Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vaskülarizasyon, Uzatılmış Gelişim ve Geliştirilmiş Mikroskopi Görüntüleme için Renal Organoid ve Organotipik Kültürün Optimizasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik böbrek organotipik kültürler, ve özellikle pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidler, gelişimsel süreçleri takip etmek ve böbrek hastalığı modelleme için mükemmel araçlardır. Ancak, modeller vaskülarizasyon ve işlevsellik eksikliği ile sınırlıdır. Bunu gidermek için, bir kuş embriyosundaki koryoallantoik membrana (CAM) ksenogreftleme yöntemi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş tir. Greftler, örnekleri CAM'a sabitleyen ve greftleri kurumaya karşı koruyan kültür ortamı sağlayan özel yapım minirezervuarlarla kaplanır. Geliştirilmiş kültür yöntemi ksenogreftlerin 9 güne kadar büyümesini sağlar. El yazması ayrıca, daha önce yayınlanmış Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemini kullanarak renal organoidlerin ve organotipik kültürlerin uzun süreli konfokal görüntülemesi için en uygun koşulların nasıl sağlandığını da açıklamaktadır. Bu yöntem, embriyonik bir organı veya organoidi cam bir kapak kayması ile membran arasında büyük miktarda orta derecede sıkıştırır ve 12 güne kadar görüntüleme için mükemmel koşullar sağlar. Birlikte, bu yöntemler geliştirilmiş konfokal görüntüleme ile renal organoidler ve organotipik böbrek kültürleri vaskülarizasyon ve kan akışını sağlar. Burada açıklanan yöntemler böbreklerin temel ve uygulamalı fonksiyonlarını incelemek için son derece yararlıdır ex vivo. Her iki yöntem doku ve organoidler çeşitli uygulanabilir.
Giriş
Embriyonik böbreklerin organotipik kültür on yıllar önce nefrogenez çalışma için önemli bir model oldu1,2,3. Böbrek organoidleri sağlıklı ve hastalıklı böbreklerin gelişimini incelemek için gelişmiş bir model sistemi temsil4. Ancak her iki yöntemin de ana dezavantajı, her iki yöntemin de böbreğin ana işlevini yeniden özetlemesidir: kan filtrasyonu. Nefronlar ve renal vaskülatür renal organoidlerde ve organotipik kültürlerde gelişimin erken evresine benzer şekilde gelişir; ancak, in vitro oluşan glomeruli avaskülerkalır 5. Ex vivo embriyonik böbreklerin ve renal organoidlerin vaskülarizasyonu daha önce sadece in vivo koşullarda yapılan transplantasyon deneylerinde gösterilmiştir. Örneğin, bir fare böbrek kapsülü altında insan pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidlerinin nakli fonksiyonel bir evre6organoid nefron gelişimini sağlar.
Tamamen in vitro kültürler ile in vivo transplantasyon yöntemleri arasında ara yaklaşım, kuş embriyolarının CAM'ine ksenotransplantasyondur. Bozulmamış fare böbrek primordia vaskülarizasyonu daha önce bu sistem kullanılarak gösterilmiştir7,8. Bununla birlikte, ksenonakledilen murine böbrekteki renal vaskülatürin greft9'dandeğil, konak endotelden türetildiği gösterilmiştir. Bu gözlem, embriyonik böbrek modellerinin böbrek vaskülatürgelişimini inceleme potansiyelini önemli ölçüde azaltmıştır, çünkü deneysel koşullar donör kaynaklı endotel hücrelerinin hayatta kalması için müsamaha kariyetsizdir.
Bu protokolün ilk bölümünde sunulan kuş yumurtalarının CAM fare embriyonik böbreklerin ekimi için geliştirilmiş bir yöntemdir, organotipik kültür ve knenotransplantasyon mikroçevre koşulları birleştirerek. Önceki yöntemlerde en önemli gelişme, fare embriyonik böbrekleri ve böbrek organoidlerini doğrudan CAM'e yerleştirmek yerine, implantasyon alanının nakledilen dokuyu besleyen kültür ortamıyla dolu geçirilebilir minirezervuarlarla kaplanmasıdır. besinlerle kuruyup kurutularak korur. Deneylerin başarı oranı önemli ölçüde artar ve donör kaynaklı vaskülatür gelişimi için koşullar geliştirmek. Bu yöntemin ksenotransplant kültürlerine uygulanması, donör böbreklerden endojen endotel hücrelerinden oluşan glomerüler vaskülatür gelişimini ile sonuçlanmaktadır.
Hücresel morfogenezin detaylı analizi böbrek kültürü modellerinin bir diğer önemli uygulamasıdır. Böbrek kültürlerinin zaman atlamalı görüntü edinimi daha önce bildirilen yöntemler sadece genel morfolojisi ve embriyonik böbrek desenleme analizi için yeterlidir, ancak tek tek hücreleri izlemek için10. Son zamanlarda böbrek organoidlerinin ve organotipik kültürlerin yüksek çözünürlüklü konfokal 3D hızlandırılmış görüntülemesini amaçlayan yeni bir Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemi tanımlanmıştır11. Bu yöntemde, organoidler ve embriyonik organlar, numunenin kalınlığı 70 μm'ye ulaşana kadar cam bir kapak kayması ile transwell insertin geçirilebilir bir zarı arasında hafifçe sıkıştırılır ve görüntüleme için en uygun optik koşulları sağlar. Yöntemlerin ikinci bölümünde, özel olarak tasarlanmış bir plakanın imalatı ve uzun süreli organoid görüntüleme için FiZD deneylerinin kurulumu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan bakımı ve prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin Finlandiya ulusal mevzuatı, deneysel ve diğer bilimsel amaçlarla kullanılan omurgalı hayvanları koruma için Avrupa Konvansiyonu (ETS 123) ve 86/609/EEC AB Direktifi'ne uygun olarak uygulanmıştır.
1. Tavuk CAM fare embriyonik böbrekler ve böbrek organoidler ekimi için minirezervuarlar imalatı ve ksenotransplantasyon deneyleri kurma
- 6 kuyu veya 12 kuyu plakası için tasarlanmış transwell hücre kültürü kesici uçlarını kullanın.
NOT: Belirli bir deneye bağlı olarak büyük veya küçük minirezervuarlar kullanılabilir. Sekiz embriyonik böbreklere kadar ksenogreftleme veya aynı tavuk embriyosuna birkaç minirezervuar yerleştirildiğinde (örneğin, aynı tavuk CAM'de deney ve kontrol örnekleri) küçük minirezervuarlar kullanmak en iyisidir. - Dairesel testere bıçağı veya el testeresi ile döner bir çok alet kullanarak kesici uçların kenarlarını kesilerek geçirilmeye bilen 2 mm yüksekliğinde plastik bir halka oluşturun.
- Bir neşter veya keskin bir bıçak ile bu minirezervuarların kenarları parlatmak.
- Minirezervuarları en az 1 saat boyunca %70 etanol ile sterilize edin.
- Minirezervuarları otoklavlı çift distile suda yıkayın ve laminar bir başlıkta kurutun.
- PBS ve kültür ortamındaki minirezervuarları durula (yüksek glikozlu DMEM/%10 FBS/1% penisilin-streptomisin).
- Rezervuarı petri kabına yerleştirin, bir damlanın üzerine (600 μL/400 μL) membran yukarı bakacak şekilde kültür ortamının üzerine yerleştirin.
- Bir pipet veya cam kapiller tüp yardımı ile membran üzerinde eşit olarak diseksiyon ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidler düzenleyin. Böbreklerin etrafında çok fazla sıvı bırakmaktan kaçının.
- 37 °C ve %5 CO2'debir hücre kültürü kuluçka makinesinde numuneler 2-24 saat membrana bağlansın.
NOT: En fazla sekiz E11.5 embriyonik fare böbrekler veya böbrek organoidler küçük eklemek üzerinde düzenlenebilir. Büyük kesici uç, ksenotransplant için daha büyük embriyonik doku parçaları veya CAM'in daha geniş bir alanında bir hücre-hidrojel karışımı için kullanılacaksa önerilir. - Hücre kültürü kuluçka12,13daha önce yayınlanmış yöntemlere göre hazırlanan 8 günlük eski ovo kültürlü embriyonik tavuk alın.
- Minirezervuarları CAM'e aktarın, böylece greftler CAM'e bakacak ve membran onları büstü eder. Minirezervuarları CAM'in çevresine yerleştirin, böylece tavuk embriyosu üzerini örtmesinler.
NOT: Transwell uçlarından 12 kuyu plakası için imal edilen küçük minirezervuarlar kullanılarak, bir CAM'a en fazla üç minirezervuar yerleştirilebilir. - Minirezervuarlara 500°L (6 iyi kesici uç) veya 300°L (12 iyi kesici uç) ekleyin.
- En fazla 9 gün boyunca tavuk CAM üzerinde örnekleri yetiştirmek. Minirezervuarlarda günlük kültür ortamını değiştirin.
NOT: Örneklerin vaskülarizasyonu transplantasyon dan sonra 24-48 saat olarak görülebilir.
2. Özel tasarlanmış plakaların imalatı ve FiZD kültürleri kurulması
- 6 kuyu plakasının altında 20 mm çapında delikler delin.
NOT: FiZD deneyleri için, 16 mm derinlikte 6 kuyu plakası kullanın (Malzeme Tablosu'ndabelirtilmiştir). - Bir karşı lavabo matkap ucu, bir neşter veya keskin bir bıçak ile elektrikli bir matkap kullanarak deliklerin jantlar (özellikle üst tarafta) Lehçe.
- En az 1 saat boyunca% 70 etanol plakaları sterilize.
- Plakaları otoklavlı çift distile suda yıkayın ve steril koşullarda kurumasına izin verin.
- 22 mm x 22 mm cam kapakları %70 etanol ile iyice yıkayın veya Saarela ve ark.11tarafından yayınlanan protokole göre temizleyin.
- Bir toksik olmayan doku tutkal kullanarak 6 kuyu plakaları deliklerin üst tarafına kapakları tutkal. Deliğin etrafına tutkal uygulayın ve kapağını hafifçe örtmek için yerleştirin. Tutkal kurusun.
- Plakaları stereomikroskop altında inceleyin ve gerekirse fazla kurutulmuş tutkalları kapak kapaklarının yüzeyinden çıkarın.
NOT: Numunelerin eşit şekilde sıkıştırIlmesini sağlamak için kapak lının üzerinde tutkal olmadığından emin olun. - Polistiren boncukları (70 μm partikül boyutu) eşit hidrojel hacmiyle karıştırın. Kuyu başına 50-100 μL hacim yeterlidir.
NOT: Buz üzerinde hidrojel ve polistiren boncuk karışımı tutun. - Membran yukarı bir diseksiyon mikroskobu altında bir transwell eklemek yerleştirin.
- Örnekleri (örn. ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidleri) membran üzerinde eşit olarak düzenleyin.
- Kırılgan dokuların zarar görmesini önlemek için numunelerin yanına hidrojel/polistiren boncuk karışımını dikkatlice ekleyin.
- Transwell kesici uç, üzerinde biraraya getirilen numuneler ile membranAşağı bakacak şekilde çevirin.
- Yavaşça değiştirilmiş 6 iyi plaka bir kuyu içine eklemek yerleştirin ve hafifçe aşağı bastırın böylece örnekler boncuk seviyesine sıkıştırılır.
NOT: Mikroskop kullanarak sıkıştırmanın ilerlemesini takip edin. - Bir elinizle kuyuya hafifçe bastırArak kesiciye basılı tutun ve kesici ucun çevresinde üç noktada lehimleme demiri ile plastik eriterek plakaya sabitle.
- Kesici uç tabağa sabitlendiğinde, kuyuya 2 mL kültür ortamı (DMEM/%10 FBS/1% penisilin-streptomisin) ekleyin ve kalan kuyuları aynı şekilde plakada biraraya getirin.
- Bitmiş plakayı hızlandırılmış görüntüleme için ters bir mikroskobun sahnedeki kuvöze aktarın.
- Uygun deneysel ayarları kullanarak numunelerin hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirin.
NOT: Hızlandırılmış deneyler sırasında plaka kuyularında kültür ortamının değiştirilmesi gerekli değildir, ancak kesici uç taki yan larında ki deliklerden kolayca yapılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada sunulan CAM kültür protokolü, tavuk CAM'de knenotransplantasyon sonucu böbrek organoidlerinin ve embriyonik böbreklerin yüksek verimli vaskülariteleştirilmesini sağlamıştır (Şekil 1, Film 1). Kültür ortamı içeren minirezervuarlar donör dokuya besin sağlamakta ve uygun vaskülarizasyondan önceki zaman diliminde kurumasını korumuştur. Bu yöntem, donör kaynaklı endotel hücrelerinin büyümesi için izin koşulları sağladı. Bu nedenle, nakledilen böbreklerde ve organoidlerde r...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Klasik renal organotipik kültür yöntemini hassaslaştıran, vaskülarizasyon, uzlaşı gelişimi ve ex vivo embriyonik böbreklerin ve organoidlerin optimal 4D (yani 3D görüntü ve zaman) görüntülemesini sağlayan iki ayrıntılı protokol sunulmuştur. Bu bölümde yöntemlerdeki kritik adımlar vurgulanır ve sorun giderme konuları anlatılmaktadır.
Diğer CAM kültür yöntemleri ve bu gelişmiş tavuk CAM kültür yöntemi arasındaki önemli fark CAM embriyonik böbrekler ve böbrek organoidlerin ksenografting özel yapı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Suomen Akatemia (Finlandiya Akademisi) (206038, 121647, 250900, 260056) tarafından finansal olarak desteklenmiştir; Mükemmellik Merkezi hibe 2012-201314), Munuaissäätiö - Finlandiya Böbrek ve Karaciğer Derneği, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Finlandiya İsveç Kültür Vakfı, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlandiya Kanser Derneği), Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) ve H2020 Marie Sklodow-Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642997. Yazarlar teknik yardım için Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias ve Hannele Härkman teşekkür ederiz.
Şekil 3, 4 ve Film 2 Geliştirmeizni ile yeniden yazdırılır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ayarlanabilir Kürek Matkap Ucu | Bosch | 2609255277 | 20 mm çapında delikler açmak için |
| Otomatik Yumurta Çevirici | OLBA B.V., Hollanda | AT-42 | Ex ovo kurulumundan önce yumurtaların kuluçkalanması için. |
| Hücre İnkübatörü | Panasonic | 13090543 | Sıcaklık 37 ° C'ye ayarlandı; C, %90 nem, %5 CO2 |
| Hücre İnkübatörü | SANYO | 10070347 | Tavuk CAM kültürü inkübatörü. Sıcaklık 37 ° C'ye ayarlandı; C, %90 nem, %5 CO2 |
| Cellstar 6 kuyulu Plaka | Greiner | M9062 | Uçlarla uyumlu 16 mm kuyu derinliği |
| Dremel Döner Alet için Daire Testere Bıçağı | Dremel | SC690 | |
| Konfokal Mikroskop | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Geçirgen Polikarbonat Membran Uçlu Çok Kuyulu Plaka | Corning | 10301031 | 6 oyuklu plakalar için. 40 ve mikro; m gözenek boyutu |
| Havşa Açma Matkap Ucu | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | Parlatma için (20,5 mm, 1/4", HSS) |
| Tek Kullanımlık Cam Kılcal Boru | Blaubrand | 7087 33 | |
| Tek Kullanımlık Neşter | Swann-Morton | 0501 | |
| Diseksiyon Mikroskobu | Olympus | SZ61 | |
| Delme Makinesi | Bosch | GSR 18 V-EC Profesyonel | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium | Sigma | D777 | Yüksek glikozlu |
| Yumurta Kuluçka Makinesi Kompakt S84 | Grumbach, Almanya | 8012 | Ex ovo kurulumundan önce yumurtaların kuluçkalanması için. Sıcaklık 38 ° C'ye ayarlandı; Bağıl nem %60'ın üzerinde ayarlanmış C |
| Etanol (%70) | VWR | ||
| Döllenmiş Yumurtalar | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlandiya | Hy-Line White ve Nick Chick | |
| Fetal Sığır Serumu | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forseps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Cam Lameller | Menzel-Glä ser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoakril Tutkal | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Sahne Üstü İnkübatör | Okolab | Boldline, özel yapım | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Mini rezervuarların yıkanması. |
| Penisilin ve Streptomisin | Sigma | P4333 | |
| Polistiren Boncuklar | Korpüsküler | 1000263-10 | 70 & mikro; m çapında |
| Döner Çok Amaçlı Alet Sistemi | Dremel | 4000 | |
| Havya Weller | TCP S | Isıtmalı cam kılcal damar da kullanılabilir | |
| Thincert 12 oyuklu Hücre Kültürü Ekleri 0.4 & mikro; m-gözenekli Polistiren Membran | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 0.4 & mikro ile 6 oyuklu Hücre Kültürü Ekleri; m-gözenekli Polistiren Membran | Greiner Bio-One | 657610 |
Kaynaklar
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238(2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
