Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

14.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61001

⸱

21 Mayıs 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

Özet

Organizmalar genellikle dalgalanan ortamlara ve hücre içi homeostazdeğişikliklerine maruz kalırlar, bu da proteom ve fizyolojileri üzerinde zararlı etkilere yol açabilir. Böylece, organizmalar hasar onarmak ve homeostaz korumak için adanmış hedefli ve özel stres yanıtları gelişti. Bu mekanizmalar arasında endoplazmik retikulum (UPRER),mitokondri (UPRMT),ısı şoku yanıtı (HSR) ve oksidatif stres tepkisinin (OxSR) ortaya çıkan protein yanıtı yer almaktadır. Burada sunulan protokoller, bu yolların aktivasyonunu ve bunların nematod, C. elegans'takifizyolojik sonuçlarını tespit etme ve karakterize etme yöntemlerini tanımlar. İlk olarak, hızlı hücresel karakterizasyon, ilaç taraması veya büyük ölçekli genetik tarama (örneğin, RNAi veya mutant kütüphaneler) için yola özgü floresan transkripsiyonel muhabirlerin kullanımı açıklanmıştır. Buna ek olarak, tamamlayıcı, sağlam fizyolojik tahliller açıklanmıştır, hangi doğrudan belirli stres hayvanların duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir, transkripsiyonel muhabirlerin fonksiyonel doğrulama olarak hizmet vermektedir. Birlikte, bu yöntemler iç ve dış proteotoksik pertürbations hücresel ve fizyolojik etkileri hızlı karakterizasyonu için izin verir.

Giriş

Bir organizmanın hücre içi ve hücre dışı ortamdaki değişikliklere yanıt verebilme yeteneği hayatta kalması ve adaptasyonu için çok önemlidir. Bu hücre bütünlüğünü sağlamak çok sayıda koruyucu yollar aracılığıyla hücresel düzeyde gerçekleştirilir. Çok sayıda hücresel bileşenler stresle ilişkili hasara maruz kalırken, hücresel stres yanıtlarının önemli bir tutulumu hücresel proteomun homeostazını onarmak ve korumaktır. Ancak, proteinlerin organel adı verilen özel yapılara bölünmesi, hücre içindeki tüm proteinlerin düzgün bir şekilde katlanıp işlevsel olmasını sağlamak için merkezi bir protein kalite kontrolü formuna güvenemeyeceği nden, hücre için bir sorun teşkil etmektedir. Bu nedenle, proteinleri için tedirginlikile başa çıkmak için, organeller yanlış katlanmış proteinleri algılamak ve bu bölme içinde stresi hafifletmek için bir girişim bir stres yanıtı etkinleştirmek özel kalite kontrol mekanizmaları, gelişti. Örneğin, sitosol ısı şoku tepkisine (HSR) dayanırken, endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondriler kompartmana özgü açılmakta olan protein yanıtlarına (UPR) güvenirler. OxSR reaktif oksijen türlerinin toksik etkilerini hafifletmek için hizmet vermektedir (ROS). Her stres tepkisi hücresel sorunlar ve çevresel hakaretvarlığında tetiklenir ve özel bir transkripsiyonel tepki neden olur. Bu yanıtların ayırıcı özellikleri, yanlış katlanmış proteinleri (şaperonlar gibi) uygun organelle yeniden katlayan veya alternatif olarak protein yıkımı ile hasarlı proteinleri ortadan kaldıran moleküllerin sentezlemesidir. Bu stres yanıtlarının etkinleştirilmesinin sağlanamaması hasarlı proteinlerin birikmesine, dokuların sistemik yetmezliğine yayılan hücresel disfonksiyona ve sonunda organizmanın ölümüne yol açar. Farklı stres yanıtlarının işlevi ve düzenlenmesi başka bir yerde gözden geçirilir1.

Hücresel stres yanıtlarının düzenlenmesi ve aktivitesi ile ilgili birçok anlayışlar nematod atfedilmiştir, Caenorhabditis elegans, genetik araştırmalarda çok hücreli model organizma. Nematodlar sadece hücredüzeyinde stres yanıtlarının aktivasyonçalışmasına izin değil, aynı zamanda organizma düzeyinde; nematodlar genetik tedirginliklerin veya ilaçlara ve kirleticilere maruz kalmanın büyüme ve hayatta kalma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Onların hızlı nesil zaman, izojeni, şeffaflık, genetik sistemlilik, ve deneme sırasında kullanım kolaylığı onları bu tür çalışmalar için ideal olun. Ayrıca, strese nispeten hızlı fizyolojik tepki (saat ve birkaç gün arasında) ve hücresel yolların evrimsel korunması nematodlar stres direnci çalışmalarında önemli bir araç olun.

C. elegansbüyümek için bir besin kaynağı olarak kullanılan iki yaygın olarak kullanılan E. coli suşları vardır: standart OP50, hangi en deney tarihsel2 ve HT115, hemen hemen tüm RNAi deneyleri için kullanılan bir K-12 suşu yapılmıştır bir B suşu3,4. OP50 ve HT115 bakteriyel diyetler arasında önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Bu farklı bakteriyel kaynaklarda büyüme metabolik profil, mitokondriyal DNA kopya numarası ve yaşam süresi5de dahil olmak üzere birçok önemli fenotipler, önemli farklılıklara neden olduğu gösterilmiştir . Bu farklılıkların bazıları OP50 bakteri büyüme ile ilişkili Vitamin B12 eksikliği atfedilir, mitokondriyal homeostaz kusurları ve patojenler ve streslere karşı artan duyarlılık neden olabilir. Tüm bu fenotiplerin HT115 bakterisi üzerinde büyüme ile hafifletilmiş olduğu gösterilmiştir, Hangi B12 vitamini daha yüksek düzeyde var6. Bu nedenle, rnai koşullarının gerekliliğine bakılmaksızın HT115 bakterileri üzerinde fizyolojik stres yanıtları üzerinde tüm deneylerin yapılması tavsiye edilir. Ancak, OP50'de hayvanların bakım kolaylığı nedeniyle, tüm standart büyüme (yani hayvanların bakımı ve amplifikasyonu) OP50 üzerinde gerçekleştirilebilir, çünkü burada açıklanan deneysel paradigmalarda önemli farklılıklar saptanamamıştır, op50'de tutulan solucanlarda, ht115 sonrası senkronizasyona (yani, l1 tutuklaması ile veya l1 tutuklaması olmadan yumurta dan beyazlatma dan) geçirilmelerinden itibaren fark edilmemiştir.

Burada iki fonksiyonel yöntem kullanılarak hücresel stres yanıtlarının aktivitesinin karakterizasyonu açıklanmıştır. Bu protokoller sunulan öncelikle hücresel stres yanıtları ve protein homeostaz üzerindeki etkileri üzerinde duruldu unutulmamalıdır. İlk olarak, floresan transkripsiyonel muhabirler kullanılmaktadır, hangi özellikle farklı hücresel streslere yanıt olarak aktive endojen gen organizatörleri tarafından düzenlenir. Bu floresan transkripsiyonel muhabirler, stres yanıtının doğal olarak bir parçası olan spesifik genlerin transkripsiyonel indüksiyonuna dayanmaktadır. Örneğin, HSP-4, insan refakatçih HSPA5/BiP bir ısı şok proteinorolog, ER-stres üzerine aktive edilir ve stresi hafifletmek için ER lokalize. ER stres koşullarında (örneğin, tunicamycin maruz imal), yeşil floresan protein (GFP), hsp-4 organizatörü nyönetmeliği altında yer, floresan mikroskopisi ile değerlendirilebilir veya kantitatif nematodların büyük parçacık akış sitometri kullanılarak ölçülebilir yüksek seviyelerde sentezlenir7. Benzer şekilde, bir mitokondriyal şaperon organizatörü, hsp-6 (memeli HSPA9 ortologous), UPRMT8aktivasyonunu izlemek için kullanılır , ve sitosolik şaperon organizatörü-16.2 (insan kristalin alfa genlerine ortologous) HSR aktivitesini değerlendirmek için kullanılır9. Bu muhabirler çeşitli tedirginliklere yanıt olarak aktive yolları hızlı bir karakterizasyon sağlar.

Genellikle, burada sunulan muhabirler stres yanıtlarının aktivasyonu nitel bir çıkış sağlayan mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Ancak, görüntüleme teknikleri yukarıda açıklanan gazetecilerin yoğunluğu ve doku konumu hakkında hem bilgi sağlarken, onun nicelliği her zaman doğru veya sağlam değildir. Görüntüleme analiz araçları kullanılarak floresan aktivasyonu ölçmek mümkün olmakla birlikte, bu yöntemler nispeten düşük iş akışı ve örnek boyutu küçüktür, çünkü görüntülenmiş hayvan sayısı nispeten düşüktür. Kolaylık ve hayvanların büyük miktarlarda elde etmek için yeteneği hızla C. elegans ideal bir model sistemi büyük bir parçacık akışı sitometre kullanımı ile floresan stres muhabirlerinin aktivasyonunu titretmek için olun. Büyük parçacık akış sitometresi, birçok canlı hayvanın boyutuna ve floresansına göre kayıt, analiz ve sıralama yeteneğine sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, binlerce solucan için floresan yoğunluğu, boyutu ve mekansal (2D) bilgi almak mümkündür. Sistem flowpilot kullanılarak kontrol edilir, hangi gerçek zamanlı veri toplama ve ölçülen parametrelerin analizi sağlar. Burada, büyük parçacık akış sitometresi kullanarak hem mikroskobik görüntüleme hem de kantitatif analiz yöntemleri stres yanıtlarının aktivasyonunu ölçmek için yöntemler olarak sunulmuştur.

Muhabir analizinin ötesinde, hayvanların strese karşı duyarlılığı veya direnci fizyolojik stres tahlilleri kullanılarak ölçülebilir. Bu belirli hücresel stres yollarını etkinleştirmek stresli ortamlara hayvanların maruz kalma ile elde edilir. Burada, tüm hayvanların belirli stres türlerine karşı duyarlılığını ölçmek için çeşitli yöntemler sağlanmaktadır.

ER stres ilerkist asyon, n-bağlı glikozilasyon blokları, ER10yanlış katlanmış proteinlerin birikimine neden kimyasal ajan, tunicamycin kullanılarak C. elegans uygulanır. C. elegansolarak , ER fonksiyonunda majör pertüreasyonlar tunicamycin sonuçlarına maruz kalma üzerine büyüme, ve önemli ölçüde azalmış ömrü11. Tunicamisin içeren plakalar üzerinde hayvanların hayatta kalma ölçümü ile, hayvanların ER stres duyarlılığı ölçülebilir. Örneğin, ektopik UPRER indüksiyonu olan ve böylece ACIL'de protein misfolding strese karşı direnci artmış olan hayvanlar yabani tip hayvanlara göre tunicamycin maruz kalma üzerine artan bir sağkalım var12.

Oksidatif ve mitokondriyal stres C. elegans kimyasal ajan, paraquat hayvanlar maruz tarafından uygulanır. Paraquat özellikle mitokondri13süperoksit oluşumuna neden olan yaygın olarak kullanılan herbisit vardır. Mitokondri kaynaklı reaktif oksijen türlerinin (ROS) spesifik lokalizasyonu nedeniyle, paraquat tahlilleri genellikle "mitokondriyal" stres tahlilleri olarak kullanılır. Ancak, süperoksit hızla mitokondriyal süperoksit dismutazlar tarafından hidrojen peroksit dönüştürülür (SODs)14. Hidrojen peroksit daha sonra mitokondri dışına yayılabilir ve hücrenin diğer bölümlerinde oksidatif strese neden olabilir. Bu nedenle, paraquat sağkalım tahlilleri hem mitokondriyal hem de oksidatif strese duyarlılık ölçümü olarak tanımlarız (diğer oksidatif stres tahlilleribulunabilir 15).

Termotolerans tahlilleri C. elegans yüksek sıcaklıklarda hayvanlar yerleştirerek yapılır. Nematodlar için ortam sıcaklıkları ~15-20 °C'dir ve termal gerilim 25 °C16,17üzerindeki sıcaklıklarda indüklenir. Termotolerans tahlilleri genellikle 30-37 °C arasında değişen sıcaklıklarda yapılır, hayvanlar bu sıcaklıkta büyük hücresel bozukluklar sergilerler ve hayatta kalma tahlilleri 24 saat içinde tamamlanır16,18. Burada termotolerans tahlillerinin icrası için iki alternatif yöntem sağlanmaktadır: 34 °C'de büyüme ve 37 °C'de büyüme. Burada sunulan protokoller birlikte, RNA paraziti veya kimyasal ilaç kütüphaneleri kullanılarak standart gen knock-down ile birleştirildiğinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Protokol, C. eleganların büyümesi ve görüntülemeye hazırlık (bölüm 1 ve 2), transkripsiyonel muhabirlerin floresan mikroskopi kullanılarak görüntülenmesi (bölüm 3-5), büyük parçacık akış sitometresi kullanan muhabirlerin kantitatif ölçümleri (bölüm 6) ve C. elegans'taki stres hassasiyetini ölçmek için fizyolojik tahliller olmak üzere 4 geniş prosedüre bölünebilir (bölüm 7).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Standart sıcaklık ve OP50 vs HT115 büyüme koşulları

  1. Standart büyüme ve genişleme
    1. LB(Tablo 1)veya ortam sıcaklığında (~22-25 °C) 24-48 saat için tercih edilen eşdeğer ortamda OP50 kültürünü büyütün. OP50 bir urasil auxotroph olduğu için oda sıcaklığında bakteri yetiştirmek ve 37 °C'de yetiştirildiğinde daha yüksek bir geri revertant (örn. baskılayıcı mutantlar) insidansı vardır. OP50 kültürlerinin uzun süreli depolanması önerilmez (4 °C'de maksimum 1 hafta).
    2. Solucanların bakımı için 60 mm NGM plakasına(Tablo 1)~100-200 μL doymuş OP50 kültürü ve 1 mL doymuş OP50 kültürünü deney için hayvanları genişletmek için 100 mm'lik bir tabağa tohumlayın.
    3. Tabaklar bir tezgah üzerinde bir gecede kuru.
      NOT: 100 mm plakaların kuruması için daha fazla zamana ihtiyaç olabilir, özellikle havalandırmasız plakalar kullanıyorsanız. Tüm C. elegans plakalarını 4 °C'de depolanan hava geçirmez kaplarda saklayın. Farklı ozmotik basınç ve plakasertliği nedeniyle plakalar üzerinde hayvan fizyolojisi değişecek tir.
    4. Standart bakım için, 10-15 genç hayvanı (yumurta, L1 veya L2 aşamaları) 60 mm'lik bir plakaya taşıyın, ancak daha düşük fecundity ile mutantlar veya transgenik hayvanlarla uğraşırken daha fazla hareket ettirilebilir. Gelişimsel veya fecundity kusurları olan hayvanlar için, stok kaybını önlemek için hayvanların daha değişken bir havuz yığın. 15 °C'de tutulursa, her hafta hayvanları hareket ettirin; 20 °C için, her 3-4 günde bir hayvanları hareket ettirin.
    5. Her 25-30 pasajda bir hayvanların taze bir erime gerçekleştirin (eğer hayvanlar haftada bir kez taşınır ve 15 °C'de tutulursa~ 6 ay).
    6. Genişletme için, tam 60 mm'lik plakayı genişlemek üzere 100 mm plakaüzerine yerleştirin. Bir referans çerçevesi olarak, yabani tip fecundity olan hayvanlar 4ths-6ths içine kesilmiş tam 60 mm plaka olabilir ve 20 °C'de büyük bir plaka üzerine 2 gün veya 15 °C 3 gün boyunca açlıktan ulaşmadan tam 100 mm plaka oluşturmak için parçalara.

2. Ağartma kullanarak solucanların evreleme/senkronizasyonu

  1. Solucanları senkronize etmek için beyazlatma protokolü
    1. M9 kullanarak agar plakalarından gravid solucanları (yumurta dolu yetişkinler) yıkayın(Tablo 1). Senkronize olmayan bir solucan popülasyonundan (örneğin, adım 1.1.6'dan parçalanmış solucanlardan) deneyler için ağartıcılığa başlayın, çünkü beyazlatma yoluyla birbirini izleyen senkronizasyon turlarında önemli genetik sürüklenme oluşabilir.
    2. Solucan/M9 karışımını cam pipet kullanarak 15 mL konik bir tüpe taşıyın; solucanlar birkaç tabak tek bir 15 mL konik tüp içine toplanabilir.
    3. 1.000 x g30 s aşağı hayvanları spin . Aspire M9 supernatant. Korkunç miktarda kontaminasyon veya büyük bakteri kümeleri olmadığı sürece artık bakterileri yıkamak gereksizdir. Bu durumda, M9 ile birkaç yıkar gerçekleştirin.
    4. Yeni bir beyazlatma çözeltisi stoku hazırlayın (Tablo 1). Beyazlatma çözeltisi 4 °C'de birkaç gün saklanabilir, ancak verimsiz beyazlatma, tüm solucan leşlerini ortadan kaldırmadan önce yumurtalara zarar verecek düzensiz beyazlatma ile sonuçlanabileceğiiçin taze yapılmış beyazlatma solüsyonu kullanılır.
    5. Hayvanlara 2-10 mL beyazlatma çözeltisi ekleyin (her ~0,1 mL hayvan peleti için ~1 mL çamaşır suyu çözeltisi). Çamaşır suyu ve solucan karışımını ~5 dk (10 dakikayı geçmez; ağartma süreleri değişebilir ve her laboratuvar için özel olarak titre edilmelidir) tersine çevirin. Solucan leşlerinin daha hızlı çözülmesine ve yumurtaların en iyi şekilde korunmasına yardımcı olmak için şiddetle sallayın. Periyodik olarak bir diseksiyon mikroskobualtında bakmak veya yetişkin solucan karkas tamamen çözülmüş ve sadece yumurta tüp kalır gözlemlemek için bir ışık konik tüp koymak.
    6. 30 s için 1.000 x g iplik ve daha sonra supernatant aspire ederek yumurta pelet. Yumurtalar bütünlüklerini bozmadan solucanlardan daha hızlı santrifüj edilebilir, bu nedenle santrifüj hızından emin değilseniz, yumurtalar fizyolojilerini etkilemeden 2.500 x g'ye kadar döndürülebilir.
    7. M9'u 15 mL'ye kadar ekleyin ve yumurtaları temizlemek için tüpü ters çevirin.
    8. Tekrar adımları 2.1.6-2.1.7 (yıkama / pelet süreci) 2-3 kez daha fazla kez çamaşır suyu kaldırmak için.
    9. Pipet yumurta/M9 plakalar üzerine karıştırın ve deneme için 15-20 °C'de büyür. Kaç solucan kullanılacağını ölçmek için, bir agar plaka veya slayt üzerine 5 μL yumurta karışımı pipetleme ve hacim 1 μL başına yumurta sayısını belirlemek için 5 ile yumurta sayısını bölerek yaklaşık yumurta sayımları gerçekleştirin. Ortalama 3 bağımsız sayım doğruluğu artırabilir. Açlığı önlemek için,plaka başına önerilen yumurta sayımları tablosu Tablo 2'de mevcuttur.
    10. Gerekirse, L1 20 °C'de yumurta/M9 karışımını 24 saate kadar bir rotatöre yerleştirerek daha sıkı zamansal senkronizasyon için hayvanları tutuklar. Yabani hayvanlarda, L1 48 saate kadar hapsedildiğinde hayvan fizyolojisinde herhangi bir kusur saptanmadı. Ancak, açlık duyarlı mutantlar (örneğin, lizozom veya otofaji mutantlar) L1 arresting ile çok kötü yapmak, ve bu nedenle açlık duyarlı olduğu bilinen mutantlar için bu senkronizasyon yöntemi gerçekleştirmek için tavsiye edilmez. L1 tutuklanamayan hayvanlar için daha sıkı senkronizasyon gerekiyorsa, bölüm 2.2'de açıklanan yumurta yumurtlama yöntemini kullanın.
  2. Solucanları senkronize etmek için yumurta lay protokolü
    NOT: Beyazlatma için alternatif bir yöntem olarak, bir yumurta-lay tsay yapılabilir. Yumurta-lay hayvanların beyazlatma yeterince senkronizasyon sağlamaz zaman kullanılır, yetişkin hayvanların yumurta kese içinde yumurta olarak farklı olabilir gibi 8-12 saat arayla. Hayvanların mümkün olduğunca yakından sahnelenmelerinin kritik olduğu, ancak L1'in tutuklanmasının mümkün olmadığı deneysel paradigmalar için (örneğin, açlık mutantlarında) yumurta yumurtlama tahlilleri önerilir. Ancak, yumurta lay protokolünde yer alan işgücü nedeniyle, yüksek ölçekli deneyler yapmak daha az mümkün olduğu unutulmamalıdır.
    1. Standart bir OP50 veya HT115 tohumlu NGM plakasına 4-12 gravid yetişkin yerleştirin (bkz. adım 2.2.2'den sonra not) (bakteriyel suşlarla ilgili öneriler için yukarıdaki Bölüm 1'e bakın). Deneylerin ölçeğine bağlı olarak, birden fazla plaka kullanılabilir. Adım 2.2 için her plakaüzerinde kaç hayvan olduğunu dikkatlice belgelediğinden emin olun.
    2. Hayvanları deneyler için istenilen sıcaklığa (15-20 °C) 4-8 saat yerleştirin.
      NOT: Hayvanların tabakta kalan saat sayısı, ilk yumurtanın ne kadar senkronize edildiğini ve son yumurtanın ne kadar senkronize olacağını belirleyecek, böylece zamanlama gerektiği gibi ayarlanabilir. Daha kısa kuluçka süreleri her hayvanın yumurtlamak için daha az zamanı olduğu anlamına geldiğinden, yeterli yumurtanın yumurtlanmasını sağlamak için tabaklara daha fazla hayvan yerleştirilmelidir. Gerçek yumurta yumurtlama oranı tamamen normale değil iken hayvanların yumurta yumurtlama normalleştirilmiş bir oranı yerine kısa patlamalar geçmesi eğilimi nedeniyle, hayvan başına yatırılan yumurta ortalama oranı ~ 5 yumurta/ saat yabani tip fecundity sergileyen hayvanlar için tahmin edilebilir19. Gün 1 yetişkin aşamasına hayvan yetiştirmeye çalışırken, zaman yumurta yumurtlamak için plaka başına <100 yumurta açlıktan önlemek için (plaka başına önerilen hayvanlar hakkında daha fazla bilgi için Tablo 2 bakın).
    3. Yetişkin hayvanları tabaklardan çıkarın. Tüm yetişkin hayvanların tabaklardan çıkarıldığından emin olun, çünkü hayvanlar yumurtlamaya devam edecek ve senkronize olmayan bir popülasyona ve/veya plakanın açlıktan ölmesine neden olacaktır.

3. Transkripsiyonel muhabirlerin görüntülenmesi için solucanların büyüme koşulları

  1. Solucanların büyümesi
    1. 100 g/mL karbenicillin ve 20 g/mL tetrasiklin ile desteklenen LB ortama istenilen hedef gen(ler) karşı rnai kaseti taşıyan ve/veya rnai kaseti taşıyan HT115'in bakteri kültürünü aşılamak.
    2. Bir gecede kültür büyümek (~ 16 saat) sallayarak 37 ° C inkübatör doygunluk için.
    3. Spot 60 mm NGM RNAi plakalar 200 μL doymuş bakteri kültürü ve 100 mm NGM RNAi plakaları ile 1.000 μL doymuş bakteri kültürü. Ortam sıcaklığında (~22 °C) bir gecede karanlıkta kurusun (alüminyum folyo ile gevşek bir şekilde kaplanmış).
    4. Floresan muhabirleri taşıyan transgenik solucanların senkronize popülasyonunu (tam liste için Tablo 3'e bakınız) tercih edilen bakterilerle tohumlanmış NGM RNAi plakalarına yerleştirin.
    5. 15-20 °C'de büyüyebilir ve aşağıda belirtildiği gibi belirli muhabirler için gerekli aşamalara kadar büyür.
  2. Deneyler için solucanların evrelemesinde dikkat edilmesi gerekenler
    1. L4 hayvanları gerektiren tahliller hariç, yetişkinliğin ilk gününde transkripsiyonel muhabirler için deneyler yapın. WormAtlas'a göre, L4 hayvanları yumurta evresinden yaklaşık 2,5 gün (~56 saat) yumurta evresinden(www.wormatlas.org)20 °C'de büyüme elde edilir.
    2. "1. gün yetişkinler" için, yumurta kaplama sonra 20 °C büyüme yaklaşık 3-4 gün (~ 65-96 saat) hayvan kullanın.
      NOT: Bu geniş aralık şu şekilde açıklanabilir: ~65 saat 20 °C'de hayvanların gerçek "yetişkinlik" durumu olan "yumurtlama"ya ulaşmasıdır. 96 saat, hayvanların WormAtlas'ın "yumurtlama maksimal" olarak tanımladığı şeye girmesidir, bu da yetişkinin bir yetişkin olduğu ve tam bir yumurta kesesi olduğu zamandır. Bu, hayvanların 1. Burada açıklanan tahliller için, bu ~ 65-96 h penceresinde hayvanları kullanırken büyük farklılıklar gözlenmemiştir.
    3. Tek bir denemenin kopyaları için, daha sağlam tekrarlanabilirlik için benzer bir zaman noktası kullanın (örneğin, tüm deneyleri yumurta kaplamadan sonra ~65 saat veya ~96 saat yapın).
      NOT: Bazı transgenik hayvanlar ve mutantlar büyüme oranlarının yavaşolduğunu gösterirler. Bunun için iki öneri vardır. 1) Deneylerin aynı anda yapılabilmesi için hayvanların farklı zamanlarda ağartılabildiği şaşırtıcı senkronizasyon kullanın. Bu durum, tahlildeki teknik değişkenlik senkronizasyon testinden kaynaklanabilecek teknik değişkenliklerden daha büyük olabilirse (örneğin, uzun süre çalışan sağkalım tahlilleri aynı anda yapılmazsa zarar görebilir). 2) Hayvanların aynı anda ağartılabildiği, ancak tahlilin kendisinin farklı zamanlarda yapıldığı şaşırtıcı analizler kullanın. Bu, doğal değişkenliğe sahip olmayan çok basit tahliller için önerilir (örn. stres yanıtlarının RNAi-indüksiyonu).

4. Stres yanıtlarının indüksiyonu

  1. UPRER'in aktivasyonu için hsp-4p::GFP'nin kullanımı
    1. RNAi kullanarak ER stresini indükleyen
      1. Bölüm 3'te olduğu gibi NGM RNAi plakalarına(Tablo 1)ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen plakaları hazırlayın. Bazal UPRER düzeyleri ve tag-335 RNAi knockdown için bir kontrol olarak EV kullanın (ER yerleşik proteinlerin N-bağlı glikozilasyon enzimi; RNAi knockdown tunicamycin tedavisi ne benzer etkileri vardır) ER stres altında UPRER aktivasyonu için olumlu bir kontrol olarak.
      2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hsp-4p::GFP muhabiri hayvanları senkronize edin.
      3. Tablo 2'deönerilen kriterler kullanılarak RNAi plakalarına yumurta plakası.
      4. Yetişkinliğin ilk gününde deneyler yapmak için yumurtaları yaklaşık 3-4 gün (~65-96 saat) 20 °C'de kuluçkaya yatırın. UPRER deneyleri için, farklı sıcaklıklarda yetiştirilen hsp-4::GFP muhabirinin bazal floresansında farklılıklar vardır. Bu nedenle tüm deneyleri 20 °C'de gerçekleştirin.
    2. Kimyasal madde kullanarak ER stresini indükleyen
      1. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hsp-4p::GFP muhabiri hayvanları senkronize edin ve hayvanlar L4 aşamasına ulaşana kadar 20 °C'de büyüyün. Hayvanları M9 tüpüne aktarın. Solucanların yerleşmesine izin verin (~2-3 dk yerçekimi veya 1000 x g'de30 s spin), ve sonra M9'u çıkarın.
      2. Tunicamisin'i M9'da 25 ng/mL'ye seyreltin (1 mg/mL stoğundan 1:40 seyreltme). Bir kontrol olarak, aynı zamanda M9 DMSO eşdeğer hacmi seyreltmek.
      3. Solucanlara 25 ng/mL tunicamycin/M9 ekleyin veya DMSO/M9 çözeltisini kontrol edin (1,5 mL'lik bir tüp için 400-500 mL veya 15 mL konik tüp için 2 mL kullanın). 20 °C'de döner bir platformda 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
        NOT: Tunicamycin de doğrudan solucan/M9 karışımı içine seyreltilebilir.
      4. Solucanların yerleşmesine, M9/TM çözeltisini çıkarmasına ve 1 mL M9 ile yıkamasına izin verin.
      5. Hayvanları NGM plakalarına veya NGM RNAi plakalarına aktarın ve floresan mikroskopi (bölüm 5) gerçekleştirmeden önce bir gecede (veya ~15-20 saat) ve yetişkinliğin 1.gününe 20 °C'de ulaşmalarını bekleyin. Bir gecede kurtarma GFP tespit edilebilir bir düzeyde birikmesi için izin vermek için gerçekleştirilir.
      6. Alternatif olarak, 16-24 saat boyunca 25 ng/μL tunicamycin içeren agar plakalarına L4 hayvanlarını taşıyarak hsp-4p::GFP'yi indükleyin. Bu, daha uzun stres süresi nedeniyle hsp-4p::GFP'nin çok daha sağlam bir indüksiyonuna sahiptir ve böylece dinamik aralık yukarıda açıklanan adadan çok daha düşüktür.
  2. UPRMT etkinleştirme için bir okuma olarak hsp-6p::GFP kullanma
    1. RNAi kullanarak mitokondriyal stresin indükleyici
      1. Bölüm 4.1.1 ile aynı protokolü izleyerek UPRMT'yi aktive edin, cox-5b/cco-1 (sitokrom c oksidaz alt birimi 5B; nakavt elektron taşıma zinciri aktivitesini inhibe eder) gibi mitokondriyal genlerin RNAi nakavtını kullanmak dışında. ELEKTRON taşıma zinciri fonksiyonunda pertürbasyonlar yoluyla UPRMT aktivasyonu için, RNAi knockdown erken geliştirme sırasında yapılması gerekir20. Bu nedenle, bu deneyler için ambardan RNAi gerçekleştirin.
    2. Kimyasal madde kullanarak mitokondriyal stresin indüklemesi
      1. Bölüm 3'teki gibi ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen plakaları hazırlayın. RNAi nakavtı içermeyen deneylerde bile HT115 bakterilerini kullanın (Bkz. Bölüm 1). Her iki NGM RNAi plaka (veya NGM RNAi + DMSO0.2) ve NGM RNAi + antimycin A plakaları(Tablo 1)her ikisi de adım 4.2.2.5 için hazır olduğundan emin olun.
      2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hsp-6p::GFP veya hsp-60p::GFP muhabiri hayvanları senkronize edin.
      3. Tablo 2'deönerilen kriterler kullanılarak tercih edilen tohumlu tabaklara yumurta plakası. Antimisin A DMSO'da çözündilen için, ambardan NGM RNAi + DMSO0.2 plakaları üzerinde hayvanları büyütün.
      4. Yumurtaları 20 °C'de 2 gün (~56 saat) l4 aşamasına kadar kuluçkaya yatırın. Alternatif olarak, 15 °C'de 3 gün (~75 saat) hayvan yetiştirin.
      5. Solucanları NGM RNAi + DMSO0.2 plakalarından NGM RNAi + antimisin A plakalarına veya NGM RNAi + DMSO0.2 plakalarına kontrol edin. Solucanlar küçük ölçekli deneyler için bir seçim ile elle hareket ettirilebilir, ancak büyük ölçekli deneyler için, biz santrifüj ile yerleşme, M9 aspire, ve sonra NGM RNAi + antimisin A plakaları kaplama, M9 ile hayvan yıkama öneririz.
      6. Ek bir ~ 20 saat ve görüntü gün 1 yetişkin (bölüm 5) için kuluçka solucanlar.
  3. Oksidatif stres yanıtı için bir okuma olarak gst-4p::GFP kullanarak.
    1. RNAi kullanarak OxSR indükleme
      1. Alternatif olarak, gst-4p::GFP wdr-23 RNAi-knockdown kullanarak (bu skn-1olumsuz bir regülatör kodlar ; böylece, onun knockdown OxSR neden) bölüm 4.1.1 açıklanan protokolü kullanarak.
    2. Kimyasal oksidan Tert-bütil hidroperoksit (TBHP) maruz kalma kullanarak OxSR indükleme
      1. Bölüm 3'teki gibi ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen plakaları hazırlayın. RNAi nakavtı içermeyen deneylerde bile HT115 bakterilerini kullanın (Bkz. Bölüm 1).
      2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak gst-4p::GFP muhabiri hayvanları senkronize edin.
      3. Tablo 2'deönerilen kriterler kullanılarak tercih edilen tohumlu tabaklara yumurta plakası. İlaç tedavi protokolü hayvanların %10-20'sinin kaybına yol açtıklarından, gerekenden daha fazla tabak hazırladığından emin olun. Görüntüleme için >100 hayvanla başlayın ve sıralama için >1000 hayvanla başlayın.
      4. 20 °C'de 2 gün (~56 saat) l4 aşamasına kuluçkaya yatırın. Alternatif olarak, 15 °C'de 3 gün (~75 saat) hayvan yetiştirin.
      5. L4 hayvanlarını tabaklardan yıkayın ve her koşulda iki tane 15 mL konik tüpe bölün. Aspire hacmi en az 1 mL'ye kadar inin ve taze yapılmış 2 mM TBHP eşit hacim ekleyin. Daha düşük hacimlerde dönerken solucanların önemli ölçüde ölümüne neden olabileceğinden, toplam sıvı hacmini en az 2 mL olarak kullanın. Plakalardan arta kalan bakteriler kuluçka sırasında solucanların aşırı aç kalmamasını sağlamaya yardımcı olacağından, ilaç tedavisinden önce yıkamayın.
      6. 20 °C'de 4 saat boyunca rotator üzerinde kuluçka solucanları.
      7. Solucanları 1.000 x g'dedönerek, M9 + TBHP karışımını keserek ve 15 mL M9 ile değiştirerek yıkayın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın.
      8. 20 °C'de bir gecede (~16-24 saat) kurtarmak için EV RNAi'deki plaka solucanları. Solucanlar seçim RNAi eşleşen kurtarılabilir, ancak EV RNAi kurtarıldı zaman önemli bir fark görüldü, bu yüzden bu deneysel kurulum kolaylığı için yapılabilir. İyileştikten sonra 1.
        NOT: Bir gecede kurtarma GFP algılanabilir bir düzeyde birikmesi için izin vermek için gerçekleştirilir. Bu kurtarma olmadan, algılanabilir GFP sinyali yoktur. Daha kısa vadeli bir iyileşme isteniyorsa, bölüm 4.3.3'te açıklanan sonucu kullanmak mümkündür.
    3. Kimyasal oksidan paraquat (PQ) maruz kalma kullanarak OxSR indükleme
      1. Durum başına 15 mL konik tüpler de L4 gst-4p::GFP hayvanların 2 toplu almak için bölüm 4.2.2 tüm adımları tekrarlayın.
      2. Aspire hacmi en az 1 mL'ye kadar inin ve eşit hacimde taze yapılmış 100 μM PQ ekleyin. 4.3.2.5'e benzer şekilde en az 2 mL hacim önerilir.
      3. 20 °C'de 2 saat boyunca rotator üzerinde kuluçka solucanları.
      4. Solucanları 1.000 x g'dedönerek, M9 + PQ karışımını keserek ve 15 mL M9 ile değiştirerek yıkayın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın.
      5. EV RNAi'deki plaka solucanları 20 °C'de 2 saat boyunca iyileşir ve iyileşmeden hemen sonra fotoğraf çekerler.
        NOT: 2 saat kurtarma GFP indüksiyonu görselleştirmek için gerekli minimum kurtarma oldu.
  4. HSP-16.2p::GFP ve hsp-70p::GFP kullanarak HSR aktivasyonu için bir okuma olarak.
    1. Yüksek sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra HSR'yi indükleme
      1. Bölüm 3'teki gibi ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen plakaları hazırlayın. RNAi nakavtı içermeyen deneylerde bile HT115 bakterilerini kullanın (bkz.
      2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak hsp-16.2p::GFP veya hsp-70p::GFP muhabiri hayvanları senkronize edin.
      3. Tablo 2'deönerilen kriterler kullanılarak tercih edilen tohumlu tabaklara yumurta plakası. Numunenin yarısı ısı şoku indüksiyonu için yüksek sıcaklıklara maruz kalacak ve diğer yarısı Ise ısı şoku olmayan bir kontrol olarak hizmet verecek olarak gerekli plaka sayısını 2 kat hazırlamak için emin olun.
      4. Yetişkinliğin ilk gününde deneyler yapmak için yumurtaları yaklaşık 3-4 gün (~65-96 saat) 20 °C'de kuluçkaya yatırın. 15 °C'den 20 °C'ye karşı ısı şoku yaşayan hayvanlar arasında küçük farklılıklar olduğu için, ısı şoku deneyleri için 15 °C'de solucan yetiştirmeyin.
      5. Deneysel hayvan gruplarını 34 °C'lik bir kuluçka makinesine taşıyın ve plakaları tek bir tabaka halinde kuvöze yerleştirin (yani, plakai istiflemeyok) plakalar arasında ısının en hızlı ve en eşit dağılımını sağlayın.
      6. Isı şoku olan hayvanları 20 °C'lik bir kuluçka makinesine taşıyın ve hemen 2 saat boyunca iyileşin ve hemen görüntüleyin (Bkz. Bölüm 5). Daha yüksek GFP indüksiyonu için gerekirse hayvanlar daha uzun süre geri kazanılabilir.
        NOT: 2 saat kurtarma GFP indüksiyonu görselleştirmek için gerekli minimum kurtarma oldu.

5. Stereo mikroskop veya düşük büyütmeli geniş alan/bileşik mikroskop kullanarak görüntüleme

  1. Floresan mikroskopi için solucanların hazırlanması
    1. Standart bir NGM plakasının üzerine 5-10 μL 100 mM sodyum azit (yani bakteri yok)
      NOT: Sodyum azit konsantrasyonu 10 mM'ye kadar düşebilir, ancak en sağlam immobilizasyon 100 mM sodyum azitte floresan sinyal üzerinde saptanabilir bir etki olmadan gözlenmiştir.
    2. Bir diseksiyon mikroskobu altında, deneysel plakalar 10-20 hayvan almak ve sodyum azid noktaya aktarın. Hayvanlar sodyum azitin içine indikten kısa bir süre sonra hareketlerini durdurmalıdır ve sodyum azitin kendisi saniyeler içinde buharlaşır.
    3. Sodyum azid buharlaştıktan sonra hayvanları istenilen görüntüleme düzenine göre sırala. Tüm hayvanlar için aynı yönde anterior ve arka yanları ile yan yana hayvanları taşıyın. Görüntüleri hayvanlar hemen.
      NOT: Sodyum azitte felç olduktan sonra Tablo 3'teki transkripsiyonel muhabirlerin herhangi birinde 15 dakikaya kadar muhabir sinyalinde herhangi bir değişiklik gözlenmedi.
  2. Stereomikroskop kullanarak görüntü edinimi
    NOT: Bu protokol için Leica DFC3000G monokromatik CCD kamera, standart Leica GFP filtresi (ex 395-455, EM 480 LP) ve LAS X yazılımı ile donatılmış bir Leica M205FA mikroskobu kullanılmıştır. Pozlama süreleri için önerilen ayarlar Tablo 4'tebulunabilir.
    1. LAS X programını başlatın.
    2. Yeni bir proje başlatın: Satın alma sekmesini açın, Projeleri Aç'a tıklayın ve yeni bir proje açmak için Klasör'ü tıklatın. Bu proje, klasörü sağ tıklayarak ve Yeniden Adlandırma'ya doğru kaydırılarak veya F2'yitıklatarak yeniden adlandırılabilir. Edinme sekmesinde, pozlama süresini ayarlamak ve istenen ayarları yakınlaştırmak için seçenekler de vardır.
    3. Solucan örneğini mikroskop hedefinin altına yerleştirin ve floresan ağartmayı en aza indirmek için parlak alan ayarını kullanarak solucanların doğru odak noktasını bulun. Örneğin merkezi yumurta hattı açıkça görülebilir ve bulanık değildir. Pozlama süresini, yakınlaştırmayı, netleşme yi ve parlak alan kondansatörlerini istenilen ayarlara ayarlayın.
    4. Görüntü Yakalama düğmesini kullanarak bir görüntü elde edin.
    5. Tüm ham görüntüleri ve meta verileri kaydederken görüntüyü .lif (Leica Image File) biçiminde kaydedin. TiFF, resmi (veya projeyi) sağ tıklayarak ve Kaydet seçeneği nin altında TIFF'itıklatarak da dışa aktarılabilir. Bu, tüm kanalları (örn. parlak alan ve GFP) herhangi bir değişiklikle birlikte saklar (örneğin, kontrast ayarlanmışsa, bu DURUM TIFF'e kaydedilir).
  3. Floresan görüntülerin nicel analizi
    1. Nicel analiz yapılacaksa, 3-B görüntüler alın. Bu, sağ üstte "z" etiketli z bölümü seçeneğine tıklayarak gerçekleştirilir. Bu kutu kırmızıysa Z bölümleri etkin olacaktır.
    2. Ayarlanabilir seçeneklerin sol alt kısmındaki aralığı ve dilim kalınlığını seçerek z kesitlerini optimize edin. Mümkün olduğunda, en iyi ayarlar için Sistem Optimize Edilmiş düğmesini kullanın.
    3. Görüntüyü yakalayın ve yukarıdaki bölüm 5.2'de açıklandığı gibi görüntüyü saklayın. Daha kolay ölçümler için solucanları aralarında boşluklarla hizalayın.
    4. TIFF görüntülerini tercih edilen görüntüleme yazılımına (örneğin, ImageJ) aktarın.
    5. ImageJ için, Analiz menüsünden Ölçümleri Ayarla'yıseçin. Aşağıdakileri kontrol edin: alan, ortalama gri değeri, entegre yoğunluk, ekran etiketi.
    6. YG (ilgi alanı) aracını kullanarak bir YG çizin. Her solucanı ayrı ayrı ölçün. Analiz menüsünden Ölçü'yü seçin veya Mtuşuna basın. Solucanların olmadığı arka planda bir ygonçizin ve arka planı aynı şekilde ölçün. Sonuçlar penceresinde görünen ölçümleri kopyalayın veya kaydedin.
    7. Arka plan tümleşik yoğunluğunu ölçülen her roi'nin tümleşik yoğunluğundan çıkarın. Bir YG'nin arka plan yoğunluğu, arka plan daki ortalama gri değerin ürünü ve çizilen Yatırım Getirisi alanı olarak tanımlanır.
  4. Bileşik/geniş alan mikroskobu kullanarak görüntü edinimi
    NOT: Transkripsiyonel muhabirlerin bileşik/geniş alan mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi için, bu protokol olympus 4x Plan Florit NA 0.13 objektif lens( standart Olympus FITC filtresi (ex 470/40; em 525/50; DM 560) ve kamera ve ECHO yazılımı sürücü için bir iPad Pro. Pozlama süreleri için önerilen ayarlar Tablo 4'tebulunabilir.
    1. Kontrol programını başlatmak için dokunmatik yüzeyi kullanın. Yeni bir albüm ve dosya adı oluşturun.
    2. Plakayı objektif lensin altına yerleştirin. Sinyalin görünür olmasına ancak doymamış olması için taban çizgisi (EV/kontrol tedavisi) ve pozitif kontrolü kullanarak pozlama süresini ve floresan yoğunluğunu ayarlayın.
    3. Parlak alan görüntüsünü ve GFP/FITC görüntüsünü kaydedin.

6. Büyük parçacık akış sitometresi kullanan muhabirlerin nicel ölçümleri

NOT: Büyük parçacık akış sitometre analizi için solucanların büyümesi ve hazırlanması, daha fazla sayıda hayvanın gerekli olması dışında, floresan görüntüleme için solucanların hazırlanması için 1-5 numaralı bölümlerle aynı paradigmaları takip edebilir. Kullanım >500 hayvan, bazı hayvanlar manipülasyon sırasında kaybolduğundan, tüm hayvanlar sayısallaştırma sırasında filtreleme kriterlerini geçemez ve bazı hayvanlar akış sitometresi tarafından düzgün bir şekilde okunmaz. 5-10 mL M9 çözeltisi içinde plakaları 15 mL konik tüpler halinde ayıklamak için hazır hayvanları yıkayın.

  1. Büyük bir parçacık akış sitometrekullanarak sıralama kurulumu
    1. Akış sitometresini açmadan önce
      1. Kılıf sıvı şişe boş olmadığından emin olun. Ayırıcıyı kullanmadan en az birkaç saat önce 250x stoğundan kılıf sıvısı hazırlayın, çünkü kılıf sıvısında az miktarda deterjan vardır, bu da satın alma sırasında yapılara neden olabilecek kabarcıklara neden olabilir.
      2. Tüm atık konteynerlerinin dolu olmadığından emin olun.
    2. Akış sitometresini açma
      1. Hava kompresörü açın. Otomatikolarak çevirin. Basınç göstergesi kontrol edin - 30 psi civarında olmalıdır.
      2. Aleti aç. Cihazın solundaki güç kablosunun yanındaki güç anahtarını kullanın.
      3. Lazerleri aç. Kırmızı floresan için daha yüksek uyarma gerekiyorsa 561 nm ışık kaynağının kullanılması gerekmesine rağmen, 488 nm ışık kaynağı genellikle çoğu deney için yeterlidir.
      4. FlowPilot yazılımını açın; cihaz farklı vanalar üzerinde anahtarlama tıklama bir dizi yapmalıdır.
      5. Başlat'ıtıklatarak yazılım penceresindeki lazerleri açın. Çalıştır'ıtıklatarak Argon lazer kontrol açılır penceresine lazer başlatın. Bu lazer açmak ve yaklaşık 12 mW ulaşmak neden olmalıdır. 488 ışık kaynağı seviyesi 12 civarına çıkacak.
      6. Pencereyi kapatmak için Bitti'yi tıklatın.
    3. İlerlemeden önce yazılımı denetler
      1. Basınç göstergelerini kontrol edin -Pencerenin alt kısmında görüntülenen 4 basınç değerlerine bakın. Değerler orijinal kurulum etrafında olmalıdır (Sheath 5.5-5.7; Örnek 5.7-6.0; Ayıklayıcı 3.1-3.3; Temiz 8.5-8.7). Benzer görünüyorsa, Pressure Ok'unyanındaki kutuyu işaretleyin.
      2. Akışkanları kontrol edin -Akış hücreden kılıf/numune akışını engelleyen hava kabarcıkları ve enkaz olmadığından emin olmak için birkaç kez Temiz'i tıklatın.
      3. Kılıf akış hızını kontrol edin -Bunun için, 60 s. Switch Off Sortiçin kılıf toplamak, sonra kılıf akışını başlatmak için manuel kontrollerde Kılıf açık açın. 60 s için 15 mL tüp içinde toplayın; akış hızı ~9-10 mL/dk olmalıdır.
    4. Akış sitometresi kullanılmadan önce temizleme
      1. Toplama 'fincan' içine % 10 çamaşır suyu çözeltisi ~ 3-5 mL koyun ve Kazan'ıtıklatın. ~30 s için çalıştırın, Aborttıklayın ve vakum ile fazlalığı kaldırın.
      2. Deiyonize su ile toplama 'fincan' durulayın ve vakum ile çıkarın. Tekrar 2x.
      3. ~3-5 mL COPAS temizleme çözeltisini koleksiyon 'fincan' içine koyun ve Satın Al'ıtıklatın. ~30 s için çalıştırın, Aborttıklayın ve vakum ile fazla temizleme solüsyonu kaldırın.
      4. Deiyonize su ile toplama 'fincan' durulayın ve vakum ile çıkarın. Tekrar 2x.
      5. ~3-5 mL M9 çözeltisini koleksiyon 'fincan' içine koyun ve Satın Al'ıtıklatın. ~30 s için çalıştırın, Durdur'atıklayın ve vakum ile aşırı M9 çözüm kaldırın.
  2. Örnekleri sıralayıcıda çalıştırma
    1. Lazer PMT gücünü ve boyut gating'i, transkripsiyonel muhabirin en parlak aktivasyonuna neden olan duruma göre ayarlayın. Önerilen ayarlar Tablo 4'tebulunabilir.
    2. 'fincan' için hazırlanan solucanlar ekleyin. Satın Al'ıtıklatın. Tüm sıvımakineiçine alınmadığından emin olmak için izleyin; bu akış sitometre hava almak ve dedektörde kabarcıklar oluşturmak neden olur.
    3. Örnek düşük olduğunda ve/veya yeterli hayvan toplandığında İptal'i tıklatın.
    4. Kurulum'a tıklayın | Veri Depolama | Sadece Kapılı. Bu, verileri yalnızca boyut kısıtlamalarına göre kaydeder. Kapılı Depola'yı tıklatın ve kapılı verileri kaydedin. Verileri silmek için Sil'i tıklatın.
    5. Deiyonize su ile toplama 'fincan' durulayın ve vakum ile çıkarın. Tekrar 2x.
    6. Diğer örneklerle birlikte 6.2.1-6.2.5 adımlarını tekrarlayın.
  3. Kalibrasyon/ Kalite Kontrol - gerekirse
    NOT: Bu 488 lazer kalibre etmek için sağlanan 42 μM GYR floresan parçacıklar kontrol çalışan gerektirir.
    1. Hava tüpünü çıkarmak için numune kabının üstündeki metal dudağı basın. Kapağı sökün ve numune kabından sıvıçıkarmak için bir şırınga kullanın.
    2. Kullanmadan önce kontrol parçacıkları şişesini karıştırın ve numune kabına birkaç mililitre ekleyin. Kapağı kapatın ve yerine tıklayana kadar bastırarak havayı tekrar tonuyla tutarak tekrar tonuyla kapatın.
    3. Yazılımda, Araçlar seçeneğine gidin ve Denetim Parçacıklarını Çalıştır'ıtıklatın.
    4. Kontrol parçacıkları için PMT değerlerini şu şekilde sıfırlayın: YEŞİl - 325; SARI - 365; KIRMIZI - 575.
    5. Satın Al'ıtıklatın. Kılıf, numunenin ardından açılmalıdır. Boncuklar akış hücresinden geçmeye başladıktan sonra, akış hızı ekranın alt kısmında görülecektir. En uygun şekilde, akış hızı 5/s ile 15/s arasında olmalıdır. Akış hızı çok düşük veya sıfırsa, akış hızını artırmak için numune valfini fiziksel olarak saat yönünde çevirin. Akış hızı çok yüksekse, akış hızını azaltmak için numune valfini saat yönünün tersine çevirin.
      NOT: Normalde, boncuk koruyucu modu altında, 500 boncuk kapatmadan önce okunur. Veriler silinebilir ve boncuklar yeniden okunabilir.
    6. Okuma tamamlandıktan sonra, 5 parametrenin yanı sıra CV değerleri için temiz tek tepe noktalarını kontrol edin. Varyans Katsayısı (CV) <%15 olmalıdır. Ayrıca, üç farklı floresan kanalın CV değerlerinin birbirine yakın olduğundan emin olun.
    7. QC denetiminin kaydını yapın: Dosya sekmesinin altında ekran görüntüsü olarak Kaydet'itıklatın.
  4. Temizleme ve kapatma
    1. Numuneyi numune kabından çıkarmak için bir vakum kullanın ve bölüm 4.1.4'ü tekrarlayın.
    2. Toplama 'fincan' içine deiyonize su ~ 3-5 mL koyun ve Edinmetıklayın , ~ 30 s için çalıştırın ve sonra Aborttıklayın . Örnek kabın arkasında biraz distile su bırakın.
    3. Numune geri kazanım kabını ve atık şişeyi boşaltın.
    4. Yazılımı kapatın. Dosya sekmesinin altında, Çıkış'ıtıklatın. Açılır menüde, Temizlemeden Kapat'ıtıklatın.
    5. Lazeri kapatın, aleti kapatın ve sonra hava kompresörü kapatın. Aleti kapatmak için kapağı kapatın.

7. C. elegans stres duyarlılığıölçmek için fizyolojik tahliller

  1. Tunicamisin maruziyeti kullanarak ER stres hassasiyetinin ölçülmesi
    1. Bölüm 3'te olduğu gibi ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen NGM RNAi DMSO plakalarını hazırlayın. RNAi nakavtı içermeyen deneylerde bile HT115 bakterilerini kullanın (Bkz. Bölüm 1). Ayrıca NGM RNAi TM plakaları tohum unutmayın (Tablo 1bakınız). Yeterli miktarda plaka tohum: ~5-7 set NGM RNAi DMSO plakaları ve ~2-3 set NGM RNAi TM plakaları için plan.
    2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak tercih ettiği hayvanları senkronize edin.
    3. Plaka yumurta NGM RNAi DMSO tohumlu plakalar üzerine Tablo 2'deönerilen kriterleri kullanarak tercih edilen. Numunenin yarısı NGM RNAi TM plakalarına aktarılacaktır olarak gerekli plaka sayısını 2 kat hazırlamak için emin olun.
    4. 20 °C'de yaklaşık 3-4 gün (~65-96 saat) yetişkinliğin ilk gününe kadar kuluçkaya yatırın.
    5. 1. gün, hayvanları ayrı plakalara aktararak yaşam sürelerini hazırlayın. Plakaları korumak için (TM maliyetleri yüksek olduğu için), her koşulda 120 hayvan için, her koşulda 15 hayvandan oluşan 8 tabak kullanın. Bu puanlama için plaka başına hayvanların yönetilebilir sayıda sağlar ve istatistiksel analizler için yeterli miktarda hayvan sağlar, bazı sansür bile.
    6. İlk 5-7 gün boyunca, yetişkin hayvanları her gün nesilden uzaklaştırıp yeni bir tabağa taşıyın, ta ki artık soyundan gelene kadar. Bu aşamada, torbalanmış olan sansür hayvanları, vulval çıkıntıları/patlamalar sergiler veya plakaların kenarlarında sürünerek çıkarlar, çünkü bunlar ER stres hassasiyeti ile ilişkili ölümler değildir. TM tedavisinin hayvanlarda arreste neden olduğunu ve bu nedenle bu hayvanların 2-3 günde bir sadece 1-2 hareketinin TM içeren plakaların üretilmesiyle ilgili maliyetleri en aza indirmek için yeterli olduğunu unutmayın. Yabani hayvanlar DMSO~15-17 gün ortalama hayatta kalma ve tunicamcyin 12-14 gün var.
    7. Hayvanlar soy üretmeyi bıraktıktan sonra, tüm hayvanlar ölü veya sansürlü olarak puanlanana kadar her 1-2 günde bir skor ömrü. TM-tedavi hayvanlar gün boyunca her gün 6-14 yetişkinlik daha yüksek çözünürlük için.
  2. Paraquata maruz kalınarak mitokondriyal ve oksidatif stres hassasiyetinin ölçülmesi
    1. Bölüm 3'teki gibi ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen plakaları hazırlayın. RNAi nakavtiçermeyen deneylerde bile HT115 bakterisi kullanın (Bkz. Giriş).
    2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak tercih ettiği hayvanları senkronize edin.
    3. Plaka yumurta ngm RNAi tohumlu plakalar üzerine tablo 1önerilen kriterleri kullanarak tercih edilen. Teşbe durum başına ~ 60-100 hayvan çağrısı, bu yüzden buna göre hazırlayın.
    4. 20 °C'de yaklaşık 3-4 gün (~65-96 saat) yetişkinliğin ilk gününe kadar kuluçkaya yatırın.
    5. M9 çözeltisinde 100 mM paraquattaze bir şişe hazırlayın.
    6. Pipet 50-75 μL M9+paraquat düz alt 96-iyi plaka gibi birçok kuyu içine istenilen. Genellikle iyi başına ~ 8-10 hayvan içeren durum başına ~ 8-10 kuyu olması tavsiye edilir. Bu, her su şuya ~80 hayvan ile her kuyuda kolayca görülebilen hayvan sayısı sağlar.
    7. Her koşulda 8-10 hayvan seçin ve M9+ paraquat içeren her kuyuya aktarın. Hacim farklılıklarını ve paraquat konsantrasyonlarında istenmeyen değişiklikleri önlemek için borulama yerine hayvanları kuyulara aktarmak için bir kazma kullanın.
    8. Her 2 saat, her kuyuda hayvanların ölüm için puan. Plakalara hafifçe dokunun, bu da canlı hayvanların dayak yedirmelerine veya bükülmelerine neden olur. Canlı hayvanların bazen ölü olarak puanlanacak kadar felç olması mümkündür. Bu nedenle, canlı hayvan sayısı bir önceki zaman diliminden canlı hayvan sayısını aşıyorsa, hayvanın hayatta olması ve puansız olması olasıdır (örneğin, 4. saat 4'te 2/10 hayvan ölü olarak puanlanırsa ve 6. saatte sadece 1/10 hayvan ölmüşse, saat 4 ölü olarak yeniden puanlanmalıdır).
  3. Yüksek sıcaklıklara maruz kaldıktan sonra ısı yada hassasiyetinin ölçülmesi
    1. Bölüm 3'teki gibi ilgi genini hedefleyen RNAi bakterisi ile tespit edilen plakaları hazırlayın. RNAi nakavtı içermeyen deneylerde bile HT115 bakterilerini kullanın (Bkz. Bölüm 1).
    2. Bölüm 2'de açıklanan yöntemleri kullanarak tercih ettiği hayvanları senkronize edin.
    3. Tablo 1'deönerilen kriterler kullanılarak tercih edilen tohumlu tabaklara yumurta plakası. Termotolerans tahlilleri için durum başına 60-100 hayvan var. Termotolerans tahlilleri için, tahlil hayvanların yaşa göre büyük değişkenlik olduğu gibi en iyi senkronizasyon için L1 tutuklama veya yumurta yatıyordu tahliller kullanın.
    4. Yetişkinliğin ilk gününde deneyler yapmak için 20 °C'de yaklaşık 3-4 gün (~65-96 saat) kuluçkaya yatırın. 15 °C ile 20 °C arasında ısı şoku yaşayan hayvanlar arasında küçük bir fark olduğu için, ısı şoku deneyleri için 15 °C'de solucan yetiştirmeyin.
    5. 1. gün, ayrı plakalar üzerine aktararak hayvanları hazırlamak. Genellikle 60 hayvan toplam, 4-6 plakaile plaka başına ~ 10-15 hayvan olması tavsiye edilir. Bu puanlama için plaka başına hayvanların yönetilebilir bir sayı sağlar ve hayvanların yüksek sıcaklıklarda çekilmesi için en az süre sağlar.
    6. Hayvanları 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin ve her 2 saat puan. 5 saat öncesinde niçin 37 °C'de termotolerans için puanlama yapmaya başlayın, çünkü 5 saatten önce ölüm meydana gelmez. Ortanca termotolerans ~9 saat, bu nedenle saat 7, 9 ve 11 kritik zaman noktaları, inkübatör ve laboratuvar-laboratuvar değişkenliği nedeniyle, bu laboratuvar başına titre edilmesi gerekebilir rağmen gerçekleştirilir. Ayrıca, değişkenliği azaltmak için her türlü yöntem (örneğin, plakaları istiflememek, plakaları tek bir kuluçka makinesi içinde aynı alana yerleştirmek, kuvözün açılıp kapatılma süresini en aza indirmek, hayvanların 37 °C dışında geçirdikleri zamanı en aza indirmek için bir seferde kuvözden birkaç tabak alarak vb.) yardımcı olacaktır. Tam bir kılavuz için bkz:21).
    7. Adım 7.3.6'ya alternatif olarak hayvanları 37 °C yerine 34 °C'ye yerleştirin. 34 °C'deki ortanca termotolerans 14 saatin biraz üzerindedir, bu nedenle 12, 14 ve 16'daki zaman noktaları 34 °C termotolerans tahlilleri için önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Stres yanıtlarının aktivasyonunu ölçmek için transkripsiyonel muhabirleri kullanma
Burada, floresan transkripsiyonel muhabirler kullanılır, Hangi C. elegansen stres yanıtlarının aktivasyon ölçmek için sağlam araçlar olarak hizmet vermektedir. GFP ifadesi, bölmeye özgü streslere yanıt veren ana transkripsiyonel düzenleyicilerin kanonik hedeflerinin organizatörü altında yürütülür. Yaygın olarak kullanılan transkripsiyonel muhabirlerin kapsamlı bir listesi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, C. eleganshücresel stres yanıtlarını sorgulamak için yöntemler , floresan transkripsiyonel muhabirler ve fizyolojik stres sağkalım tahlilleri kullanılarak açıklanmıştır. Muhabirlerin hepsi, hücresel stres tepkilerinin artmasıyla ilgili transkripsiyon faktörlerinin aşağı transkripsiyon hedefinin organizatörü altında yönlendirilen GFP ifadesini kullanırlar. HSP-4p kullanımı::GFP XBP-1s-aracılı UPRERtarafından modüle , hsp-6p::GFP ATFS-1-aracılı UPRMTtarafından kontro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

R.BZ. EMBO uzun vadeli burs ve Larry L. Hillblom Vakfı tarafından desteklenir. R.H.S, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) ve Glenn Tıbbi Araştırma Doktora Sonrası Burs Vakfı aracılığıyla 5F32AG032023-02 hibe ile desteklenir. A.F. NIA aracılığıyla Hibe F32AG051355 tarafından desteklenir. H.K.G. Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu Programı ile DGE1752814 hibe ile desteklenir. M.G.M. NIA ile 1F31AG060660-01 tarafından desteklenir. A.D. Thomas ve Stacey Siebel Vakfı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve 4R01AG042679-04 ve 5R01AG05891-02 NIA ve 5R01ES021667-09 NIEHS tarafından desteklenir. Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet ve Anel Esquivel'e önemli teknik yardımlar için teşekkür ederiz. Biz Morimoto laboratuvar ve CGC (NIH Office Araştırma Altyapı Programı P40 OD010440 tarafından finanse edilen) suşları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mitokondriyal stres içinAntimisin ASigma-AldrichA8674
NGM plakaları içinBacto PeptoneFisher ScientificDF0118072
NGM plakaları içinBD Difco granül agarVWR90000-782
NGM plakaları içinkalsiyum klorür dihidratVWR97061-904
KarbenisilinBioPioneerC0051-25RNAi için
NGM plakaları içinKolesterol Sigma-Aldrich57-88-5
COPAS BiosorterUnion Biometrica350-5000-000488 nm ışık kaynağı ile donatılmıştır.
COPAS Temizleme SolüsyonuUnionBiometrica 300-5072-000COPAS ile birlikte kullanılmak
COPAS Kılıf SolüsyonuUnion Biometrica300-5070-100COPAS
DMSO ileSigma-Aldrich472301ilaçlar için çözücü
IPTG dioksan içermezRNAiDenville ScientificCI8280-4
MillerFisher ScientificLB
M205FA stereoskopLeica10450040bir Leica DFC3000G monokromatik CCD kamera, standart Leica GFP filtresi (ex 395-455, EM 480 LP) ve LAS X yazılımı ile donatılmıştır
NGM plakaları içinmagnezyum sülfat heptahidratVWREM-MX0070-3
oksidatif/mitokondriyal stres içinParaquatSigma-Aldrich36541
Potasyum KlorürÇamaşır suyu çözeltisi içinFisherP217-500
NGM plakaları içinfosfat dibazikVWREM-PX1570-2
içinpotasyum fosfat monobazikVWREM-PX1565-5
Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 objektif lensi, standart Olympus FITC filtresi (ex 470/40; em 525/50; DM 560) ve kamera ve sürücü için bir iPad Pro ECHO yazılımı
Sodyum AzideSigma-Aldrich71289-50Ggörüntüleme için
Sodyum KlorürEMD MilliporeSX0420-5NGM plakaları için, M9
Sodyum fosfat dibazikVWR71003-472M9
Tert-bütil hidroperoksitiçin Sigma-Aldrich458139oksidatif stres için
RNAi için tetrasiklin hidroklorürSigma-AldrichT7660-5G
ER stresi içinTunicamycinSigma-AldrichT7765-50MG
, üzere kullanım için LB Et Suyu için için BP1426500 ,M9potasyum M9 Revolve ECHO 75990-514 ,

Kaynaklar

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011(2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37(2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792(2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762(2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466(2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701(2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749(2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177(2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

C. elegans Stres YanıtıIsı Şoku YanıtıKatlanmamış Protein YanıtıOksidatif Stres YanıtıFloresan Transkripsiyonel RaporlarAkış Sitometrisi AnaliziParaquat Duyarlılık DeneyiTermotolerans Sağkalım DeneyiXBP-1 NakavtDAF-2 Nakavt
C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.