Method Article

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloid fibrils Huntington gibi nörodejeneratif hastalıkların bir dizi ile ilişkilidir, Parkinson, veya Alzheimer hastalığı. Bu amiloid fibrils endojen metastabil proteinlerin yanı sıra proteostaz ağı bileşenleri (PN) sequester ve bu nedenle hücrede protein misfolding şiddetlendirebilir. Bir hayvan içinde amiloid proteinlerin toplama sürecini değerlendirmek için araçlar sınırlı sayıda vardır. Floresan yaşam boyu mikroskopi (FLIM) için nöronlar gibi belirli hücrelerde amiloid fibrilizasyonun izlenmesine ve ölçülmesine olanak tanıyan bir protokol sayılarak, yaşlanmanın ilerlemesi ve PN. FLIM florofor ifade düzeylerinden bağımsızdır ve daha fazla boyama veya ağartma olmadan toplama işleminin analizini sağlar. Florofororlar amiloid yapıların yakın çevresinde olduklarında söndürülürler, bu da floresan ömrün azalmasına neden olur. Söndürme doğrudan amiloid proteininin agregasyonu ile ilişkilidir. FLIM, farklı amiloid proteinlerin fibrilizasyon sürecini karşılaştırmak için uygulanabilen çok yönlü bir tekniktir, çevresel uyaranlar, ya da in vivo genetik arka planlar non-invaziv bir şekilde.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein toplama hem yaşlanma da hem de hastalıkta görülür. Büyük amiloidlerin veya amorf inklütiflerin oluşumuna ve birikmesine yol açan yolları takip etmek zordur ve kinetiklerinin çözülmesi de benzer şekilde zordur. Proteinler genetik hastalıklarda olduğu gibi kodlama sekanslarındaki içsel mutasyonlara bağlı olarak yanlış katlanabilirler. Proteinler de yanlış çünkü proteostaz ağ (PN) onları çözünür ve düzgün katlanmış tutar bozulmuş, yaşlanma sırasında olur. PN moleküler şaperonlar ve bozulma makineleri içerir ve biyogenez sorumludur, katlama, ticareti, ve proteinlerin bozulması1.

C. elegans kısa ömrü nede....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. C. eleganların senkronizasyonu

  1. Senkronize C. elegans ya alkali nhipoklorit çözeltisi tedavisi ile ya da basit yumurtlama yoluyla 4 saat 20 °C8.
  2. Standart prosedürlere göre OP50 E. coli ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM)plakalarıüzerinde 20 °C'de nematodyetiştirin ve bakımını yap. Yaş nematodlar istenilen gelişim aşaması veya güne kadar.
    NOT: Bu protokolde genç yetişkinler 4.

2. RNAi aracılı refakat makineleri besleme yoluyla nakavt

NOT: Nematodlar10ilgili RNAi vektörbe besleyere....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, hem doğal yaşlanma sırasında hem de strese maruz kaldığında, yaşayan C. elegans'tatoplanan türlerin oluşumunun nasıl doğru bir şekilde izlendiğini göstermektedir. 40Q, 44Q veya 85Q tekrarpoliglutamin proteinlerini ifade eden dört farklı transgenik nematod suşları seçtik. Bu proteinler farklı dokularda sentezlenir ve farklı floroforlara kaynaşır. C. elegans suşları ya vücut duvarı kaslarında Q40-mRFP ifade (mQ40-RFP), Sinir sisteminde Q40-CFP (nQ40-CFP), ve ya Q.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol, C. elegans model sistemindeki birleştirilmiş türleri tanımlamak için mikroskopi tabanlı bir tekniği tanımlar. FLIM, floresan yaşam larındaki çürümelerinin ölçümü yoluyla bir florofora kaynaşmış hem birakadar hem de çözünen türlerin varlığını doğru bir şekilde karakterize edebilir. Bir füzyon proteini toplama başladığında, kayıtlı ortalama ömrü daha yüksek bir değerden daha düşük bir değere kayacaktır16. Toplama eğilimi daha sonra ömür boyu düşüş tarafından çıkarıl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanan kas-Q40-mRFP suşu. Nöronal-Q40-CFP Morimoto Lab bir tür hediye oldu. Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP için Mükemmellik NeuroCure Küme tarafından), EMBO (MLP kısa vadeli burs) ve Biyologlar Şirketi (CG ve MLP seyahat hibe) finansman için kabul. Ayrıca, YFP'nin inşalarının görüntülenmesi için kurulum sağlamak için Berlin'deki Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'ndeki Gelişmiş Işık Mikroskobu görüntüleme tesisini de kabul ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM bileşeni
Ahringer Kitaplığı hsp-1 siRNAKaynak BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpisilinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiyotik
B & H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition yazılımı
B& H SPC830-SPC GörüntüBecker & Hickl GmbHFLIM Satın Alma yazılımı
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM bileşeni
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETİK MERKEZİ (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPMorimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP'denMorimoto Lab'dan nazik hediye
C. elegans nQ40-CFPMorimoto Lab
Deckglä'den nazik hediye; ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Kapak fişleri
İzopropil-β-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGMontaj Stereomikroskobu
Leica TCS SP5Leica Camera AGKonfokal Mikroskop
Levamizol HidroklorürAppliChem GmbHA4341Anestezik
OP50 Escherichia coli>CAENORHABDİTİS GENETİK MERKEZİ (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Aquisition yazılımı
Sodyum AzideCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Anestezik
Sodyum KlorürCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM bileşeni
Standart-Objektträ gerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Cam slaytlar
Universal AgaroseBio & Sell GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGKonfokal Mikroskop
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGKonfokal Mikroskop
nazik hediye

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles