Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Özet

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Özet

Protein-protein etkileşimlerinin (PPI) ne zaman ve nerede oluştuğunu anlamak, hücredeki protein işlevini ve gelişim gibi daha geniş süreçlerin ne kadar etkilendiğini anlamak için çok önemlidir. Caenorhabditis elegans germline kök hücrelerin düzenlenmesi ile ilgili PPIs eğitimi için harika bir model sistemidir, kekozis, ve gelişme. İlgi proteinlerin standart antikorlar tarafından tanınmak üzere etiketlenmelerine olanak tanıyan çeşitli iyi geliştirilmiş teknikler vardır, bu da bu sistemi yakınlık ligasyon testisi (PLA) reaksiyonları için avantajlı hale getirir. Sonuç olarak PLA, ppi'lerin germlines'de mekansal ve zamansal bir şekilde nerede oluştuğunu alternatif yaklaşımlardan daha etkili bir şekilde gösterebiliyor. Burada açıklanan uygulama ve c. elegans germline ppis araştırmak için bu teknolojinin niceliklendirme için bir protokoldür.

Giriş

Proteinlerin %80'inden fazlasının diğer moleküllerle etkileşimleri olduğu tahmin edilmektedir¹, bu da PPI'ların hücre^2'dekibelirli biyolojik fonksiyonların yürütülmesinde ne kadar önemli olduğunu vurgular. Bazı proteinler hücre sağkalım için gerekli olan büyük komplekslerin montajını kolaylaştıran hub'lar olarak işlev^{görürler 1.} Bu hub'lar birden çok PPI'ya aracılık eder ve proteinlerin hücre^3'tekibelirli işlevleri kolaylaştıran bir ağ halinde organize etmeye yardımcı olur. Protein komplekslerinin oluşumu da biyolojik bağlam etkilenir, belirli etkileşimli ortakların varlığı veya yokluğu gibi^4,hücre sinyal olayları, ve bir hücrenin gelişim evresi.

C. elegans yaygın geliştirme de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar için bir model organizma olarak kullanılır. Bu hayvanın basit anatomisi, solucan gelişiminin analizini kolaylaştıran gonad, bağırsak ve şeffaf mitikül de dahil olmak üzere çeşitli organlardan oluşur. Gonad'da yaşayan germin, germline kök hücrelerinin embriyolara ve sonunda yeni nesil singenlere dönüşen^{gametler 5'e} nasıl olgunlaştığını incelemek için harika bir araçtır. Germline distal uç bölgesi kendi kendini yenileyen kök hücrelerden oluşan bir havuz içerir(Şekil 1). Kök hücreler niş bırakın gibi, onlar meiyotik pachytene içine ilerleme ve sonunda genç yetişkin aşamasında yumurta içine gelişir (Şekil 1). Germline geliştirme Bu program sıkı rna bağlayıcı proteinler (RRB)⁶tarafından kolaylaştırılen bir post-transkripsiyonel düzenleyici ağ da dahil olmak üzere farklı mekanizmalar aracılığıyla düzenlenir. PpI'lar bu düzenleyici etkinlik için önemlidir, çünkü KP'ler işlevlerini yerine getirmek için diğer kofaktörlerle ilişkilendirilir.

Solucanda PPI'lar için sondalamak için kullanılabilecek çeşitli yaklaşımlar vardır, ancak her birinin benzersiz sınırlamaları vardır. In vivo immünopresipite (IP) protein-protein komplekslerini tüm solucan özlerinden ayırmak için kullanılabilir; ancak bu yaklaşım, ÜFE'nin solucanda nerede oluştuğunu göstermez. Buna ek olarak, geçici ve sadece gelişim belirli bir aşamada veya sınırlı sayıda hücre de form protein kompleksleri co-immünopresid ile kurtarmak zor olabilir. Son olarak, IP deneyleri lysis ve afinite matris proteinlerin non-spesifik tutma sonra protein kompleksi reassortment endişeleri ele almak gerekir.

PPI yerinde tespiti için alternatif yaklaşımlar ko-immünboyama, Förster rezonans enerji transferi (FRET) ve bimoleküler floresan kompleman (BiFC) vardır. Ko-immünboyama sabit solucan dokusunda ilgi iki protein eşzamanlı algılama ve sinyal kolokalizasyonu ölçüde ölçümü dayanır. Standart mikroskopi⁷daha fazla ayrıntı sunan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımı, 200-300 nm⁸kırınım sınırlı bariyer ötesinde protein kolokalizasyonu daha sıkı test etmek için yardımcı olur. Ancak, hem konvansiyonel hem de süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak ko-immünboyama iyi tanımlanmış lokalizasyon desenleri olan proteinler için en iyi çalışır. Buna karşılık, yaygın olarak dağıtılan etkileşimli ortaklar için çok daha az bilgilendirici hale gelir. Örtüşmeye dayalı sinyallerin birlikte lokalizasyonu için ölçüm proteinlerin birbiriyle karmaşık olup olmadığı hakkında doğru bilgi sağlamaz^9,10.

Ayrıca, protein-protein komplekslerinin ko-immünopresipitasyon ve ko-immünboyboyama kantitatif değildir, bu tür etkileşimlerin önemli olup olmadığını belirlemek zor hale. FRET ve BiFC floresan tabanlı tekniklerdir. FRET floresan proteinler ile ilgi proteinleri etiketleme dayanır (FPs) hangi bir FP enerji transfer spektral örtüşme var (donör) başka bir FP (alıcı)¹¹aktarılır. Enerjinin bu radyatif olmayan transferi, kendi dalga boyunda tespit edilebilen alıcı FP'nin floresanlığına neden olur. BiFC in vivofloresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. GFP'nin helikes 1-10 ve helix 11¹²gibi iki tamamlayıcı parçaya bölünmesini gerektirir ve bu parçalar daha sonra iki proteinle kaynaşır. Eğer bu iki protein etkileşirse, GFP'nin tamamlayıcı parçaları katlamak ve biraraya gelmek için yeterince yakınlaşır ve GFP floroforu yeniden kurar. Yeniden oluşturulan GFP daha sonra doğrudan floresan olarak gözlenir ve üfe'nin nerede oluştuğunu gösterir.

Bu nedenle, hem FRET hem de BiFC, etiketlenen proteinin işlevini bozabilecek büyük floresan etiketlere bağlıdır. Buna ek olarak, FRET ve BiFC doğru veri elde etmek için etiketli proteinlerin bol ve karşılaştırılabilir ifade gerektirir. FRET, bir ortağın diğerini aşan olduğu ve yüksek arka plan^13'eyol açabilen deneyler için uygun olmayabilir. BiFC denemelerinde aşırı ifadeden de kaçınılmalıdır, çünkü bu, daha yüksek arka planla sonuçlanan nonspesifik derleme^14'ü tetikleyebilir. Her iki teknik de, etiketli proteinlerin ekspresyonu ve görüntüleme koşullarının optimizasyonu gerektirir, bu da deneyleri tamamlamak için gereken süreyi uzatabilir.

Yakınlık ligasyon tsurju (PLA) yukarıda bahsedilen tekniklerin sınırlamalarını ele alabilecek alternatif bir yaklaşımdır. PLA, ilgi çeken proteinleri (veya etiketlerini) tanıyan birincil antikorlardan yararlanır. Bu primer antikorlar daha sonra 40 nm (veya daha kısa) mesafe¹⁵içinde birbirleriyle melezleşebilir oligonükleotid probları içeren ikincil antikorlar ile bağlanır. Ortaya çıkan melezdna, DNA'yı tamamlayan problar tarafından algılanan bir PCR reaksiyonu ile güçlenir. Bu bir mikroskop tarafından görselleştirilmiş foci sonuçlanır. Bu teknoloji, gelişim ve farklılaşmanın çeşitli aşamalarında hücreleri içeren bir montaj hattı olarak organize edilen karmaşık dokularda (yani solucan gonad) yerinde PPI'ları algılayabilir. PLA ile PPI'lar sabit solucan gonad'da doğrudan görselleştirilebilir, bu da PPI'ların gelişimin belirli bir aşamasında oluşup oluşmadığını araştırmak için avantajlıdır. PLA, kesin ölçümler yapmak için ideal olan eş-lokalizasyon tabanlı tahliller yerine PPI'lerin daha fazla çözünürlüğü sunar. Kullanılırsa, süper çözünürlüklü mikroskopi bir hücre içinde PLA foci konumu hakkında ince ayrıntı sağlama potansiyeline sahiptir. Başka bir avantajı pla reaksiyonları kaynaklanan foci bir ImageJ tabanlı analiz iş akışı ile sayılır olabilir, bu tekniği nicel hale.

Dynein Hafif Zincirleri LC8 ailesi ilk dynein motor kompleksi¹⁶ bir alt birim olarak tanımlanan ve bir kargo adaptörü olarak hizmet hipotezi. İlk keşfinden bu yana, LC8 dynein motor kompleksi ek olarak birden fazla protein kompleksleri bulunmuştur^17,18,19,20. LC8 etkileşim motifi içeren protein dizileri için tarama¹⁹ LC8 farklı proteinlerin geniş bir dizi ile birçok etkileşimleri olabileceğini düşündürmektedir^{17,18,19,20,21,22}. Sonuç olarak, LC8 aile proteinleri şimdi daha büyük protein kompleksleri montaj teşvik yardımcı hub olarak kabul edilir^19,22, özünde düzensiz proteinlerin meclisleri gibi²¹.

Bir C. elegans LC8-aile protein, dynein ışık zinciri-1 (DLC-1), yaygın birçok dokular arasında ifade edilir ve belirli hücre altı yapılarda zenginleştirilmiş değil^23,24. Sonuç olarak, C. elegans DLC-1 biyolojik olarak ilgili in vivo ortaklarının belirlenmesi çeşitli nedenlerle zor: 1) co-immünoprepitasyon etkileşimoluşur doku kaynağı göstermez; 2) belirli ortakların sınırlı ekspresyonu veya geçici etkileşimleri co-immünoprepitasyon ile bir etkileşimi tespit etme yeteneğini engelleyebilir; ve 3) DLC-1 diffüz dağılımı co-immünboyama tarafından potansiyel ortak proteinler ile non-spesifik örtüşme yol açar. Bu zorluklara dayanarak PLA, DLC-1 ile in vivo etkileşimlerini test etmek için ideal bir yaklaşımdır.

Daha önce DLC-1 ile doğrudan etkileşim ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB) FBF-2²³ ve GLD-1 25 için bir kofaktör olarak hizmet^{bildirilmiştir.} Çalışmalarımız dlc-1 bir hub protein olarak hizmet modeli destekler ve DLC-1 dynein ötesinde kapsayan bir etkileşim ağı kolaylaştırır düşündürmektedir^19,22. GST pulldown tetkik kullanarak, OMA-1 adlı yeni bir DLC-1-etkileşen RBP²⁶tespit edilmiştir. OMA-1 yumurta büyümesi ve meiyotik olgunlaşma²⁷ için önemlidir ve bir dizi çevirisel baskılayıcı ve aktivatörlerle birlikte işlevler^28. FBF-2 ve GLD-1 sırasıyla kök hücreler ve meyolitik pakiten bölgelerinde ifade edilirken, OMA-1 oositler²⁷ ile meiyotik pachytenden mikropta yaygın olarak ifade edilir (Şekil 1). Bu, DLC-1 gonad farklı bölgelerde RbPs ile kompleksleri oluşturur düşündürmektedir. Ayrıca in vitro gözlenen DLC-1 ve OMA-1 arasındaki doğrudan etkileşim in vivo IP ile kurtarılamadı bulunmuştur. PLA başarıyla C. elegans germline bu etkileşimi daha fazla çalışma için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılmıştır, ve sonuçlar PLA solucan diğer birçok PPIs araştırmak için kullanılabilir öneririz.

Protokol

NOT: Bu protokol, potansiyel etkileşim ortaklarının etiketlendiği C. elegans suşlarını kullanır. Etiketlenmiş bir proteinin başka bir etiketli aday etkileşim ortağıyla etkileşime geçmesinin beklenmediğini niçin negatif kontrol suşlanması kuvvetle tavsiye edilir. Burada, DLC-1 solucan GFP ile etkileşim beklenmiyor gibi, tek başına Arka plan değerlendirmek için olumsuz bir kontrol olarak kullanılmıştır. GFP etiketli OMA-1 deneysel zorlanma olarak kullanılmıştır, ön veriler DLC-1 ile etkileşimi göstermektedir. 3xFLAG etiketli DLC-1 ile birlikte kontrol ve test proteinleri ifade nematod suşları 3xFLAG olarak adlandırılır::DLC-1; GFP ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (istek üzerine suşlar; Malzemeler Tablosu'ndadaha fazla bilgi ), sırasıyla. Burada, 3xFLAG ve GFP etiketleri kullanılır; ancak, antikorları PLA kiti reaktifleri ile uyumlu olduğu sürece diğer etiketler ikame edilebilir.

1. Hayvan bakımı

1. Solucanları E. coli'nin OP50 suşu ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarında tutun ve GFP'nin optimum ifadesi için 24 °C'de tutun.
2. Geçiş yetişkin solucanlar her 2-3 günde bir solucanlar yaymak ve onları iyi beslenen tutmak için.

2. Senkron kültürün hazırlanması

1. Solucanları iyi beslenmiş, gravid hermafroditlerden oluşan bir tabak beyazlatarak senkronize edin. Bir ağartma protokolü Porta-de-la-Riva ve ark.²⁹açıklanmıştır. Embriyoların 24 °C'de bir santrifüj tüpünde bir gecede yumurtadan çıkmalarına izin verin ve 10 mL'lik M9 minimal ortam (M9) tamponu üzerinde dönerler. Bu tutuklanan L1 larvaları bir kültür üretecek.
2. 10 dakika boyunca buz üzerinde tutuklanan L1 sahne larvaları tüp kuluçka, sonra buz soğuk 1x M9 ile tüp kapalı üst.
3. Larvaları 600 x g'de 4 °C'de 5 dk için peletlemek için bir santrifüj kullanın. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin, böylece sadece 1-2 mL supernatant kalır.
4. Larva peletini yeniden askıya alın ve 2 μL'lik askılı larva kültürünü cam bir kaydırağa aktarmak için bir mikropipet kullanın. Larva kültürünün yoğunluğunu belirlemek için kaç larva bulunduğunu sayın, bu da solucanların 2.5.
   NOT: 10-15 L1 larva/1 μL yoğunluğu tohumlama için iyi çalışır.
5. 60 mm OP50 plaka üzerinde yaklaşık 100-120 L1 etap larvatohum için gerekli larva kültürünün hacmi aktarmak için bir mikropipet kullanın. Örneğin, 10 L1 larva/1 μL kültür yoğunluğuna sahip larva kültürünün 10 μL'si tohum.
   NOT: Larvaları tohumlamak için 40 μL'lik bir hacmi aşmayın veya fazla sıvı OP50 çimlerini bozar. Kültür hacmi 40 μL'yi aşarsa, hacmi daha da azaltmak ve larva kültürünün yoğunluğunu artırmak için 2.3-2.4 adımlarını tekrarlayın.
6. 24 °C'de solucan yetiştirin. L1'lerin plakaya tohumunun ne zaman tohumlataolduğunu kaydedin ve diseksiyon için ideal zamanı belirlemek için gelişim aşamasını periyodik olarak kontrol edin.
   NOT: L1'lerin tohumlanmasından 52 saat sonra, 24 °C'de kültürlenen solucanlar genellikle genç yetişkin evresindedir, bu da gonad hedefli PLA için diseksiyon için ideal bir aşamadır. Ancak, senkronize solucanların genç yetişkin aşamasına ulaşma süresi suşlar ve kuluçka sıcaklığı arasında değişebilir.

3. Diseksiyon/gonad ekstrüzyonu

NOT: Gonad ekstrüzyonu için diseksiyon gonad hedefli PLA'nın başarılı bir şekilde çalışması için gereklidir. Bu yaklaşım aynı zamanda PLA için bu protokolü kullanarak çalışan embriyoları da serbest bırakabilir (daha fazla bilgi için Tartışma'ya bakın). Diseksiyondan sonra hem negatif kontrol hem de deney numuneleri sabitlenir ve PLA için paralel olarak tedavi edilir. Ayrıca, floresan co-immunostaining²³ amacıyla protein ortaklarının ifade desenlerini göstermek için ek bir örnek seti hazırlanması önerilmektedir.

1. 30-40 genç yetişkin solucanı 500 μL 1x M9 + levamisole (2,5 mM son konsantrasyon) içeren bir saat cam çanağı içine seçin. Solucanlar topladıktan sonra, dikkatle kaldırmak ve solucanlar ile birlikte transfer bakterileri kaldırmak için ortamın çoğunu atın.
2. 1x M9 + levamisole taze 500 μL ekleyin ve yavaşça çizmek ve solucanlar durulama medya dağıtmak için pipet kullanın. Solucanlarla birlikte aktarılan bakterileri temizlemek için ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın.
   1. Tüm bakteriler uzaklaştırılana kadar bu adımı 2x-3x tekrarlayın. Yıkar lar tamamlandıktan sonra, susuz kalmak için solucanları yaklaşık 100 μL'lik bir ortama bırakın.
      NOT: Solucanların 7 dakikadan uzun süre medyada bekletme, çünkü bu diseksiyon sırasında gondadların ekstrüzyonunu bozar. Solucanların kaybolmaması için ortamın kaldırılmasını izlemek için mikroskopun kesilmesi yardımıyla yıkar lar.
3. Cam veya polietilen pipet kullanarak solucanları %0,001 poli-L-l-lizin ile kaplanmış 25 mm x 75 mm mikroskop slaytına aktarın (bu işlemde kullanılan slaytlar epoksi kaplı çevreye sahiptir ve her biri 14 mm x 14 mm olmak üzere üç çalışma alanı bırakır). Fazla ortamları, yaklaşık 10-15 μL'lik ortam kalacak şekilde kaldırın.
4. Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla ve iki 26 gauge iğnekullanarak, uçları makas bir çift oluşturacak şekilde diğer üzerinde bir iğne yerleştirin. Bu şekilde odaklı iğneler kullanarak, germlines serbest bırakmak için farinks arkasında solucanlar kesti. 5 dakika içinde tüm solucanları ayırın.
   NOT: Gervaise ve Arur^30'unbir önceki yayınında diseksiyonun nasıl yapılacılacılailgili daha fazla ayrıntılı bilgi
5. Tüm solucanlar kesildikten sonra, 22 mm x 40 mm'lik bir kapağı yavaşça kaydırağa dik olacak şekilde yerleştirin. Kapak kaymasının uçları slayttan sarkmalıdır.
6. En az 20 dakika boyunca kuru buz üzerinde tutulan önceden soğutulmuş alüminyum blok üzerinde slaytlar dondurun.

4. Fiksasyon/engelleme

1. Fiksasyon ayarı için hazır olduğunuzda, bir kalem veya diğer künt kenarlı aletle kapakları hafifçe kaydırın ve kaydırağı hemen 1 dakika boyunca taze, buz gibi metanol (soğutulmuş -20 °C)içeren bir kavanoza daldırın.
2. Bir sonraki reaktifin numunenin etrafındaki yüzey gerilimi tarafından tutulabilmesi için numuneyi çevreleyen slaytın kenarlarını yavaşça silin. RT'de 5 dakika için 150 μL fiksatif (%100 mM KH 2 PO 4'te_%2formaldehit, pH = 7,2) uygulayın._4,
   NOT: Ayrıca bir metanol / aseton fiksasyon prosedürü test ettik^31,32 ve PLA reaksiyonu ile uyumlu olduğunu bulundu.
3. Fiksatif slayt kapalı çalıştırmak ve kağıt havlu içine absorbe izin dik 90 ° açıyla bir kağıt havlu slayt dokunun. 50 mL 1x PBS/1% Triton X-100/1% büyükbaş hayvan serum albumini (PBT/BSA) ile coplin kavanozda RT'de 15 dakika boyunca 2x kaydırağı engelleyin.
   NOT: Coplin kavanozveya boyama kavanoz diğer türleri bu engelleme adımı ve bölüm 6-9 aşağıdaki yıkama adımları için tavsiye edilir. Bunlar, numuneyle birlikte tampon un etkin bir şekilde değiştirilmesi veya yıkanması için yeterli hacimsağlar.
4. %10 normal keçi serumu içeren PBT/BSA solüsyonu ile slaytları bloke edin. Slaydın çevreleyen kenarları hafifçe silin ve çözeltinin 100 μL'sini slayta uygulayın. Nemli bir odada RT'de 1 saat kuluçka.
   NOT: Bu adım αFLAG primer antikor ile boyama için şiddetle tavsiye edilir. Nemli hazne, kaydıraklar kuluçkaya yatarken tepsiye bant ile cam pipetler ile güvenerek inşa edilir. Sönümlenmiş görev mendilleri(Malzeme Tablosu)buharlaşmayı önlemek için tepsinin iç nemini yükseltmek için tepsiye yerleştirilir. Kapak ve tepsi, ışığa duyarlı adımlar sırasında numuneleri ışıktan korumak için folyo ile kaplanır.
5. PBT/BSA/10%NGS çözümünün slayttan akmasını sağlamak ve slaydın kenarlarını nazikçe silmek için kağıt havlunun üzerine kaydırak yerleştirin. Slaytları engellemek için engelleme reaktifini(Malzeme Tablosu)kullanın. 14 mm x 14 mm alana bir damla uygulayın. Nemli bir odada 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.

5. Primer antikor kuluçka

NOT: En iyi PLA sonuçlarını ve en az arka planı elde etmek için, primer antikorların seyreltme faktörü optimizasyon gerektirebilir (daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakınız). Ayrıca, primer antikorlar PLA için kullanılan ikincil antikorların özgüllüğü maç farklı konaklarda yükseltilmelidir.

1. Engelleme reaktifinin slayttan akmasını sağlamak ve kenarları nazikçe silmek için kağıt havlunun üzerine kaydırak yerleştirin. Birincil antikorları seyreltmek için antikor dilüentini(Malzeme Tablosu)kullanın. 14 mm x 14 mm uzaya 40 μL primer antikor çözeltisi uygulayın.
2. Bir gecede 4 °C'de nemli bir odada kuluçkaya yat.

6. PLA prob (sekonder antikor) kuluçka

NOT: 6-9 adımlarında RT'de A ve B'yi yıkayın tamponlarını kullanın. Tamponlar 4 °C'de depolanırsa, kullanmadan önce RT'ye ısınsınlar.

1. Bir Coplin kavanozunda 50 mL 1x yıkama tamponu A(Malzeme Tablosu)ile 5 dk için 2x kaydırakyı yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
2. Yıkama tamponunu kaydırağının akmasına izin vermek ve kenarları nazikçe silmek için kağıt havlunun üzerine kaydırak yerleştirin. PLUS ve MINUS probları içeren 40 μL'lik bir çözelti hazırlayın (antikor seyreltici ile seyreltilmiş 1:5). Çözümü her 14 mm x 14 mm alana uygulayın.
3. 37 °C'de 1 saat nemli bir odada kuluçkaya yatırın.

7. Ligasyon

1. 5 dakika boyunca 2x kaydıraklar 1x yıkama tampon U'nun 5 dakikayı Coplin kavanozunda RT'de yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
2. Ligasyon tamponunu seyreltin (Malzeme Tablosu) 1:5 ultra saf su ile. Ligase seyreltmek için bu tampon kullanın (Malzeme Tablosu) 1:40 ligasyon çözeltisi çalışan bir stok hazırlamak için.
   1. Yıkama arabellesinin slayttan akmasını sağlamak ve kenarları nazikçe silmek için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Ligasyon çözeltisinin 40 μL'sini her 14 mm x 14 mm alana uygulayın.
3. 37 °C'de 30 dk nemli bir odada kuluçkaya yatırın.

8. Amplifikasyon

NOT: Kırmızı florofororlu algılama reaktiflerinin kullanılması(Malzeme Tablosu) C. elegans dokusunda en az arka plan sağlar.

1. 5 dakika boyunca 2x kaydıraklar 1x yıkama tampon U'nun 5 dakikayı Coplin kavanozunda RT'de yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
2. Amplifikasyon kırmızı tampon seyreltmek (Malzeme Tablosu) 1:5 ultrasaf su ile. Polimeraz(Malzeme Tablosu)1:80'i seyreltmek ve amplifikasyon çözeltisi stoku hazırlamak ve ışıktan korumak için bu tamponu kullanın.
   1. Yıkama arabellesinin slayttan akmasını sağlamak ve kenarları nazikçe silmek için slaydı kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Amplifikasyon çözeltisinin 40 μL'sini her 14mm x 14 mm alana uygulayın.
3. 37 °C'de 1 saat ve 40 dk nemli bir odada kuluçka yalar. Numuneleri ışıktan korumak için nemli haznenin folyo ile kaplandığından emin olun.

9. Son yıkıntılar

1. Bir Coplin kavanozunda RT'de 50 mL 1x yıkama tamponu B(Malzeme Tablosu)ile 10 dakika boyunca 2x kaydırakyı yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın.
2. Bir Coplin kavanozda RT'de 50 mL 0,01x yıkama tampon U ile 1 dakika boyunca 1 x kaydırakları yıkayın. Coplin kavanozu 60 rpm'e ayarlanmış bir orbital shaker üzerine ayarlayın. Bu tampon ultrasaf su ile yıkama tampon B seyreltilmesi ile hazırlanır.

10. Coverslip montaj

1. Fazla yıkama tamponunun slayttan kağıt havluya akmasına izin verin ve kaydıranın epoksi kaplı çevresinde kalan artık tamponu silin.
2. Numune almak için 10 μL montaj ortamı(Malzeme Tablosu)ekleyin ve yavaşça üzerine bir kapak slip döşeyerek montaj ortamının yayılmasını bekleyin.
3. Coverslip ve slayt mühür için oje ile coverslip kenarına boya. Germlines zarar verecek coverslip, hareket önlemek için oje uygulaması ile nazik olun. Ojenin RT'de en az 20 dakika sertlemasına izin verin, slaytlar mikroskop altında görüntülemeden önce ışıktan korunur.
4. PLA etiketli örnekler ışığa duyarlı olduğundan slaytları koyu bir kapta veya slayt tutucuda saklayın. Üretici, slaytların uzun süreli depolama için -20 °C'de veya kısa süreli depolama için 4 °C'de depolanabileceğini önermektedir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan slaytlar 20 °C'de depolandığında en az 2 ay dayanır.

11. Görüntü edinimi

1. Niceleme amacıyla, açık görüşte, hasarsız ve engelsiz ekstrüde mikrosilerin görüntülerini yakalamak için bir konfokal mikroskop kullanın. Z düzlemindeki tüm germline yayılan germline bir z-yığını yakalayın ve nicel lik için kullanılacak maksimum projeksiyon görüntüsü oluşturun.
   NOT: Konfokal mikroskopi, epifloresan mikroskop kullanılarak elde edilenlere kıyasla daha az arka plana sahip PLA görüntülerini elde etmek ve ölçmek için idealdir.
   1. Germline bir görüş alanına sığmazsa, tüm germline görüntülemek için gerekli görüş çakışan alanları yakalamak. Bu görüntülerin maksimum projeksiyonları FIJI'de bir araya getirilebilir.
2. Görüntü analizi sırasında foci'nin tanımlanması için adil ve uygun bir eşik belirlemek için görüntüleme koşullarını kontrol ve deneysel numuneler arasında aynı tuttuğundan emin olun.
   NOT: PLA nicelemesinin istatistiksel analizini kolaylaştırmak için her bir örneklemden her biri için en az 8-10 mikrop satırı kaydedin. Pla'nın güvenilir ve tutarlı kantitatif sonuçlar elde etmesi için en az üç biyolojik kopya önerilir.

12. FIJI/ImageJ kullanarak görüntü analizi ve nicelleştirme

NOT: Aşağıdaki iş akışı, bir confocal mikroskop üzerindeki 40x hedefi kullanılarak elde edilen ve görüntülerin .czi biçiminde kaydedildiği görüntülere dayanır. Bu .czi görüntüleri ve bunlara eşlik eden meta verilere boyutlar da dahil olmak üzere, daha fazla analiz için FIJI/ImageJ'de erişilebilir ve açılabilir. FIJI'nin konfokal dosyaların biçimini belirli bir kullanıcıtarafından kullanılabilir confocal'tan kabul edip etmediği kontrol edilmelidir. Değilse, .tiff formatındaki görüntüler alternatif olarak analiz için kullanılabilir, ancak kullanıcının görüntünün ölçeğini FIJI/ImageJ'de el ile ayarlaması gerekir (Analiz | Ölçek ayarlayın). Tüm negatif kontrol görüntülerinin arka plan düzeyini belirlemek için önce birlikte analiz edilmesi önerilir.

1. Önce tüm negatif kontrol görüntülerini analiz ederek analiz iş akışını başlatın, sonra deneysel numunelere geçin. Analiz etmek için FIJI/ImageJ'de maksimum projeksiyon görüntüsünü açın (Şekil 2A). .czi dosyası kullanıyorsanız, Bir Bio-Formats Alma Seçenekleri kutusu istenir.
   1. Resminizi açmak için aşağıdaki seçenekleri ekleyin: Veri Tarayıcısıile yığın görüntüleyin; renk modu = Renkli. Görüntünün olduğu bir pencere, confocal (örneğin, DAPI veya PLA) tarafından yakalanan farklı kanallar arasında geçiş yapmak için bir slayt çubuğu yla açılmalıdır.
   2. Görüntülerin dikilmesi gerekiyorsa, görüntüyü fareyle sağ seçerek ve Yinelenen pencereyi açmak için Yinelenen'i seçerek her görüntüden her bir kanalın kopyalarını oluşturun. Yalnızca PLA veya DAPI kanalına karşılık gelen kanal numarasını (c) belirtin (örn. 2)ve Yinelenen Hyperstackiçin kutunun işaretlerini kaldırın.
   3. Her iki görüntü de açık dikişli olarak Eklentileri seçin | Dikiş | Amortismana uğradı | 2D dikiş. 2B Görüntüler penceresinin Dikişi açılır. Dikiş için hangi görüntülerin kullanılacağını seçin ve pencerede önceden ayarlanmış varsayılan parametreleri kullanın, ardından Tamam'ıseçin. Elde edilen görüntü birleştirilmiş gri tonlama görüntüsü olacaktır.
      NOT: Alt görüntüler mükemmel bir şekilde hizalanmazsa, parametreleri ayarlamak (örneğin, kontrol edilecek tepe sayısını 5'ten 500'e çıkarmak veya doğrusal harmanlamadan Max'e füzyon yöntemini değiştirmek). Yoğunluk) istenilen görüntü elde etmek için yardımcı olabilir. Diğer dikiş araçları mevcut olmakla birlikte, bu yaklaşım sayısallaştırma için önemli olan görüntünün boyutsallığını korur.
2. Klavyedeki T tuşuna basarak Yatırım Getirisi (İlgi Alanı) yöneticisini açın. YG Yöneticisi adlı yeni bir pencere açılır.
3. FIJI araç seti kutusundan çokgen aracını seçin. Anahat ve roi oluşturmak için germline etrafında damla noktaları (Şekil 2B). Tam bir YG oluşturmak için son noktayı ilke bağlayın.
   NOT: Daha koyu görüntüler için, daha doğru bir şekilde ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla ana hatlarıyla belirtilebilmek için germline'in (geri döndürülebilir) görünürlüğünü artırmak için kontrastı ayarlamak yararlıdır.
   1. YG'yi tamamladıktan hemen sonra YG yöneticisine gidin ve YG'yi depolamak için Ekle [t] seçeneğini belirleyin. YG'de, YG'nin ve noktaların ekleme/kaldırma noktaları ve noktalarının hareketi de dahil olmak üzere herhangi bir değişikliğin bir sonraki adıma geçmeden önce güncellenmesi (YG yöneticisinden Güncelleştirme'yi seçin) veya bunların kaybolması zorunludur. ROI'ların manipülasyonu ve noktaları hakkında daha fazla ayrıntı FIJI/ImageJ Kullanım Kılavuzu'nda bulunabilir.
4. YG yönlendirmesi ayarlandıktan sonra, YG yöneticisinde YG adını seçerek daha sonra başvuru için kaydedilebilir ve ardından Daha Fazla | Kaydet | (ad dosyası ve kaydetmek için hedef belirtin). Kaydedilen ROI'lar Daha Fazla seçilerek YG yöneticisinde açılabilir | Aç | (dosyayı seçin).
5. YG yöneticisinden YG adını seçerek ve ardından YG yöneticisindeki Ölçü düğmesini seçerek YG içindeki alanı ölçün. Sonuç penceresi, resimde kapladığı alan (μM²) (Şekil 2B'nininset)'i de dahil olmak üzere YG hakkında bilgilerle açılır. Sonraki hesaplamalar için bu bilgileri elektronik tabloya kaydedin.
   NOT: YG'nin doğru boyutlarının toplanacak şekilde görüntünün ölçeğinin düzgün ayarlandıklarından emin olun. Sonuçlar kutusunda bildirilen ölçüm türleri Analiz | Ölçümleri Ayarla....
6. PLA görüntüsünü sağ seçerek ve Yinelenen (Şekil 2C)seçerek yalnızca PLA kanalının yinelenen görüntüsünü açın. Yinelenen pencere açılır. Yalnızca PLA kanalına karşılık gelen kanal numarasını (c) belirtin (örn. 2) ve Yinelenen Hyperstackiçin kutunun işaretlerini kaldırın. Bu görüntünün çoğaltılması, özgün görüntünün değiştirilmemesi için önerilir.
   NOT: Bu seçenekler yalnızca FIJI/ImageJ'de birden çok kanal içeren görüntüleri görüntülerken gösterir. Alternatif bir yaklaşım kanalları bölmek için Resim | Renk | Kanalları böl,ancak bu orijinal resim dosyanızı değiştirir.
7. Yalnızca PLA kanalının görüntüsü seçilirse, Resim | Ayarla | Eşik. Görüntü için bir Eşik penceresi açılır. Eşik Default yöntemi olarak Varsayılan'ı, renk olarak Kırmızı'yı seçin ve Koyu arka plan kutusunu işaretleyin. Penceredeki üst parçayı kullanarak, tüm PLA odakları resimde belirgin bir şekilde vurgulanana kadar çubuğu sağa doğru kaydırın.
   1. Üst parçanın sağındaki kutudaki değeri kaydedin ve eşiği ayarlamak için hangi değerin kullanıldığını not alın. Eşiği sonuçlandırmak için Eşik penceresinde Uygula'yı seçin ve görüntü yalnızca siyah nokta olarak görünen eşik odakları ile beyaz bir arka plana dönüştürür (Şekil 2D). Sayısallaştırmadan önce görüntüden görüntüye tüm PLA odaklarını yakalamak için uygun olduğundan emin olmak için birkaç negatif kontrol görüntüsünde eşiği test edin.
      NOT: Eşik odaklarını beyaz arka plandaki siyah nokta olarak görüntülemek için İşlem | İkili | Seçenekler... ve Siyah arka plan kutusunun işaretlerini kaldırın. 30-40 arasında bir eşik değeri germline PLA tanımlamak için iyi bir başlangıç noktasıdır; ancak, ideal değer arka plana bağlı olarak değişebilir.
8. PLA odaklarını ölçmek için, YG yöneticisi penceresinden YG adını seçerek eşik görüntüsüne 12.3-12.3.1 adımlarından oluşturulan YG'yi uygulayın. YG'nin anahattı, görüntüde kaynak görüntüdekiyle aynı konumda görünmelidir (Şekil 2E).
   1. Analize Git | Parçacıkları analiz edin. Analiz Parçacıkları penceresi açılır ve aşağıdaki parametreleri seçer: boyut (mikron^2) = 0-Sonsuzluk, dairesellik = 0.00-1.00, show = Nothing. Özetle kutusunu işaretleyin.
   2. Tamam'ıseçin ve Özet tablosu YG hakkında bilgi yle birlikte görünür (yani, PLA foci'nin toplam sayısı, YG'de PLA foci'nin içinde bulunan toplam alan, PLA foci'nin ortalama boyutu ve PLA foci tarafından işgal edilen alanın yüzdesi RoI'nin boyutuna göre) (Şekil 2E'nininset'i). Bu ölçümleri elektronik tabloya kaydedin.
9. Aynı eşiği kullanan birkaç negatif denetim görüntüsü için 12.1-12.8 adımlarını yineleyin.
   1. Tüm negatif kontrol görüntüleri analiz edildikten sonra, PLA odaklarını tanımlamak ve ölçmek için negatif kontrol tarafından belirlenen eşik kullanılarak tüm deneysel numuneler için 12.1-12.8 adımlarını tekrarlayın.

Sonuçlar

Her iki 3xFLAG co-immunostaining::DLC-1; GFP ve 3xFLAG::DLC-1; OMA-1:::BAYRAK ve GFP antikorları ile GFP mikropları germline ifade desenlerini ortaya koymuştur (Şekil 3Aii-iii,3Bii-iii). GFP germline boyunca ifade edilirken(Şekil 3Aiii),OMA-1:::GFP ekspresyonu geç pakimeten ve oositlerle sınırlandırılmıştır (Şekil 3Biii)²⁷. BA...

Tartışma

C. elegans germline PPIs çalışırken, ko-immünboyama ile karşılaştırıldığında PLA tarafından sunulan yüksek çözünürlük görselleştirme ve etkileşimleri germline meydana yerlerin nicel sağlar. Daha önce DLC-1'in IN vitro GST pulldown tetkik²⁶kullanarak OMA-1 ile doğrudan etkileşime girdiği bildirilmiştir; ancak, bu etkileşim bir in vivo pulldown tarafından kurtarılamadı. Floresan ko-immünboyboya 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlines DLC-1 ve OMA-1 için ifade desenleri bir örtüşme göst...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 16 paraformaldehit çözeltisi	Elektron Mikroskobu hizmetleri	15710	% 4 çalışma çözeltisi yapmak için kullanılır
1M KH2< / sub>PO < sub>4< / sub>	Sigma	P0662	1M çalışma stoğu
hazırlayın 1x M9	çeşitli		1x'te kullanılan 10x stok olarak hazırlanır;
1x PBS	bakın çeşitli		çeşitli bkz. Protokol için
wormbook.org 26.5 Ölçer İğne	Exel International	26402	Diseksiyon için kullanılan iğneler
BSA	Lampire	7500802
Santrifüj Tüpleri	Thermo Scientific	05-529C	Senkronizasyon için kullanılan 50ml Meşe sırtı santrifüj tüpü
Konfokal Mikroskop	Zeiss	880
Coplin Kavanoz	PolyLab	62101
Numune Küresini Dondurmak için Lamel	Scientific	1411-10	22x40mm, No. 1
Conta Slayt	Küresi	1404-15	22x22mm, No. 1.5
İmmünofloresan Vektör	H-1200		Ortamı
	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligaz, Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Kırmızı kitin bir parçası olarak gelir DUO92008
Amplifikasyon kırmızı tamponu	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplifikasyon Kırmızı tamponu, Duolink Yerinde Algılama Reaktifleri Kırmızı kitinin bir parçası olarak gelir DUO92008
Ligasyon Tamponu	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x Ligasyon tamponu, Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Kırmızı kitinin bir parçası olarak gelir DUO92008
Antikor seyreltici	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink antikor seyreltici, DUO92004 ve DUO92002 ile birlikte gelir, Not: Antikoru seyreltmek için ikame olarak 1x PBS /% 1 BSA çözeltisi de kullanılabilir.
Engelleme Çözümü	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolink engelleme çözümü, PLA için DUO92004 ve DUO92002
Montaj Ortamı	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink Yerinde montaj ortamı
	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink Yerinde Prob Anti-Fare MINUS
PLUS Probu	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink Yerinde Probu Anti-Rabbit PLUS
Yıkama Tamponu A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Yerinde Yıkama Tamponu A
Yıkama Tamponu B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Yerinde Yıkama Tamponu B
Polimeraz	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polimeraz, Duolink Yerinde Tespit Reaktiflerinin bir parçası olarak gelir
Epifloresan Mikroskop	Leica		DUO92008 Kırmızı kitDFC300G kamera, DM5500B mikroskobu
Keçi anti-fare Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	1:500'de kullanın
Keçi anti-tavşan Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	1:200'de kullanın
Görüntü İşleme Yazılımı	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Cam Pipet	Corning	7095B-5X
Levamisole	ACROS Organikler	187870100	250mM çalışma stoğu hazırlayın
Metanol	Fisher Scientific	A454
Fare anti-FLAG	Sigma	F1804	İmmünofloresan ve PLA için 1:1000'de kullanın, normal keçi serumu ile ön blok önerilir
Nailpolish	LA renkleri	CNP195
Nematod Büyüme Ortamı (NGM)	çeşitli		wormbook.org bakınız protokol
Normal Keçi Serumu	JacksonImmuno	005-000-121
Polietilen Pastör Pipet	Küresi Scientific	135030
Poli-L-Lizin	Sigma-Aldrich	P1524	Suda% 0.1 stok çözelti olarak hazırlanır, -20C'de saklanır ve slaytları kaplamak için suda 1:100 oranında seyreltilir
Petri Kapları	Tritech	PD7060	60 mm çaplı
Tavşan anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	İmmünofloresan için 1:200'de, PLA Slaytlar için 1:4000'de kullanın
	Thermo Fisher	30-2066A-Kahverengi	Çubuklu üç kare 14x14 mm otoklavlanabilir slaytlar Fisher Scientific aracılığıyla özel olarak sipariş edilir. Laboratuvardaki slaytlara eklenen Poli-L-Lizin
Sodyum Hipoklorit çözeltisi	Fisher Scientific	SS290-1
görev mendilleri	Kimtech	34120	4.4x8.4 inç görev mendilleri
Tepsiler (242x241x20mm)	Thermo Fisher	240845	Nemli oda yapmak için kullanılır
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Ultra saf su	Milli-Q		Milli-Q Entegre Su Arıtma Sistemi Watchglass
	Carolina Biological	742300-20
; C dondurucu-80
derece C dondurucu
Alüminyum Folyo
OP50 suşu E. coli
Orbital Çalkalayıcı
Bant
Bu çalışmada kullanılan nematod suşları (her ikisi de istek üzerine temin edilebilir)
mntSi13[pME4.1] II; UNC-119 (ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 balo::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 balo::oma-1::GFP; Referans 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 balo::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 balo::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Referans: bu çalışma