Biz kafatası stabilize edilebilir ucunda bir iğne bükülmüş bir intrasisternal enjeksiyon tarif, böylece altta yatan parankim hasar riskini ortadan kaldırarak. Bu yaklaşım, leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritalanması ve manipülasyonları ve beyin-omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İntrasisternal Enjeksiyon Ile Leptomeningeal Hücre Modifikasyonu İndüksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Burada özetlenen protokol, altta yatan parankimhasar riskini ortadan kaldırırken sarnıç magna yoluyla güvenli ve elle çözelti enjekte nasıl açıklanır. Daha önce yayınlanan protokoller dural yüzeyden maksimum 1-2 mm indirilmelidir düz iğneler kullanmanızı öneririz. Dural membran delindikten sonra dirençteki ani düşüş, iğnenin sabit bir pozisyonda tutulmasını zorlaştırır. Yöntemimiz, bunun yerine, kafatasının oksipital kemiğine karşı stabilize edilebilen bir iğne bükülür, böylece dural zarın delinmesi sonrasında şırınganın dokuya girmesini önler. Prosedür basit, tekrarlanabilir ve işletilen hayvanlarda uzun süreli rahatsızlık neden olmaz. İntrasisternal enjeksiyon stratejisini vasküler leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritasını çıkarmak bağlamında tanımlıyoruz. Aynı teknik, ayrıca, nörogelişimle leptomeninglerin rolünün araştırılması ve bakteriyel menenjitin yayılması gibi çok çeşitli araştırma sorularını ele almak için, bu fenomenlere dahil olan genlerin genetik ablasyonyoluyla kullanılabilir. Ayrıca, prosedür sürekli teslimat için bir otomatize infüzyon sistemi ile kombine edilebilir ve floresan etiketli moleküllerin enjeksiyonu yoluyla beyin omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılır.
Giriş
Leptomeningeal hücreler, beyni büstü eden ve kollajen çapraz bağlama (örneğin, Dcn ve Lum)karıştığı genleri ifade eden ince bir tabaka halinde organize edilmiş ve beyin meningeal bariyerinin kurulmasında (örn. Cldn11)1,,2. Leptomeningeal hücreler fizyolojik fonksiyonların geniş bir yelpazede karıştığı, beyin omurilik sıvı drenaj üzerinde sıkı kontrol3 gelişmekte olan beyinde nöral atalarının rehberlikiçin 4,5. Yeni bir çalışma da yenidoğan leptomeningler beyin parankim içine göç ve fonksiyonel kortikal....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada sunulan cerrahi prosedürler Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd tarafından onaylanmış ve araştırma enstitüsü (Karolinska Enstitüsü, İsveç) tarafından sağlanan spesifikasyonlar ile uyum içinde yürütülmüştür.
NOT: İntrasisternal enjeksiyon esnek bir şekilde birden fazla araştırma amacıyla uyarlanabilir. Biz verimli r26R-tdTomato12 ve CreER taşıyan bir transgenik fare hattı nda endoksifen enjeksiyonu dayalı kader haritalama için leptomeningeal hücreleri etiketlemek için geliştirilen bir prosedür aşağıda mevcut, Cx30 organizatörü altında ikinci13. Bu hücre popülasyonun....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Cx30 promotörü13 ve indükleyici floresan muhabiri altında CreER ifade transgenik farelerde endoksifen intrasisternal enjeksiyon ve kortekste komşu Cx30-ifade yüzeyi ve parenkimal astrositler etiketleme olmadan leptomeningeal hücrelerin özel rekombinasyon sağlar(Şekil 1). Sarnıç magna'ya erişmek için anesteziye değer hale gelen hayvan, vücudu ve kafası yaklaşık 120°'lik bir açıyla konumlandırılır ve böylece boynunun arkasının gerilmesin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada özetlenen protokol, kader haritalaması için leptomeningeal hücreleri etiketlemek için basit ve tekrarlanabilir bir prosedür sunar. Biz endoksifen intrasisternal enjeksiyon kullanın, Tamoksifen aktif bir metaboliti, Cx30-CreER tdTomato floresan muhabiri ifade indüklemek için; R26R-tdDomatesfareleri 12,13.
Sarnıç magna9ile beyin-omurilik sıvısına erişim sağlamak için kullanılan diğer protokollerle karşılaşt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.
Teşekkürler
Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kanser Derneği, İsveç Stratejik Araştırmalar Vakfı, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse ve Karolinska Institutet'te (StratRegen) Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Stratejik Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anestezi ünitesi | Univentor 410 | 8323102 | Hazneye ve fare kafası tutucusuna bağlanan komple buharlaştırıcı, hazne ve hortum |
| Anestezi (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Ticari adı Rymadil |
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | Carl Roth | 0258.1 | Alternatif olarak ipek 5-0 sütürler kullanın |
| Medbond Doku Tutkalı | Çalma | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Etanol %70 | Histolab | 01370 | |
| Hamilton şırınga (30 G eğimli iğne) | Hamilton | 80300 | |
| Lidokain | Aspen Nordic | 520455 | |
| Fare kafası tutucusu | Narishige International | SGM-4 | İnhalasyon anestezikleri için ağızlıklı. Alternatif olarak, stereotaktik bir çerçeve kullanın |
| Makas | Güzel Bilim Araçları | 15009-08 | |
| Tıraş Makinesi | Aesculap | GT420 | |
| Steril absorpsiyon mızrakları | Güzel Bilim Araçları | 18105-01 | Steril pamuklu çubuklar da iyi bir seçenektir |
| Cerrahi ayırıcı | Dünya Hassas Alet | 501897 | |
| Cımbız | Dumont | 11251-35 | |
| Viskogözyaşı | Bausch & Lomb İskandinav AB | 541760 |
Kaynaklar
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
