Yöntem makalesi

Taşınabilir QPCR Sistemi ile Matricaria chamomilla Alan Tanımlama

DOI:

10.3791/60940

⸱

10 Ekim 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory, Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality, Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance, University of Guelph

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak Matricaria chamomilla alan tanımlama için bir protokoldür. Bu kolay gerçeklene kadar yapılan protokol, çiftlikler ve depolar gibi laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu yerlerdeki bir botanik türün kimliğini doğrulamak için ideal bir yöntemdir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botanik ürünlerde kalite kontrol hammadde temini ile başlar. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme ve kimyasal analitik yöntemlerle gerçekleştirilir. Ancak, özellikle son yıllarda botanikçilerin kullanılabilirliği eksikliği, artan tüketici talebi ve iklim değişikliğinin getirdiği tedarik zinciri üzerindeki streslerle mücadele etmek için kalite kontrolünü artırma ihtiyacı ile birleştiğinde, alternatif yaklaşımlar gerektirmektedir. Bu protokolün amacı, laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı olduğu sahada veya herhangi bir ortamda taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak botanik türlerinin tanımlanmasını kolaylaştırmaktır. Hedef DNA boya bazlı qPCR kullanılarak yükseltilir ve DNA pozitif kontrol görevi görehizmet eden botanik referans malzemelerden elde edilir. Hedef DNA, spesifik amplifikasyon ulabilmekte ve erime tepesini pozitif kontrolle eşleştirerek tanımlanır. Okuyucuların bu protokolü kopyalayabilmesini sağlamak için, uygulamalı alan örnek koleksiyonundan DNA çıkarma, PCR amplifikasyonve ardından veri yorumuna kadar adım ve parametrelerin ayrıntılı bir açıklaması eklenmiştir. Üretilen sonuçlar geleneksel laboratuvar botanik tanımlama yöntemleri ile uyumlu. Protokolün gerçekleştirilmesi kolay ve uygun maliyetlidir ve hammaddeler üzerinde tedarik zincirinin çıkış noktasına mümkün olduğunca yakın kalite testi sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlık korumak ve iyileştirmek için botanik kullanma uygulaması binlerce yıl öncesine dayanıyor. Artan tüketicitalebi1 getirdiği tedarik zinciri üzerinde stresler nedeniyle , sürdürülemez hasat uygulamaları ve iklim değişikliği2, botanik zina gıda ve diyet takviyesi sanayi3büyüyen bir endişe haline gelmektedir . Bildirilmemiş veya yanlış tanımlanmış botanik türlerinin varlığı etkinliğin azalmasına, hatta güvenlik sorunlarına yol açabilir. Örneğin, karayılan(Actaea racemosa),premenstrüel rahatsızlık tedavisinde kullanılan, etkinliği için sınırlı klinik veri desteği ile düşük fiyatlı Asya türleri ile değiştirilebilir4. Daha ciddi bir durumda, Çin otlar kullanarak kilo kaybı için bir klinik çalışmada Stephania terandra için Aristolochia fangchi ikame bazı katılımcılarda şiddetli nefrotoksisite ve böbrek yetmezliğine yol açtı5,6. İki farklı tür, Çin'in ortak adı "Fang Ji"yi paylaşıyordu. Bu durumlarda daha sıkı kalite kontrolü için ihtiyaç vurgulamak, hammadde belirlenmesi ile başlayan7, tercihen mümkün olduğunca tedarik zincirinin başlangıç noktasına yakın, böylece kaynaklar verimli bir şekilde doğru kimlik malzeme tahsis edilebilir.

Botanik tanımlama için bir dizi ortogonal yaklaşım kullanılabilir. Geleneksel olarak, botanik tanımlama morfolojik değerlendirme8,9 ve kimyasal analitik yöntemler10,11,,12,13ile gerçekleştirilir. Morfolojik tanımlama, bitki materyallerinin makroskopik ve mikroskobik özelliklerindeki farklılıklara dayanmaktadır (Şekil 1). Ancak, son yıllarda klasik botanik eğitim programlarının eksikliği uzman sıkıntısı neden oldu14, rutin kalite kontrolü için bu yaklaşımı pratik hale. Toz botanik malzemelerde uygulanması da sınırlıdır. Farmakope ve laboratuvarlarda kimyasal analitik yöntemler yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak Yüksek Performanslı İnce Tabaka Kromatografisi (HPTLC), Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ve Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (Şekil2)gibi enstrümanların büyüklüğü nedeniyle saha testleri için ideal değildir. Son zamanlarda, genomik yöntemler botanik türlerin kimlik doğrulama ve ikame algılama için alternatif bir teknik olarak ortaya çıkmıştır ve verimli ve hassas olduğu kanıtlanmıştır. Genomik yöntemler bitki materyallerinde genetik bilginin yüksek sadakat ve özgüllüğünü kullanır15,16,17,18,,19. Moleküler tanı araçları taşınabilir cihazlar şeklinde mevcuttur, ve genellikle teknoloji kullanımı için engeli düşürmek otomatik veri yorumlama araçları içerir, alan tanımlama için ideal bu yaklaşım yapma20,21,22,23,24. Moleküler analiz yöntemi25,26,,27olarak tasarlanmış ve doğrulandıktan sonra, temel moleküler biyoloji eğitimi almış herhangi bir personel tarafından yapılabilir. Mevcut farklı taşınabilir araçlar arasında, DNA dizileri üzerinde gerçek zamanlı PCR maliyet-etkin seçeneklerden biridir28. Taşınabilir bir cihazın birleşimi, özelleştirilmiş ve doğrulanmış moleküler analizle birlikte, laboratuvar dışında, çiftlikler ve botanik malzeme depoları gibi botanik türlerinin ve malzemelerin doğrulanmasına olanak sağlar ve geleneksel yöntemlerle ilişkili zaman ve maliyetleri azaltır.

Bu protokolün amacı, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanarak laboratuvar ekipmanı ve uzmanlığına erişimin sınırlı veya kullanılamadığı durumlarda botanik tanımlama yöntemi ni tanıtmaktır. Yöntem Matricaria papatya bir alanda gösterilmiştir (Şekil 3A), yaygın Olarak bilinen Alman papatya, yaygın anti-inflamatuar ve antioksidan özellikleri için kullanılan29. Özellikle Chamaemelumcinsi, Tanacetumve Krizantem30,31,32'den benzer görünüm veya kokunun ilgili türleri ile karıştırılabilir.31 İlgili türler arasında, Chamaemelum nobile, Ayrıca Roma papatya olarak bilinen, ticaret karşılaştırılabilir üretim düzeyleri ile fark edilir biridir (Şekil 3B). Gösterilen yöntem sadece hedef botanik türleri M. papatyatanımlamak için tasarlanmıştır , ama aynı zamanda yakın akrabası tespit, C. nobile, DNA dizilerinin belirli amplifikasyon dayalı.

Bu makalede, taşınabilir bir cihazda intercalating boya tabanlı qPCR ve erime eğrisi analizi kullanarak M. papatya alan botanik tanımlama nasıl gerçekleştirilecektir, ayrıntılı olarak açıklar. Protokol, sahadan botanik numunelerin toplanmasını, yerinde DNA çıkarılmasını ve gerçek zamanlı PCR reaksiyonunun ayarlanmasını içerir. Geçerli bir sonuç sağlamak için, hedef botanik M. papatya ve non-target botanik C. nobile genomik DNA, önceden sertifikalı botanik referans malzemelerden çıkarılan, pozitif kontrol olarak kullanılır. Bu yöntemin özgüllüğü hem M. papatya hem de C. nobile tanımlama testlerinin numuneler ve kontroller üzerinde ayrı ayrı gerçekleştirilmesi ile gösterilmiştir. PCR kontaminasyonundan kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları dışlamak için şablon dışı negatif denetim kullanılır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Örnek toplama

  1. Düz ve yatay bir yüzeye sahip bir test alanı ayarlayın.
  2. Papatya çiçeği alanındaki bitkilerin çoğunluğunun özelliklerini yansıtan temsili bir bitki tanımlayın(Şekil 4).
  3. Steril eldiven kullanarak temsili bitki bir çiçek kafası seçin.
  4. Numuneyi 2,0 mL toplama tüpüne yerleştirin.
  5. 1,3 ila 1,4 adımlarını tekrarlayın ve aynı bitkiden bir broşür (yaklaşık 0,5-0,7 cm uzunluğunda) toplayın.
    NOT: M. papatya çiçeği ve yaprağı 2.0 mL toplama tüpünün altında oturacak kadar küçüktür. Daha geniş yüzey alanına sahip diğer botanikler için, bir kağıt zımba veya makas (kullanmadan önce% 70 etanol içinde durulanır) test için doku örnekleri izole etmek için kullanılabilir. Birden fazla örnekleme gerektiğinde, farklı numunelerin işlenmesi arasında kağıt zımbaveya makas durulayın.

2. DNA çıkarma

  1. Kuru banyo kuluçka makinesini 95 °C'ye önceden ısıtın.
  2. Her toplama tüpüne, bitki DNA ekstraksiyon kitinden 100 μL çıkarma çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir). Daha iyi DNA ekstraksiyon verimliliği için, bir doku pestle kullanarak ekstraksiyon çözeltisi doku örneği eziyet.
  3. Tüpü kapatın. Botanik doku çıkarma işlemi boyunca ekstraksiyon çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun.
  4. Toplama tüplerini önceden ısıtılmış kuru banyo kuluçka makinesine yerleştirin ve toplama tüplerini 95 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. 10 dakika sonra, kuru banyo kuluçka tüpleri dışarı atın.
  6. Aynı DNA çıkarma kitinden 100 μL seyreltme çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak karıştırın.
  7. Broşür çıkarma için aynı adımı tekrarlayın.
  8. Çözeltiyi daha fazla karıştırmak için sallayın. Bitki dokusu genellikle bu tedaviden sonra bozulmuş görünmüyor. Sıvı rengi değişebilir ve bulutlu olabilir.
    NOT: Seyreltilmiş çözelti hemen devam etmiyorsa oda sıcaklığında bir gecede saklanabilir. Depolamadan önce hücreli enkazı bitki dokusundan çıkarmak gerekli değildir. Tüplerdeki sıvı, pcr amplifikasyonu için DNA şablonlarını tutar.

3. PCR reaksiyon kurulumu

  1. QPCR alet termobisiklet koşullarını üreticinin özelliklerine göre yapılandırın. PcR termobisiklet profilini ilk denatürasyon için sabit bir sıcaklık adımı ilebaşlayan,ardından 25 döngü amplifikasyon ile başlayan ve yüksek çözünürlüklü bir erime eğrisi elde etmek için sıcaklık rampasıyla sona eren PCR termobisiklet profilini uygulayın.
  2. QPCR Master Mix ve astarları(Tablo 2)kullanmadan önce oda sıcaklığında eritin.
  3. Her kuyuya yüklenecek reaksiyonu planlayın: Hedef türlerle pozitif kontrol içeren kuyular, hedef olmayan türlerle pozitif kontrol, örnekler ve negatif kontrol(Şekil 5).
    1. Bu örnekte, on kuyu kullanılır – Alman papatya tanımlama testi için beş, Roma papatya tanımlama testi için kalan beş kuyu. Her tür tanımlama testi için, bir kuyu hedeflenen türlerin referans materyalinden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, bir kuyu hedeflenmemiş türlerin referans materyalinden çıkarılan DNA ile pozitif kontrol içerir, iki kuyu tarladan çıkarılan çiçek ve yaprak DNA örnekleri ile doldurulur ve bir kuyu negatif kontrol için ayrılmıştır. Tablo 3 her kuyu türünü açıklar.
  4. Her botanik tür tanımlama testi için kılavuza göre bir reaksiyon master-mix hazırlayın. Tipik bir reaksiyon master-mix evrensel qPCR Master Mix (2x), ileri ve ters türlere özgü astarlar ve nükleaz içermeyen su içerir. Tablo 4 reaksiyon sistemi kompozisyonu listeler.
    NOT: Hemen kullanmıyorsanız, qPCR reaksiyon ana karışımını +2 °C ile +8 °C arasında bir soğutucuda veya mini buzdolabında saklayın.
  5. Kullanmadan önce pipetleme ile reaksiyon ana karışımını iyice karıştırın.
  6. QPCR kartuşunu düz ve sabit bir yüzeye yüz üstü yerleştirin.
  7. Adım 3.4'te yapılandırılan reaksiyon master karışımının 18 μL'sini, 3.3'te tanımlanan kuyulara göre kartuş kuyularına yükleyin. Bu gösteri için, GC testi (GCT kuyu1, 3, 5, 7, 9) ve Roma papatya kimlik testi reaksiyon ana karışımı için etiketlenmiş kuyular içine Alman papatya kimlik testi test reaksiyonu ana karışımı ekleyin RC testi için etiketli kuyular içine (RCT kuyu2, 4, 6, 8, 10) (Şekil 5bakınız).
  8. DNA ekstraksiyon tüplerinin süpernatantından 2 μL'lik örnek DNA'yı ve önceden çıkarılmış DNA pozitif kontrollerini qPCR ana karışımı ile önceden yüklenmiş kartuş kuyularına aktarın. QPCR ana karışımına her DNA şablonu ekledikten sonra, çözeltiyi pipetleme ile hafifçe karıştırın.
    NOT: DNA çıkarma tüpünden DNA aktarırken yüzen hücresel enkazdan kaçının. Gerekirse supernatant ve hücresel enkaz ayırmak için minicentrifuge kullanın.
  9. Kartuşunu yapışkan filmle dikkatlice kapatın. Kartuşu termobisiklet odasına yükleyin ve kapatın.
  10. QPCR aracını çalışacak şekilde ayarlayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bölüm 1'de açıklanan protokolün ardından, 95 °C'de 10 dakika boyunca toplama tüpünün ısı kuluçkasından sonra çiçek başı ve yapraktan botanik DNA'sı süpernatant içine çıkarıldı. Mevcut çalışmada, supernatant hem çiçek hem de yaprak için sarı ve yeşilimsi bir renk gösterdi, doğal bileşiklerçeşitli botanik DNA ile supernatant içine serbest olduğunu belirten(Şekil 6). Güvenilir PCR amplifikasyon daha sonra tüm alan çıkarılan DNA şablonu için triplicate elde edilmiş olsa da, DNA kalite değerlendirmesi referans olarak laboratuvarda yapıldı. Florürler tarafından belirlenen çiçek başı DNA ekstresinin konsantrasyonu 3.69-5.36 ng/μL arasında değişirken, yaprak DNA ekstresinin konsantrasyonu 6.42-9.29 ng/μL arasında değişmektedir. A260/A280 ve A260/A230 çiçek ve yaprak DNA özleri emicilik oranları spektrofotometri ile ölçüldü. Ancak, DNA ve fitokimyasal UV emilim spektrumu arasındaki örtüşme nedeniyle, bu oranlar güvenilirlik ölçüldü (veriler gösterilmedi).

Hedef parçaların gerçek zamanlı olarak amplifikasyonunun izlenmesi için floresan boyanın ara sıra kullanılması. Hem özel astarlar M. papatya ve C. nobile hedef iç transkripsiyonlu spacer 2 (ITS2) bölge, hangi bitki genomu yüzlerce kopya onlarca vardır, 25 PCR amplifikasyon döngüleri papatya türlerinin belirlenmesi için yeterli amplicons oluşturmak için yeterlidir. Şekil7'de, M. papatya tanımlama testinde M. papatya pozitif kontrolü için Ct değeri 25 'ten (GCP_GCT) az iken, 25 amplifikasyon döngüsünden sonra, C. nobile tanımlama testinde aynı kontrolün floresansı tespit eşiğinin altındaydı (GCP_RCT). Öte yandan, 25 döngüden sonra, M. papatya tanımlama testinde C. nobile pozitif kontrolü için floresan algılama eşiğinin (RCP_GCT) altında iken, C. nobile tanımlama testinde aynı kontrol için Ct değeri 25 'ten (RCP_RCT) daha azdı. Kendi tahlillerinde hedef ve hedef olmayan pozitif kontrollerin amplifikasyonu, M. papatya tanımlama testinin özgüllüğünü göstermektedir. Örnek DNA için, alan çiçek kafası ve yaprak DNA ekstresi, M. papatya tanımlama testinde sırasıyla (Sample1(FLOWER)_GCT ve Sample2(LEAF)_GCT) 15.18 ve 19.41 Ct değerleri vermiştir. Bu örneklerin her ikisi de C. nobile tanımlama testinde (Sample1(FLOWER)_RCT ve Sample2(LEAF)_RCT) olarak yükseltilmedi. Her iki numunenin amplifikasyon desenleri M. papatya pozitif kontrolün amplifikasyon deseniile eşleşti. PCR kontaminasyonunneden olduğu yanlış pozitifler olasılığı dışında hem M. papatya hem de C. nobile tanımlama testlerinde (NC_GCT ve NC_RCT) negatif kontroller güçlendirilmedi. Pozitif kontrolve numunelerde spesifik amplifikasyonu doğrulamak için, her kuyudan PCR son ürün fraksiyonları laboratuvarda %2 agarose jel üzerinde çalıştırıldı(Şekil 8). M. papatya tanımlama testi için, her iki saha numunesi de M. papatya pozitif kontrolü ile aynı pozisyonda çalışan ve tahmini boyutu 100 bp'nin biraz üzerinde (teorik boyut 102 bp) amlikon verdi. C. nobile tanımlama testi için, hedef olmayan türler C. nobile pozitif kontrol 50 ve 100 bp arasında bir bant, 65 bp teorik boyutu uygun bir bant verdi. Şeritlerin geri kalanı, saha testlerinde gözlendiği gibi, bu kuyular için floresan sinyal yokluğu ile aynı fikirde olan özel bir amplifikasyon ürünü göstermedi.

PCR amplifikasyonundan sonra, ısıtma sırasında çift iplikli DNA'nın (dsDNA) dissosifikasyon özelliklerini değerlendirmek için bir erime eğrisi analizi yapıldı. Erime eğrisi analizi için son döngü sırasında sıcaklık arttıkça, sıcaklıktaki artışlar çift iplikli amperlerin ayrışmasını neden oldu. Ara floresan boya yavaş yavaş çözeltiiçine salındı, floresan yoğunluğu azalan (Şekil 9A). İlk türev eğrinin çekim noktası, esas olarak DNA parça uzunluğuna ve GC içeriğine bağlı olan erime sıcaklığını (Şekil9B)belirlemek için kullanılmıştır. Ct değerinin erime sıcaklığı ile birleştirilmesi qPCR analizinin özgüllüğünü artırabilir. Bu çalışmada, M. papatya pozitif kontrol PCR amplicon erime sıcaklığı zirve oluştu 85.6 °C (GCP_GCT) ve 79.1 °C (RCP_RCT) de C. nobile pozitif kontrol PCR amplicon erime sıcaklığı zirvesinden farklıydı. Alan çiçeği kafası ve yaprağındaki PCR amplicon sırasıyla 85.2 °C ve 84.8 °C'de erime sıcaklık zirveleri üretti (Sample1(FLOWER)_GCT ve Sample2(LEAF)_GCT). Taşınabilir qPCR sistemi ile ölçülen erime sıcaklığı değişimlerini değerlendirmek için, numune erime sıcaklıklarının M. papatya pozitif kontrolünden (2 °C içinde) elde edilen erime sıcaklığına her zaman yakın olduğunu ve C. nobile pozitif kontrol amperinin erime sıcaklığından çok uzak olduğunu doğrulamak için ek veri noktaları toplanmıştır (Şekil 10). Erime sıcaklık zirveleri bazen diğer kuyularda bildirilmiştir. Ancak, Ct değerleri 25'ten az değildi ve erime sıcaklık zirveleri M. papatya veya C. nobile pozitif kontrolüne yakın değildi (2 °C'den fazla ara).

Özetle, alan M. papatya tanımlama testi Tablo 5'teözetlenen karar kurallarına göre yorumlanabilir. Tüm pozitif kontroller putatif botanik türleri için pozitif test, diğer türler için negatif ve negatif kontroller negatif test ile, her iki alan örnekleri M. papatya değil, C. nobileiçerdiği tespit edildi. Buna ek olarak, alan testi sonuçlarını diğer analitik tekniklerle hizalamak için, alan sonuçları daha önce onaylanmış bir DNA barkodlama yöntemi25 (veriler gösterilmemiştir) ile daha da doğrulandı.

figure-results-1
Şekil 1: Botanik malzemelerin morfolojik tanımlaması. (A) Hibiscus rosa-sinensis çiçekleri, Curcuma longa kökleri, Malva Sylvestris yaprakları, Rosmarinus officinalis yaprakları, Coriandrum sativum tohumları, Zingiber officinale kökleri. (B) Petroselinum crispum ve Apium graveolens pulları ayırt etmek zordur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Botanik malzemelerin kimyasal olarak tanımlanması. (A) HPTLC cihazı ve temsili bir HPTLC kromatogramı. (B) HPLC cihazı ve temsili hplc kromatogramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Matricaria chamomilla ve Chamaemelum nobile alanında. (A) Matricaria papatya, CC BY-SA 3.0 altında Wikipedia uyarlanmıştır, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, Wikipedia'dan CC BY-SA 3.0 altında uyarlanmıştır, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Tarladan M. papatya bitki parçaları toplama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Gösterideki test kuyularının düzeni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Toplama tüplerinde alan DNA ekstresi. Botanik doku orijinal tüp kalır ve sarımsı DNA ekstresi ile kaplıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: PCR ürünlerinin 25 döngü termobisiklet üzerinde birikmesini gösteren floresan çizimi. M. papatya pozitif kontrol ve C. nobile pozitif kontrol, Sırasıyla M. papatya ve C. nobile tanımlama testlerinde 25'ten az Ct değerleri göstermektedir. Tarla çiçeği ve yaprak örnekleri 15.18 ve 19.41 Tomografi değerleri ile M. papatya tanımlama testi ile güçlendirilmiştir. Kuyuların geri kalanı güçlendirilemedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Alan PCR amplifikasyon ürünlerinin jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Erime sıcaklık analizi. (A) Her kuyudaki floresan sinyali artan sıcaklıkla azalır. (B) PCR ürünlerinin kimliği erime eğrisi analizinde erime sıcaklığının zirvesi ile doğrulandı. Tarla çiçeği ve yaprak örnekleri 85.2 °C ve 84.8 °C'de zirveleri göstermektedir. Bu M. papatya pozitif kontrol tarafından üretilen tepeyakındır. C. nobile pozitif kontrolü 79.1 °C'de bir tepe üretti ve bu da diğer üç örnekten farklıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10: Erime sıcaklığı pozitif kontrol ve alan örnekleri arasındaki en yüksek değişimdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SahneDöngüsüSıcaklıkSaat
Sabit Sıcaklık195 °C60s
Amplifikasyon2595 °C30s
60 °C30s
Erime Eğrisi160 °CRampa 0.05 °C/s
95 °C

Tablo 1: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için qPCR termobisiklet koşulları.

TahlilAstar adıSıra 5'-3'KonumBölgeAmplicon Boyutu
Matricaria recutitaZL3TCGTCGGTCGCAAGGATAAGIleriITS2102 bp
ZL4TAAACTCAGCGGGTAGTCCCTers
Chamaemelum nobileZL11TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCAIleriITS265 bp
ZL12TCGAAGCGTCATCCTAAGACAACTers

Tablo 2: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için astar çiftleri.

İyi pozisyonPeki adıAçıklama
1GC_PosCtrl_GC_TestGC Testi kapsamında Alman papatya pozitif kontrolü
2GC_PosCtrl_RC_TestRC Testi altında Alman papatya pozitif kontrolü
3RC_PosCtrl_GC_TestGC Testi altında Roma papatya pozitif kontrolü
4RC_PosCtrl_RC_TestRC Testi altında Roma papatya pozitif kontrolü
5Field_Sample_GC_TestGC Testi altında yaprak dokusu örneği
6Field_Sample_RC_TestRC Testi altında yaprak dokusu örneği
7Field_Sample_GC_TestGC Testi altında çiçek dokusu örneği
8Field_Sample_RC_TestRC Testi altında çiçek dokusu örneği
9NegCtrl_GC_TestGC Testi kapsamında negatif kontrol örneği
10NegCtrl_RC_TestRC Testi kapsamında negatif kontrol örneği

Tablo 3: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için iyi tipler ve açıklamalar.

ReaktifGC_TestRC_Test
Evrensel qPCR Mix*10 μL10 μL
ZL3 astar (10 μM)0,4 μLNa
ZL4 astar (10 μM)0,4 μLNa
ZL11 astar (10 μM)Na0,4 μL
ZL12 astar (10 μM)Na0,4 μL
H2O (Nükleaz içermez)7.2 μL7.2 μL
* Sıcak Başlangıç Taq DNA Polimeraz içerir

Tablo 4: M. papatya ve C. nobile tanımlama testleri için master-mix kompozisyonu.

Iyi AdıBeklenen SonuçPozitif Sonuç KriterleriNegatif Sonuç Kriterleri
Algılanan / MevcutAlgılanmadı / Yok
GC_PosCtrl_GC_TestAlgılandıCt < 25 ve 84 <= Tm <= 86-
GC_PosCtrl_RC_TestAlgılanmadı-25 döngü içinde Ct değeri yok
RC_PosCtrl_GC_TestAlgılanmadı-25 döngü içinde Ct değeri yok
RC_PosCtrl_RC_TestAlgılandıCt < 25 ve 79 <= Tm <= 81-
Field_Sample_Leaf_GC_TestMevcutCt < 25 ve 84 <= Tm <= 8625 döngü içinde Ct değeri yok
Field_Sample_Leaf_RC_TestYok-25 döngü içinde Ct değeri yok
Field_Sample_Flower_GC_TestMevcutCt < 25 ve 84 <= Tm <= 8625 döngü içinde Ct değeri yok
Field_Sample_Flower_RC_TestYok-25 döngü içinde Ct değeri yok
NegCtrl_GC_TestAlgılanmadı-25 döngü içinde Ct değeri yok
NegCtrl_RC_TestAlgılanmadı-25 döngü içinde Ct değeri yok

Tablo 5: QPCR sonuç yorumu için kurallar.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astar tasarımı ve şablon seçimi verimli ve özel bir qPCR amplifikasyon elde etmek için önemli adımlardır. Uygun bir şablon belirledikten sonra, astar tasarım yazılımı genellikle astar uzunluğu, erime sıcaklığı ve GC içeriği33,34gibi tasarım değişkenlerine dayalı astar seçimine yardımcı olmak için kullanılır. Optimizasyon ve doğrulama, PCR reaksiyonunun özgüllüğünü, hassasiyetini ve sağlamlığını sağlamak için tahminbeklenen deneysel koşulları altında gerçekleştirilebilir35. Sub-optimal astar tasarımı astar-dimer oluşumuna neden olabilir, astar etkileşimleri spesifik olmayan ürünler üretmek ise36.

Bu çalışmada kullanılan şablon denetimleri (NTC) hem DNA kontaminasyonu hem de testi etkileyebilecek astar-dimerlerin varlığını kontrol eder. Sonuçlar amplifikasyon göstermedi, hem DNA kontaminasyonu hem de astar-dimerlerin bir sorun olmadığının iyi bir göstergesi. DNA kontaminasyonu ve astar-dimerhiçbir şablon kontrolleri ile erime eğrileri tezahür ve pozitif kontrollerin erime eğrileri ekstra zirveleri olarak. Genellikle, şablondaki AT açısından zengin alt etki alanları düzensiz erimeye neden olmadıkça, pozitif kontrolün erime eğrisinin tek bir tepe içermesi beklenir. Çift zirveleri uMELT yazılımı37kullanarak erime tahlilleri simüle ederek tahmin edilebilir. Bu çalışmada, hedef PCR ürününün varlığını ve kontaminasyon ve astar-dimer eksikliğini doğrulamak için AGAROSE jel üzerinde PCR ürün çalışan altın standart kullanılmıştır.

Botanik malzeme moleküler analizinde önemli bir sorun, botanik DNA çıkarma işleminden sonra kaliteli DNA elde etmektir. Botanik malzemeler ticareti ve sağlık yararları ile ilişkili aktif kimyasal bileşikler için tüketilen. DNA çıkarma sürecinde, bu kimyasal bileşikler de DNA çıkarma çözeltisi içine serbest bırakılacak, potansiyel PCR inhibisyonu neden, pcr amplifikasyon başarısızlıkları ile sonuçlanan. Çeşitli bitki DNA arıtma kitleri organik çözücüler ve sütunlar kullanarak botanik elde edilen kimyasal bileşikleri kaldırmak için geliştirilmiştir38. Ancak, duman başlık ve yüksek hızlı santrifüj bu kitleri yardımcı olmak için gerekli alanında mevcut değildir.

Mevcut protokolde, basitleştirilmiş DNA çıkarma yöntemi ticari bir bitki DNA çıkarma kiti kullanır (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakınız). Bu tekrarlanabilir sonuçlar için ortak inhibitör maddeleri nötralize etme yeteneğine sahip ve M. papatya ve C. nobile için tutarlı sonuçlar üretti. Hem M. papatya ve C. nobile çiçek kafaları ve yaprakları belirli erime zirveleri ile PCR amplicons verdi, PCR inhibitörleri varlığı bir endişe olmadığını gösteren. PCR inhibitörleri daha yüksek düzeyde olan diğer tesisler için, orijinal ekstraksiyon DNA yükseltici daha az verimli olabilir. İnhibisyonu azaltmak ve amplifikasyon verimliliğini artırmak için, tüm tesise erişim ile, düşük polisakkarit ve polifenol içeriği ile diğer bitki parçaları da tanımlama amacıyla kullanılabilir. Farklı bitki parçaları sınırlı erişim varsa, genç yaprakları veya yaprakları çiçek başları, genellikle düşük fenolik içeriğe sahip kesilir39, başarı daha iyi bir şans sunabilir. DNA dizileri tüm bitki boyunca tutarlı olduğundan, herhangi bir bitki parçası türlerin kimliğini doğrulamak için kullanılabilir. PCR amplifikasyonu hala yetersiz ise, orijinal DNA özü PCR'den önce daha da seyreltilebilir veya daha gelişmiş laboratuvar arıtma protokolleri kullanılabilir.

PCR analizi için bir diğer sorun dna kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar, hangi olumsuz veri yorumlanması etkileyebilir. Genellikle aktif temizlik, özel ekipman kullanarak ve belirlenen alanlarda iş kısıtlayan tarafından kontrol edilir. QPCR kullanılarak, tüm PCR analizi kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir, bu da iyi kontrol edilemeyen bir ortamda PCR amplicon kontaminasyonu olasılığını büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, çevresel DNA da bir önceki doğrulama çalışmasına göre, bir önceki doğrulama çalışmasına göre, töz özgüllüğü nedeniyle yanlış pozitif göstermemelidir40.

İyileştirme için yer var. Burada sunulan protokolde, hedef parça amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak göstermek için ara boya kullanılmıştır. Yöntemin özgüllüğü, M. papatya ve C. nobile amfikonları arasında farklı olan karakteristik erime sıcaklığı ile daha da doğrulanır. Bu nedenle, boya bazlı PCR'nin ara sınıfa yansıtLanması, "Bu bitki türü nedir?" sorusuna verimli bir şekilde cevap verebilir. Ancak, tarladan izole edilmiş tek bir tesis üzerinde botanik tanımlama nın yanı sıra, birçok durumda, depodaki botanik tozlar veya ekstreler de yerinde hızlı kimlik değerlendirmesinden yararlanacaktır. Bu tür malzemeler için "Bu materyalde ne var?", "Aradığım botanik türleri içeriyor mu?", "Kaçınmak istediğim zina ları içeriyor mu?", "Zararlı diğer botanik türler tarafından tamamen veya kısmen mi değiştiriliyor?" gibi ek soruların ele alınması gerekebilir. Farklı qPCR probları, bir reaksiyon sisteminde farklı botaniklerden gelen ampliconları hedef almak için tasarlanmış, aynı zamanda yüksek özgüllük ve verimi korumak için intercalating boya kullanmak yerine. Prob tabanlı qPCR'nin geliştirilmesi ve birden fazla kanal tespiti sunan taşınabilir bir qPCR sisteminin kullanımı, saha testinin amacı için uygun bir test olarak uygulanmasını, daha karmaşık soruları yanıtlamak için botanik malzeme depoları ve dağıtım merkezleri gibi daha geniş bir ortam ayarına genişletebilir. Buna ek olarak, birden fazla prob kullanarak da kullanıcı her reaksiyon sistemi dahilamplifikasyon dahil sağlar, böylece PCR inhibisyonu şüphelenildiğinde daha fazla bilgi kullanılabilir olacaktır.

Burada sunulan protokol, aynı amaçla kullanılan mevcut teknolojilere göre aşağıdaki avantajlara sahiptir. İlk olarak, geleneksel morfolojik ve kimyasal tanımlama yöntemleri için, prosedür ve sonuçları nın uzmanlar tarafından yürütülmesi ve yorumlanması gerekmektedir. qPCR tabanlı tanımlama testleri temel moleküler biyoloji eğitimi almış kişiler tarafından yapılabilir ve daha standart bir şekilde yorumlanabilir. İkinci olarak, normalde laboratuvarda gerçekleştirilen qPCR tabanlı tür tanımlama ve farklılaştırma ile karşılaştırıldığında, taşınabilir bir alet kullanarak alan tanımlama protokolü, yüksek hızlı santrifüj, DNA kalite değerlendirme ekipmanı, floresan dedektörlü termal çevrimci ve özel bir yazılım çalıştıran bilgisayar gibi büyük ayak izine sahip aletler gerektirmez. Böylece DNA tabanlı türlerin tanımlanması herhangi bir ortamda gecikmeden gerçekleştirilebilir. Üçüncü olarak, botanik malzeme aramak küresel bir işlem gerektiren bir görevdir. Bulut hizmetleri ve yapay zekadaki gelişmelerle, taşınabilir bir cihaz laboratuvardaki uzmanlar tarafından geliştirilen ve doğrulanan yöntemleri alabilir, uzak bölgelerde uzman olmayanlar tarafından çalıştırılabilir ve üçüncü taraflardan objektif sertifikalar üretebilir. Bu nedenle, bu seçenek her zamankinden daha uzak çalışma eğilim haline ile daha zorlayıcı.

Özetle, buradaki protokol, taşınabilir bir qPCR sistemi kullanılarak M. papatyanın alan tanımlamasını göstermiştir. Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, botanik tanımlama konusunda son derece doğru sonuçlar üretecek ve botanik üreticilerinin ve tedarikçilerinin botanik malzemelerini zamanında ve uygun maliyetli bir şekilde nitelendirmelerinde yardımcı olacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zhengxiu Yang, Zheng Quan, Tiffany Chua, Leo Li, Yanjun Zhang, Silva Babajanian, Tricia Chua, Peter Chang, Gary Swanson, Zhengfei Lu'nun Herbalife International of America, Inc. çalışanları olduğunu belgeliyoruz. Francesco Buongiorno, Isabella Della Noce ve Lorenzo Colombo'nun bu makalede kullanılan taşınabilir qPCR cihazını üreten Hyris Ltd. çalışanları olduğunu belgelendiriyoruz.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

James Shan'a saha video kaydındaki çabaları için teşekkür ederiz. Biz video düzenleme çalışmaları için Jon Byron ve Matthew Semerau teşekkür ederiz. Ansen Luo, Harry Du ve Frank Deng'e test alanının yerini belirlemedeki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Maria Rubinsky'ye tüm el yazması hakkındaki değerli yorumları için teşekkür ederiz. Kabul edilen tüm kişiler Herbalife International of America, Inc. şirketinin çalışanlarıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PilTNE78000mAhSaha güç kaynağı sağlayın
bCUBEHYRISbCUBE 2.0Taşınabilir qPCR cihaz
Kartuşları (16 Kuyulu)HYRISNASarf Malzemeleri
EppendorfNAİşleme sıvı
Ekstrakt-N-AmpTM tesisi PCR kitiSIGMAXNAP2-1KTBitki DNA ekstraksiyon kiti
Alman papatyası (Matricaria chamomilla L) çiçek botanik referans malzemeleriAHP2264Pozitif kontrol olarak kullanılır
Mini kuru banyoYooningMiniH-100LDNA ekstraksiyonu için
Nükleaz içermeyen suAMBIONAM9937qPCR reaksiyonu
PrimerThermo Fisher ScientificNAqPCR reaksiyon
Roma papatyası (Chamaemelum nobile) çiçek botanik referans malzemeleriChromaDexASB-00030806-005Pozitif kontrol olarak kullanılır
Luna evrensel qPCR ana karışımıNEBM3003LqPCR reaksiyonu
bCUBE Elektrikli pipet için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
  2. Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36(2008).
  3. Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
  4. Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
  5. Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
  6. Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
  7. Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a "quality by design" approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
  8. Applequist, W. The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , Missouri Botanical Garden Press. (2006).
  9. Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy - Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , CRC Press. (2016).
  10. Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug - the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
  11. Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
  12. Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
  13. Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
  14. Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF's Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
  15. Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
  16. Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
  17. Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
  18. Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
  19. Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
  20. Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
  21. Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
  22. Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4(2016).
  23. Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
  24. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228(2016).
  25. Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
  26. Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
  27. Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473(2012).
  28. Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
  29. Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82(2011).
  30. Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325(2004).
  31. Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
  32. Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
  33. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
  34. Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 71-74 (2007).
  35. Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
  36. Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
  37. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), Oxford, England. 1019-1020 (2011).
  38. Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
  39. Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
  40. Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Botanik Tan mlamaDNA EkstraksiyonuErime E risi AnaliziAlman PapatyasRoma PapatyasSaha TestleriqPCR AmplifikasyonuBotanik Kalite Kontrol

İlgili makaleler