Yöntem makalesi

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

DOI:

10.3791/60950

⸱

8 Haziran 2020

 ,  ,  , 
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) teknikleri konvansiyonel floresan mikroskobun optik kırınım sınırını aşmak ve hücre içi yapıları ve biyomoleküllerin dinamiklerini ~20 nm hassasiyetle çözebilir. SMLM için bir ön koşul, binlerce veri toplama çerçevesinin her birinde nokta yayma işlevlerinin mekansal-zamansal çakışmasını önlemek için karanlıktan floresan duruma geçiş yapan floroforlardır. BODIPYs konvansiyonel mikroskopikullanılan çok sayıda konjuge ile iyi kurulmuş boyalar vardır. Kırmızı-shifted BODIPY yer-hal dimerlerinin (DII)geçici oluşumu, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) sağlayan parlak tek molekül salınımı ile sonuçlanır. Burada yaşayan maya ve memeli hücrelerinde geleneksel BODIPY konjugatları ile SMLM için basit ama çok yönlü bir protokol salıyoruz. Bu yordam, süper çözünürlüklü görüntüler elde etmek ve BODIPY konjugalarının mekano-zamansal bilgilerini ayıklamak için tek bodipy-DII durumlarını izlemek için kullanılabilir. Bu işlemi, nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan maya ve memeli hücrelerindeki lipid damlacıklarını (LD'ler), yağ asitlerini ve lizozomları gidermek için uyguluyoruz. Ayrıca, diğer floresan problarla birlikte kullanıldığında BODIPY boyaları ile çok renkli görüntüleme yeteneğini gösteriyoruz. Temsili sonuçlarımız, beslenen ve oruç lu koşullarda mayadaki BODIPY-yağ asitlerinin ve nötr lipidlerin diferansiyel uzamsal dağılımını ve hareketliliğini göstermektedir. SMLM için bu optimize edilmiş protokol, ticari olarak kullanılabilen yüzlerce BODIPY konjugasyonuyla kullanılabilir ve bu çalışmanın uygulamalarının çok ötesinde nano ölçekte biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir kaynaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM) teknikleri Abbe optik kırınım sınırı1ötesinde bilgi ile süper çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için yöntemler olarak ortaya çıkmıştır1 ,2 ve tek biyomoleküllerin dinamiklerini izlemek için3,4. SMLM ile uyumlu problar için gereksinimlerden biri, nokta yayma fonksiyonlarının (PSF) mekansal çakışmasını önlemek için herhangi bir zamanda aktif florofor sayısını kontrol edebilme yeteneğidir. Binlerce veri toplama çerçevesinin her birinde, her floresan floresan floresan floresan'ın konumu, karşılık gelen nokta yayma fonksiyonuna uygun olarak ~20 nm hassasiyetle belirlenir. Geleneksel olarak, floroforların on-off yanıp stochastic fotoanahtarlama11,2,,5 veya kimyasal olarak intrinsic yanıp sönen6ile kontrol edilmiştir. Diğer yaklaşımlar bir florojen aktive proteingeçicibağlama üzerine florojen indüklenen aktivasyon dahil7 ,8 ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya hafif levha uyarma etiketli DNA oligomerlerin programlanabilir bağlayıcı-bağlayıcı olmayan9. Son zamanlarda, smlm için yeni ve çok yönlü etiketleme stratejisi bildirdi10 hangi daha önce rapor kırmızı-shifted dimeric (DII) konvansiyonel bor di-pirometan (BODIPY) durumları11,,12,13 geçici olarak şekillendirme ve özellikle heyecanlı olmak ve kırmızı-shifted dalga boyları ile tespit.

BODIPYs yaygın olarak kullanılan boyalar özellikle etiket alt hücresel bölmeleri ve biyomolekülleri yüzlerce ile boyalar14,15,16. Canlı hücrelerde kullanım kolaylığı ve uygulanabilirliği nedeniyle, BODIPY varyantları konvansiyonel floresan mikroskobu için ticari olarak mevcuttur. Burada, yüzlerce ticari olarak kullanılabilen BODIPY konjugatlarının canlı hücreli SMLM için nasıl kullanılabileceğini anlatan ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz. BODIPY monomerlerinin konsantrasyonu ayarı ve uyarma lazer güçleri, görüntüleme ve veri analizi parametreleri optimize edilerek, canlı hücrelerde yüksek kaliteli süper çözünürlüklü görüntüler ve tek molekül izleme verileri elde edilir. Düşük konsantrasyonda (25-100 nM) kullanıldığında, BODIPY konjugatları aynı anda kırmızı kaydırmalı kanalda SMLM ve konvansiyonel emisyon kanalında korgöreceli konvansiyonel floresan mikroskopi için kullanılabilir. Elde edilen tek molekül verileri hareketsiz yapıların mekansal organizasyonunu ölçmek ve canlı hücrelerdeki moleküllerin diffüzive durumlarını ayıklamak için analiz edilebilir17. BODIPY problarının hem yeşil hem de kırmızı formlarda kullanılabilirliği, diğer uyumlu floroforlarla doğru kombinasyonda kullanıldığında çok renkli görüntülemeye olanak tanır.

Bu raporda, bodipy-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 kırmızı ve lisotracker-yeşil birden fazla renk kullanarak canlı hücre SMLM verilerinin elde alınması ve analiz için optimize edilmiş bir protokol sağlık edin. Canlı maya ve memeli hücrelerindeki yağ asitlerini ve nötr lipitleri ~30 nm çözünürlükte çözeriz. Ayrıca maya hücrelerinin metabolik durumlarına bağlı olarak dıştan eklenen yağ asitlerinin mekansal dağılımını düzenlediğini de gösteriyoruz. Eklenen BODIPY-yağ asitlerinin (FA) endoplazmik retikulum (ER) ve lipid damlacıklarına (LD) beslenen koşullar altında lokalize olduğunu, BODIPY-FAs'lerin ise açlık üzerine plazma zarında LD dışı kümeler oluşturduğunu görüyoruz. Bu tekniğin uygulanmasını yaşayan memeli hücrelerindeki görüntü ve ld'lere de genişletiyoruz. Konvansiyonel BODIPY konjugatlarını kullanarak SMLM için optimize edilmiş protokolümüz, mevcut sayısız BODIPY konjugatları ile nano ölçekte biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir kaynak olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Maya klonlama ve endojen etiketleme için lütfen son yayınımız10'abakın.

1. Görüntüleme için maya hücresi örneklerinin hazırlanması

  1. Bir w303 maya zorlanma bir sıvı gecede kültür hazırlayın. Steril bir ahşap sopa kullanarak, maya ekstresi içeren bir agar plaka maya hücrelerinin küçük bir miktar nokta-pepton-dekstroz sentetik tam dekstroz ~ 2 mL ile bir kültür tüpü içine (SCD) orta. Tüpü gece boyunca 270 rpm ve 30 °C'de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
  2. SCD'deki hücrelerin sabah 1:50 seyreltilmesini gerçekleştirin. Seyreltilmiş hücreleri 30 °C'de 4 saat boyunca 270 rpm sallayarak inkübatörde kültüre devam edin, böylece hücreler üstel fazda büyüyebilir ve ~0,6 optik yoğunluğa (OD) ulaşabilirsiniz.
    NOT: İşlem burada hangi metabolik durum üzerinde çalışıldığına bağlı olarak değişebilir. BODIPY konjugatları üstel büyüme aşamasında ki hücreleri gerektirmez. Ancak, sabit faz sırasında ölü hücrelerden gelen otofloresan farkında olun, tek BODIPY-DII yayıcılar analiz etmek için çok güçlü bir arka plan sinyali neden olabilir gibi.
  3. Açlık hücrelerini incelemek için, medya alışverişi olmadan 2 gün boyunca maya kültürünü büyütün.
  4. Hücreleri kaplamadan ~30 dakika önce oda sıcaklığında deiyonize H2O'da 80 mg/mL steril Concanavalin A (ConA) ile odacıklı bir kapak camı kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra, deiyonize H2O ile üç kez kapak camı yıkayın.
  5. Görüntülemeden önce ~30 dk'da, pipet odacıklı kapak camındaki hücreler, ~0,12 optik yoğunluk elde etmek için doğru taze SCD hacmine sahip (genellikle 240 μL SCD'de OD~0,6'da 60 μL maya kültürü). Hücreleri yerleşmek ve 30 dakika cona yüzeyine yapışır.
  6. ~ 100 nM son konsantrasyonunda odacıklı coverglass doğrudan istenilen BODIPY eşlenik ekleyin.
    NOT: Belirli bir hücresel bölmedeki BODIPYs yerel yoğunluğuna bağlı olarak bir BODIPY konsantrasyon optimizasyonu deneyi gerekebilir.

2. SMLM görüntüleme için memeli hücrelerinin hazırlanması

  1. Bir T25 şişesinde %10 fetal sığır serumu, 4 mM glutamin, 1 mM sodyum pirüuvat ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotikler ile floresan olmayan DMEM'deki memeli U2OS hücrelerini koruyun.
    NOT: DMEM'de %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotikleri ile hücreler de tutulabilir, ancak otofloresan olmayan bir solüsyon ile görüntülemeden önce ortamın değiştirilmesi gerekmektedir.
  2. Hücreleri %70-80'lik bir birleşmeyle 8 kuyunun tek bir kuyusu içinde 1:5'te bölün. Kültür görüntüleme den önce 12-24 saat için 8-iyi plaka hücreleri.
  3. BODIPY-C12,LysoTracker Yeşil veya başka bir BODIPY 100 nM (dimetil sülfoksit stok çözümleri [DMSO]) 10 dk önce görüntüleme son konsantrasyonunda eşlenik ekleyin. Bu süre istenilen deneye göre değişebilir.
    NOT: Canlı hücre görüntüleme solüsyonu kullanılarak ortam sıcaklığında (23 °C) görüntüleme yapılabilir. Ancak, %10 fetal sığır serumu, 4 mM glutamin, 1 mM sodyum pirüuvat ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotiklerile karıştırılarak floresan olmayan DMEM ile %37 °C ve %5 CO2'de görüntüleme, hücreleri fizyolojik koşullara yakın tutmak ve biyolojik sonuçlara varmak için tercih edilir.

3. Ekipman hazırlama

  1. Kullanılan BODIPY emisyon rengine göre emisyon yoluna uygun filtre kümelerini monte edin.
    NOT: Dört bantlı dikroik ayna (zt/405/488/561/640rdc) önce uyarma yı emisyon ışığından ayırır. Yeşil emisyon (525 nm) ve kırmızı emisyon (595 nm) daha sonra bir dichroic uzun pas Kiriş bölücü (T562lpxr) ve band-pass filtreleri ET525/50 yeşil kanal ve ET 595/50 kırmızı kanal da takip tarafından bölünür. İki kanal daha sonra aynı kamera çipinin farklı alanlarına yansıtılır. Benzer şekilde, kırmızı emisyon (595 nm) ve uzak kırmızı emisyon ilk dichroic uzun pas kiriş bölücü (FF652-Di01) tarafından daha sonra bant-pass filtreleri ET 610/75 kırmızı ve FF731/137 uzak kırmızı kanal da ayrılır.
  2. Mikroskop, mikroskop aşaması, lazerler (488 nm, 561 nm) ve kamerayı açın. Burada mükemmel bir odak lama sistemine sahip ters bir mikroskop ve -68 °C'ye soğutulmuş bir EMCCD kamera kullanılmaktadır.
  3. Mikroskop hedefi üzerine bir damla daldırma yağı ekleyin.
  4. Parlak alan görüntüleme, lazer güçleri, lazer panjurlar ve görüntüleme için kamera ayarları için LED ışığını kontrol eden Hal4000 yazılımını (Malzeme Tablosu'nabakın) açın. EMCCD kazancını 30'a, kamera sıcaklığını -68 °C'ye ayarlayın. 20 Hz'de film kaydetmek için kamerayı ve ilgili yazılımı hazırlayın.
    NOT: Bu teknik, foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM) ve stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) görüntüleme yeteneğine sahip geniş alan mikroskobu için geçerlidir. İlgili yazılımlar değişebilir.
  5. Mikroskop kademeli ısıtıcıyı açın ve 37 °C'lik bir sıcaklığa ve %5 CO2 seviyesine ayarlayın. Nesnel düzeltme yakasını buna göre ayarlayın.
  6. Numuneyi mikroskop aşamasına monte edin ve odaklama sistemi devreye girene kadar odaklanın. Görünüm alanında sağlıklı hücreler görünene kadar sahne denetleyicisini kullanarak sahneyi taşıyın.
    NOT: Oda sıcaklığında maya hücreleri ile görüntüleme için ısıtıcıyı veya CO2 kontrolünü açmanız gerekmez.
  7. Monomerlerin uyarılması için uygun lazerleri ve dimerleri açın. BODIPY yeşil veya LysoTracker yeşil için, biz SMLM için DII durumları heyecanlandırmak için 561 nm lazer ve geleneksel floresan için monomerler heyecanlandırmak için 488 nm lazer kullanın.
    NOT: BODIPY kırmızısı için, SMLM için DII durumlarını heyecanlandırmak için 640 nm lazer ve konvansiyonel floresan için monomerleri heyecanlandırmak için 561 nm lazer kullanın. BODIPY kırmızısı için, 561 nm ve 640 nm lazer güçlerini ayarlayarak kırmızı kanaldaki toplu floresanve uzak kırmızı kanaldaki tek molekül patlamalarını görselleştirin. 561 nm için tipik güç ~ 0.06 W/cm2 ve ~ 5 kW/ cm2 640 nm için. BODIPY yeşil için, aynı zamanda 561 nm uyarma altında yeşil emisyon kanalında geleneksel floresan görmek için bekliyoruz. BODIPY kırmızı için, 640 nm uyarma altında kırmızı kanalda geleneksel floresan görmek için bekliyoruz. Bu sinyal anti-Stokes salınımından kaynaklanır, bu da sürekli lazer uyarma ile monomer/dimer co-lokalizasyon görüntüleri için yararlı hale gelir.

4. Veri toplama

  1. Monomerlerin ve dimerlerin uyarılması için lazer deklanşör dizilerini yükleyin.
    NOT: Biz genellikle 561 nm'de dokuz tek moleküllü uyarma çerçevesi ve ardından 488 nm'de bir konvansiyonel uyarma çerçevesi kullanırız. Bu daha parlak bir konvansiyonel floresan sinyali sunar ve çok renkli görüntüleme uygulamalarında kırmızı tek moleküllü algılama kanalına yeşil floresan protein (GFP) gibi başka bir 488 nm uyarılabilir floresan florofor sızıntısını önler. Alternatif olarak, 561 nm lazeri sürekli olarak açın ve daha kısa dalga boyu kanalındaki geleneksel görüntüler için anti-Stokes salınımına güvenin.
  2. Lazer güçlerini, tek moleküllü floresan patlamalarının 561 nm uyarma altında kırmızı kaydırmalı emisyon kanalında algılanıp 488 nm uyarma ile yeşil emisyon kanalında görünmesi gibi ayarlayın. 561 nm lazerin tipik lazer güçleri SMLM için 0,8-1 kW/cm2, geleneksel floresan görüntüleme modunda 488 nm lazer için 0,035-0,07 W/cm2 civarında olacaktır.
  3. Filmler için bir hedef klasör seçin ve süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturmak için yeterli yerelleştirmeleri toplamak için 5.000-20.000 edinme çerçeveleri kaydedin.
  4. Daha fazla hücreden veri toplamak için farklı görüş alanlarına geçin ve yukarıdaki adımları yineleyin.

5. Veri analizi ve tek moleküllü izleme

  1. Filmi bir SMLM analiz yazılımına yükleyin.
    NOT: Herhangi bir yazılım18 kullanılabilir. INSIGHT kullanıyoruz (Malzeme Tablosu'nabakın) ve imageJ (Fiji) için ThunderSTORM19 eklentisini kullanarak sonuçları çapraz doğrulıyoruz.
  2. Filmi görsel olarak tarayanın ve tek moleküllü floresan yanıp sönme nin görünür olması gibi kontrast ayarlarını ayarlayın. Gerekirse, numunenin parçaları sürekli floresan ise, SMLM veri analizi için bölge veya çerçeve aralığını kısıtlayın.
  3. 2D Gaussian PSF'lere (RoI: piksel boyutu 160 nm, genişlik 260-650 nm, yükseklik > 50 foton) takmak için tek molekül tanımlama parametrelerini ayarlayın. Tanımlama parametrelerini kontrol etmek ve farklı tek molekülfloresan patlamalarını güvenilir bir şekilde tespit etmek için bazı örnek kareler aracılığıyla görsel olarak tarayabilirsiniz (Bkz. Şekil 1C).
    NOT: Yükseklik ve genişlik gibi belirli tanımlama parametreleri, görsel olarak algılanan tek moleküllü floresan sinyallerinin tanınmasını optimize etmek için biraz ayarlanabilir.
  4. SMLM görüntü analizini en iyi leştirilmiş tanımlama parametreleriyle gerçekleştirin ve ardından her bir molekülü algılanan foton sayısının ters kare köküyle ağırlığıyla genişliği 2D Gaussian olarak işleyin.
  5. Verilerin kalitesini değerlendirin. Zaman içinde daha belirli durumlarda tek molekül dağılımları gözlemlemek için sınırlı çerçeve aralıkları kullanın. Bu veri toplama sırasında organel hareketi için hesap olabilir.
  6. Molekül dağılımlarının uzamsal dağılımını ve dinamiklerini daha fazla analiz etmek için, yerelleştirmelerin koordinatlarını, çerçevelerini, fotonları, genişliklerini ve yüksekliklerini içeren elde edilen molekül listesini dışa aktarın. Molekül listesini özel yazılı analiz yordamlarında içe aktarın.
  7. Tek molekül dağılımının mekansal bilgilerini elde etmek için, radyal mesafe20'ninbir fonksiyonu olarak yerelleştirmelerin yoğunluğunu temsil eden radyal dağılım fonksiyonunu (r) hesaplayın. Ρ(r) elde etmek için, tüm yerelleştirmelerin benzersiz çift eki mesafelerini hesaplamak için, histogramı ri yüksekliği H(ri)ile ortalanmış kutularla ve bir genişlik dr ile inşa edin ve 2πri*dr ile bölün; (ρ(ri) = H(rii)/π(r i +dr)2-ri2).i Radyal dağılım işlevi daha sonra kümeleme derecesini ve kümelerin karakteristik boyutunu ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.
  8. Moleküllerin difüzyonu hakkında dinamik bilgi edinmek için, tek molekül izleri oluşturmak için ardışık veri toplama çerçevelerinde örneğin 3 piksel (0,48 μm) içinde görünen yerelleştirmeleri bağla.
    NOT: Bağlantı mesafesi moleküllerin difüzyonuna ve lokalizasyon yoğunluğuna bağlıdır. Maksimum bağlantı mesafesi, her karedeki yerelleştirmelerin yoğunluğu analiz edilerek tahmin edilebilir21,22. Ortalama yoğunluk 0.043 lokalizasyon başına 2 olarakbelirlenmiştir; böylece 0.48 μm yarıçapı farklı moleküllerin birbirine bağlı olmadığından emin olmak için yeterince düşük yoğunluktaydı.
  9. Ortalama kare deplasman (MSD) ve Δt arsa oluşturmak için en az üç gecikme kez süren birden fazla izlemeδt farklı gecikme süreleri için yer değiştirmeleri. Ortalama difüzyon katsayısını hesaplamak için MSD vs. Δt eğrisini MSD = 4DΔt + σ2 denklemine sığdırın ve ortalama difüzyon katsayısı D3'ühesaplayabilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yukarıdaki protokole dayalı BODIPY konjugatları kullanarak SMLM için optimize edilmiş bir numune hazırlama, veri toplama ve analiz prosedürü saçıyoruz (Şekil 1A). SMLM verilerinin elde edilip analiz edilebilmek için iş akışına bir örnek göstermek için, optik kırınım sınırının(Şekil 1B-F)altındaki LD'leri çözmek için mayada BODIPY (493/503) kullanırız. Bodipy'nin GFP, mEos2 gibi diğer problarla birlikte farklı çok renkli görüntüleme modla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, geleneksel BODIPY konjugatlarının uzamsal çözünürlükte büyüklük iyileştirme sisiyle SMLM görüntülerini elde etmek için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Bu yöntem, daha önce rapor edilmiş, kırmızı yalıtılı DII durumları geleneksel BODIPY boyalar, geçici olarak iki moleküler karşılaşmalar yoluyla form sömürü dayanmaktadır. Bu durumlar özellikle heyecanlı ve kırmızı kaymış dalga boyları ile tespit edilebilir ve seyrek ve SMLM için yeterince kısa ömürlü. BODIPY monomerlerinin konsantrasyonu laze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında bildirilen araştırma, R21GM127965 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BODIPY C12ThermoFisherD3822Yeşil yağ asidi analogu
BODIPY C12 KırmızıThermoFisherD3835Kırmızı yağ asidi analogu
BODIPY(493/503)ThermoFisherD3922Nötr lipid markörü
Concanavalin ASigma-AldrichC2010Cam yüzeyde hücre immobilizasyonu
Bırakma Karışımı Nitrojen bazlı kompleSCD için ABD BiyolojikD9515Amino asitler
DekstrozSigma-AldrichG7021SCD için karbon kaynağı
Sekiz KuyuluCellvisC8-1.58-NOdacıklı Kaplama
Sekiz Kuyulu, Lb-Tek IISigma-AldrichOdacıklı Kaplama Camları
ET525/50ChromaBant Geçiren filtre
ET595/50ChromaBant geçiren filtre
ET610/75ChromaBant geçiren filtre
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco26140079Serumu
FF652SemrockIşın ayırıcı
FF731/137SemrockBant geçiren filtre
FluoroBrite DMEMThermoFisherA1896701Hücre kültürü ortamı
Hal4000Zhuang Laboratuvarı, Harvard ÜniversitesiVeri toplama yazılımı
Ixon89Ultra DU-897UFoton algılama için AndorEMCCD kamera
Uyarma için lazer 405, 488, 561, 640 nmCW-OBISLazerler
Insight3Zhuang Laboratuvarı, Harvard ÜniversitesiTek molekül lokalizasyon yazılımı
L-GlutaminGibco25030-081Hücre kültürü canlı hücre görüntüleme çözeltisi için gerekli amino asit
ThermoFisherA14291DJGörüntüleme tamponu
Lysotracker GreenThermoFisherL7526Bodipy bazlı lizozom markörü
Memeli ATCC U2OS hücreleri (Manassas, VA)Dr. Jochen Mueller (Minnesota Üniversitesi)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.ANikonYağa daldırma amaç
Penisilin streptomisinGibco15140-122Antibiyotikler
Sodyum PiruvatGibco11360-070Hücre kültürü için takviye
T562lpxrChromaBeam ayırıcı
Tripsin-EDTAGibco15400-054Yapışık hücrenin ayrışması
W303 MATa suşuHorizon-DharmaconYSC1058Ebeveyn mayası suşu
Maya Azot TabanıSigma-AldrichY1250Amino asitsiz azot bazı
zt405 / 488/561 / 640rdcChromaQuadband dikroik ayna
Camları

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077(2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek Molek l Lokalizasyon MikroskopisiLipid Damlac G r nt lemeYa Asidi zlemeCanl H cre G r nt lemeFloresan MikroskobiLazer G c OptimizasyonuBODIPY C12

İlgili makaleler