlı bir temizlik gerçekleştirin, ardından DNA karışımındaki boncukları birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice askıya alın.
   7. Temizleme adımlarını 4.1.7-4.1.9 gerçekleştirin. 10 mM Tris HCL'nin (pH = 8.0-8.5) 22 μL'lik boncukları iyice askıya alın ve boncukları 2 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
   8. Açık süpernatantın 20 μL'sini yeni bir tüpe aktarın Qbit ve biyoanalizör ölçümlerine ilerleyin.
8. Konsantrasyon ve parçalanma boyutu
   1. Örneklerin DNA konsantrasyonlarını ölçün. Son derece hassas floresan boya bazlı kiti kullanarak (örneğin, Denovix Qbit, bkz. Malzeme Tablosu),veya konsantrasyon 0,5 ng/μL'nin altında görünüyorsa, daha hassas bir qPCR yaklaşımı kullanarak yeniden ölçün (örneğin, Kappa Quantification, Bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Yüksek duyarlı elektroforez (örneğin, bir biyoanalizör) kullanarak kütüphanenin parça boyutunu belirleyin.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, qPCR ile kalite kontrolü cDNA yerine seyreltilmiş hazırlanmış bir kitaplık kullanılarak sıralama (Ek) önce yapılabilir.
9. Sıralama
   1. Sıralama için kütüphaneyi gönderin. RNA-seq diferansiyel gen ekspresyonu analizi için, numune başına 10-25 milyon arasında bir okuma nın sıralama derinliği genellikle yeterlidir.

5. Veri ön işleme

1. Kalite kontrol Fastq dosyaları
   1. Düşük kaliteli baz çiftleri ve Fastq dosyaları içinde boş okuma kaldırmak için Trimgalore^16'yı indirin ve kurun.
      NOT: 1) Burada bahsedilen çoğu yazılım sadece Linux'ta çalışır. Bir Windows bilgisayarıyla sınırlıysa, MobaXterm veya Putty yazılımını kullanarak bir Linux sunucusunda analizler çalıştırmak mümkündür. Genom indeksleme için çok sayıda rastgele erişimbelleği (RAM) gerektiğini unutmayın (yaklaşık 64 GB). 2) Bir conda ortamına gerekli tüm yazılım yükleme şiddetle tavsiye edilir. Bu kolay yazılım yükleme ve paket yönetimi sağlayacaktır. Conda hakkında daha fazla bilgi için adresini ziyaret edin.
   2. 'RNA_seq_KC_diff' klasörü gibi veriler için bir dizin (klasör) oluşturun. "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/" yazarak bunu çalışma dizini olarak ayarlayın.
      NOT: Klasör yapısına genel bir bakış için, ek kodlama dosyalarındaki 'folder_structure.txt' bölümüne bakın.
   3. Çalışma dizininde belirli adlarla birkaç klasör oluşturun: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'komut dosyaları', ve 'Eşleme'.
   4. Sıralı verilerin fasta dosyalarını fastq klasörüne taşıyın. Alternatif olarak, disk alanı kazanmak için Fastq dosyalarına "ln home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" komutunu kullanarak yumuşak bağlantılar oluşturun.
   5. Fastq dosyalarında Trim galore çalıştırın, bash içine yapıştırkopyalamak için kod için TrimGalore.txt dosyasına bakın. Gerektiğinde komut içindeki klasör adlarını ve ayarlarını değiştirin.
2. Eşleme
   1. Okumaların haritasını çıkarmak için bir genom indirin, örneğin, hg38 ensembl sürüm 97 (maskesiz sürüm): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; ve ilgili gen ek açıklama dosyası: hg 38 gen ek açıklama ensembl sürüm 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Her iki dosyayı da CRCh38_fasta klasörüne aktarın.
      NOT: Alternatif olarak genomun farklı bir sürümünü kullanın, örneğin, hg38'in UCSC sürümü, gen iLikleri yerine transkript d'lerine haritalama tercih ediliyorsa.
   2. STAR 2.7.1¹⁷yükleyin.
   3. Oluşturmak genom komut star 2.7.1 kullanarak bir in-house referans genom oluşturun (Ek Kodlama Dosyalarıbakınız). İş parçacığı miktarını işleyicinin sahip olduğu işlem miktarıyla değiştirin (--runThreadN X). Gerektiğinde bu komut dosyasındaki klasör adlarını ve ayarlarını değiştirin. Kopyalayarak/yapıştırarak bash'a çalıştırın.
   4. Bam dosyaları dizine ekin ve wiggle dosyaları sıkıştırmak için gzip için samtools 1.9¹⁸ yükleyin.
   5. Trim Galore doğrulanmış sıralama okumalarını insan genomu montajı hg38 (ensembl release 97) star 2.7.1 kullanarak ve ardından samtools ve gzip kullanarak indeksleme ile hizalayın. Bu komut dosyası map_fastq.txt kullanılarak yapılmalıdır (Bkz. Ek Kodlama Dosyaları). Gerektiğinde bu komut dosyasındaki klasör adlarını ve ayarlarını değiştirin. Kopyalayarak/yapıştırarak bash'a çalıştırın.
      NOT: STAR eşleme, bir bam dosyası, bir kıpırdanma dosyası ve deseq2 için giriş olarak kullanmak üzere R tarafından concatenated doğrudan kullanılabilir *_ReadsPerGene.out.tab adlı sayımları tablo okumak dahil olmak üzere çeşitli çıkış dosyaları oluşturur.
3. Genom tarayıcı görselleştirme
   1. Big2bw script¹⁹ile bigwig dosyaları oluşturmak için UCSC genom tarayıcı araçları wigToBigWig yükleyin.
   2. 'convertBigWigChroms.py' ve 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' dosyalarını tamamlayıcı kodlama dosyalarından çalışma dizinindeki bir klasöre 'komut dosyaları' olarak aktarın.
   3. ConvertBigWigChroms.py çalıştırılabilir hale getirin (linux makinesinde 'chmod +x komutları/convertBigWigChroms.py' komutunu kullanarak).
   4. Komut dosyası wig2bwkullanarak, Wiggle dosyaları bigWig dosyaları oluşturun.txt (Ek Kodlama Dosyalarıbakınız). Kopyalayarak/yapıştırarak bash'a çalıştırın.
   5. Görselleştirme için UCSC genom tarayıcısı veya Tümleştirici Genomik Görüntüleyici (IGV) üzerine BigWig dosyalarını girin.

6. RNA-seq veri analizi

1. Örnek verileri Deseq2'ye girme
   1. Rstudio (sürüm 1.1.456) ve R (sürüm 3.6) indirin ve yükleyin.
   2. Gerekli tüm R paketlerini yükleyin (bkz. Ek kodlama dosyaları).
      NOT: Tüm programlama kodunu ve çıktısını gösteren ayrıntılı bir R-markdown dosyası için, ekteki dosyalara bakın: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" ve "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Tüm adımların genel bir açıklaması aşağıda verilmiştir.
   3. ReadsPerGene.out.tab dosyalarından bir sayım tablosu oluşturun.
   4. Tüm dosya adlarını, farklılaşma gününü ve diğer ilgili örnek verileri içeren bir örnek veri dosyası yazın. Örnek bir örnek dosya için, Ek Kodlama Dosyaları'ndaki"sample_data_example.csv" adlı dosyaya bakın.
   5. Hem sayılabilir hem de örnek verileri içeren bir Deseq2²⁰ nesnesi oluşturmak için sayım tablosunu ve örnek verileri kullanın.
2. Gen ekspresyonu normalizasyonu, örnek mesafesi ve PCA
   1. Deseq2 rld veya vst normalleştirme kullanarak Deseq2 nesnesindeki sayım tablosunu normalleştirin. Rld normalleştirme tercih edilir, ancak birçok örnekile vst normalizasyonu çok daha hızlıdır.
   2. R'deki "dist" fonksiyonu kullanılarak normalleştirilmiş okuma sayısı yoğunluklarına dayalı çizim örneklem mesafesi ve daha sonra örnek uzaklığı temel alınarak "hclust" kümeleme gerçekleştirir. Pheatmap paketini kullanarak ısı haritasının kendisini çizin.
   3. Deseq2'nin plotPCA işlevini kullanarak normalleştirilmiş okuma sayısı yoğunluklarının bir PCA çizimini oluşturun.
      NOT: PCA, araştırmacı veri analizinde bir araç olarak hizmet vermektedir ve farklı örnekler arasındaki mesafeyi ve akrabalığı görselleştirmek için kullanılabilir.
3. Diferansiyel/yüksek değişkenli gen ekspresyonu analizi
   1. Deseq2 sonuç işlevini kullanarak diferansiyel genleri hesaplayın. Ancak, çift yönlü karşılaştırmaların geçerli olmadığı birkaç zaman puanındaki değişiklikleri değerlendirirken, son derece değişken genler kullanın. Bu durumda, rowVars fonksiyonu ile farklı zaman noktalarından örnekler arasındaki varyans sipariş yoluyla ilk 500 son derece değişken genleri ayıklayın.
      NOT: Analizlerimizde, kontrol örnekleri için, daha fazla analiz için en yüksek değişken 500 gen (farklılaşma günlerinde normalleştirilmiş yoğunluklarının en yüksek standart sapması olan genler) kullanılmıştır. Ancak, hastalıklı vs kontrol analizi için hastalık ve zaman içinde sağlıklı kontroller arasında farklı ifade genler deseq2 tarafından 1 x 10^-4 bir cutoff olarak düzeltilmiş p-değeri kullanılarak hesaplanmıştır. Başka bir olası filtreleme adımı, diferansiyel genlerin belirli bir kıvrım değişiminden daha az değişen kesimi dışlamaktır.
   2. Diferansiyel veya çok değişken genler üzerinde farklı ifade desenlerine göre kümelemek için kmeans kümeleme gerçekleştirin.
   3. Pheatmap paketini kullanarak bir ısı haritasında diferansiyel veya çok değişken genleri görselleştirin. Isı haritasında çizilen yoğunluk, ortanca değeri çıkarılmış deseq2 normalleştirilmiş yoğunluk.
4. Gen Ontolojisi (GO) ek açıklama zenginleştirme analizi
   1. Tek bir örnekte 10'dan fazla sayıma sahip tüm genleri alarak ifade edilmiş arka plan genlerinin bir listesini oluşturun.
   2. GOrilla²¹gibi çevrimiçi araçları kullanarak GO analizi gerçekleştirin. Kümelerdeki diferansiyel/yüksek değişkengenlerin listelerini "gen listesi" olarak ve arka plan genlerini karşılaştırma için arka plan olarak kullanın.
      NOT: Daha gelişmiş R kullanıcıları Go vadeli zenginleştirme analizini otomatikleştirmek için clusterProfiler²² paketini kullanabilir.

Normal keratinosit farklılaşması ve RNA-seq analizi
Bu deneyde, beş kişiden elde edilen keratinosit çizgileri farklılaşma ve RNA-seq analizleri için kullanılmıştır. Şekil 1, farklılaşma ve RNA-seq analizi sonuçlarının deneysel prosedürünü özetler. Normal keratinositlerin in vitro farklılaşma prosedürlerine genel bir bakış ve farklılaşma sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri Şekil 1A'dagösterilmiştir. İlke komponent analizi (PCA), farklılaşma geçiren keratinositlerin bağlı ancak farklı genel gen ekspresyonu profilleriolduğunu göstermiştir(Şekil 1B). Çok değişken genler farklılaşma sırasında gen ekspresyonu dinamiklerini ve desenlerini görselleştirmek için kmeans tarafından kümelenmiştir(Şekil 1C).

Genlerin her kümesi keratinosit farklılaştırma özelliği genleri (örneğin, proliferasyon için KRT5, erken ve orta farklılaşma için KRT1ve KRT10 ve geç farklılaşma için IVL/LOR/FLG) tarafından temsil edildi. Yüksek değişkengen kümelerinin gen ontolojisi (GO) ek gösterimi analizi(Şekil 1C)bu gen kümelerinin gen fonksiyonlarında (örneğin, farklılaşmanın orta evrelerinde keratinizasyon; ve epidermal hücre farklılaşması, keratinosit farklılaşması ve geç evrelerde peptit çapraz bağlanması) açık bir fark göstermiştir; Şekil 1D). Birkaç farklılaşma belirteçlerinin protein ekspresyonu batı lekeleme ile ölçüldü (Şekil 1E).

P63 mutant keratinosit farklılaşması ve RNA-seq analizi:
İkinci deneyde, hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu farklılıkları sağlıklı kontrollerden alınan keratinositler ile p63 mutasyonu taşıyan hastalardan elde edilen üç çizgi (Mutantlar R204W, R279H ve R304W) arasında karşılaştırıldı. Şekil 2A, farklılaşma prosedürleri ve hücre morfolojisi değişikliklerine genel bir bakış gösterir. Mutant keratinositler çanak yüzeyinde düz kaldı ve kalabalık olmadı ya da 7.

PCA analizinde, kontrol hücresi çizgileri Şekil 1Bile karşılaştırıldığında açıkça bir farklılaşma deseni izlemiştir. Ancak, farklılaşma sırasında mutant hücrelerin gen ekspresyonu deseni büyük ölçüde çoğalan / farklılaşmamış hücrelerin benzer kalır. Üç mutant hattı arasında, R279 örnekleri ayırt edici pc1 ve PC2 boyunca bir ölçüde taşındı, onun farklılaşma r204W ve R304W ile karşılaştırıldığında, daha az bozulmuş olduğunu gösteren.

Kümeleme analizinde(Şekil 2C),kontrol hücrelerinde (küme 1) küçültülen genler R204W ve R279W'da kısmen indirgenmiş, ancak gen ekspresyonu R304W'de büyük ölçüde değişmemiştir. Bu genler büyük olasılıkla hücre çoğalmasında rol oynarlar, GO ek açıklamalarında gösterildiği gibi (Şekil 2D). Küme 2'de(Şekil 2C),genler ilk olarak kontrol hücrelerinde indüklendi ve daha sonra indirgendi. Epidermal farklılaşma ve keratinizasyon fonksiyonları bu küme genleri için yüksek oranda zenginleştirilmiş olduğundan, bu genler muhtemelen keratinosit farklılaşmasında rol oynarlar (Şekil 2D). Bu genler R204W ve R304W'da indüklenmezken, R279H hücrelerinde bu genler kontrol hücreleri kadar küçültülmemiştir.

Küme 3'teki genler sadece kontrol hücrelerinde farklılaşma sonunda indüklenmiştir(Şekil 2D). Bununla tutarlı olarak, bu genler epidermisin dış tabakasında rol alabilir, dış uyaranlara ve inflamasyona duyarlı oldukları gösterilmiştir(Şekil 2D). Bu genlerin ekspresyon deseni üç mutant hücre hattında da çok fazla değişmedi. Kontrol ve mutant hücreler arasındaki gen ekspresyonu desenleri görünür farklılıklar mutant hücrelerin bu in vitro farklılaşma modellerinde düzgün ayırt edemez göstermektedir.

Şekil 1: Keratinosit farklılaşması ve analizi. (A) Keratinosit farklılaşma protokolü ve hücre morfolojisi genel bakış. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Diferansiyel kontrol keratinositlerinin prensip bileşen analizi. (C) Keratinosit farklılaşması sırasında ilk 500 değişken genin ısı haritası. Genler kmean kümeleme kullanılarak üç kümehalinde kümelenir. Yan tarafta her gen kümesi için temsili farklılaşma belirteç genleri gösterilir. (D) GO, yüksek değişkengen kümelerinde genler için aşırı temsil edilen fonksiyonların zenginleştirme analizi, tüm ifade edilen genlerin arka planına kıyasla (>10 sayısı). GOrilla zenginleştirme testi için kullanıldı. (E) Farklılaşma sırasında keratinosit farklılaşma belirteçleri Batı leke. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kontrol ve p63 mutant keratinositlerin karşılaştırılması. (A) Keratinosit farklılaşma protokolü ve kontrol hücre morfolojisi ve p63 mutant keratinositlere genel bakış. Ölçek = 100 μm. (B) Farklılaşma kontrol ve hasta (R204W, R279H & R304W) keratinositler prensibi bileşen analizi. (C) Kontrol ve mutant keratinositler arasındaki diferansiyel genlerin ısı haritası. Genler kmean kümeleme kullanılarak üç kümehalinde kümelenir. Her gen kümesi için temsili farklılaşma belirteç genleri endikedir. (D) GO, yüksek değişkengen kümelerinde genler için aşırı temsil edilen fonksiyonların zenginleştirme analizi, tüm ifade edilen genlerin arka planına kıyasla (>10 sayısı). GOrilla zenginleştirme testi için kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. KGM-pro orta takviyeleri.

Tablo 2. KGM-diff orta takviyeleri.

Ek Kodlama Dosyaları: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt; Map_fastq.txt; RNA_seq_kc_differentiation_patient.html; RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; ve Wig2bw.txt. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.