Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

S-acylation bir labile tiyoester^bağı1 ile bir hedef protein üzerinde bir iç sistein kalıntısı bir yağlı asil zincir eklenmesi içeren bir geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyondur. İlk olarak palmitat ile proteinlerin bir değişiklik olarak bildirilmiştir, doymuş 16-karbon yağ asidi², ve bu nedenle bu değişiklik genellikle S-palmitoylation olarak adlandırılır. Palmitat ek olarak, proteinler geri daha uzun ve kısa doymuş çeşitli tarafından değiştirilebilir (myristate ve stearate), tekli doymamış (oleat) ve çoklu doymamış (arachidonate ve eikosapentanoat) yağ asitleri^3,4,5,6,7. Ökaryotik hücrelerde, S-aylasyon DHHC protein ayltransferazlar olarak bilinen enzimler bir aile tarafından katalize edilir ve sistein deamilasyonu ters reaksiyon protein tiyoesterases tarafından katalize edilir, çoğu hala esrarengiz kalır⁸.

Tiyoester bağının lability bu lipid modifikasyonu geri dönüşümlü hale getirir, dinamik protein kümelenme düzenleyen izin, plazma membran lokalizasyonu, hücre içi ticareti, protein-protein etkileşimleri ve protein stabilitesi^9,10. Sonuç olarak, S-acylation Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı ve kanser çeşitli türleri (prostat, mide, mesane, akciğer, kolorektal) dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, bu post-çeviriprotein modifikasyonu tespit etmek için güvenilir yöntemlergeliştirilmesini gerektirir¹¹.

Radyoaktif metabolik etiketleme ([³H], [¹⁴C] veya [¹²⁵I]) palmitat, protein S-aylasyonunu saymak için geliştirilen ilk yaklaşımlardan biridir^12,13,14. Ancak, radyolabeling tabanlı yöntemler sağlık endişeleri mevcut, çok hassas değildir, zaman alıcı, ve sadece son derece bol proteinlerin lipidasyon tespit¹⁵. Radiolabeling için daha hızlı ve radyoaktif olmayan bir alternatif biyoortogonal yağ asidi probları ile metabolik etiketleme, hangi rutin protein S-acylation dinamikleri hesaplamak için kullanılır¹⁶. Bu yöntemde, bir kimyasal muhabir (alkine veya azit grubu) ile bir yağ asidi bir protein ayltransferaz tarafından S-asilat protein içine dahil edilmiştir. Azide-alkyne Huisgen sikloek reaksiyonu (tıklama kimyası) daha sonra bir florofor veya biyotin gibi işlevselleştirilmiş bir grup eklemek için kullanılabilir, Entegre yağ asidi S-acylated protein tespiti için izin^17,18,19.

Acyl-biotin değişimi (ABE) doku örnekleri için uygun olmayan gibi metabolik etiketleme eksiklikleri bazı atlar S-acylated proteinlerin yakalanması ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerden biridir¹⁵. Bu yöntem, dokular ve dondurulmuş hücre örnekleri^20,21dahil olmak üzere biyolojik örnekler, çeşitli s-acilesyon analizi için uygulanabilir. Bu yöntem, nötr hidroksilin ile asil grup ve sistein kalıntısı arasındaki tiyoester bağının selektif bölünmesine dayanır. Serbest tiyol grupları daha sonra bir tiol-reaktif biotin türevi ile yakalanır. Üretilen biyotinylated proteinler daha sonra afinite-streptavidin agarose kullanılarak saflaştırılmış ve immünoblotting tarafından analiz edilir.

Alternatif bir yaklaşım acyl-reçine destekli yakalama denir (Acyl-RAC) daha sonra bir tiyol-reaktif reçine^22,,23tarafından serbest sistein doğrudan konjugasyon ile biyotinylation adım yerine tanıtıldı . Bu yöntem, ABE ile karşılaştırıldığında daha az adıma sahiptir ve benzer şekilde çok çeşitli örneklerde protein S-alasyonunun saptanması için kullanılabilir^1.

Acyl-RAC 4 ana adımdan oluşur (Şekil 1),
1. Serbest tiyol gruplarının engellenmesi;
2. Nötr hidroksilin ile sistein-asil tiyoester bağıseçici bölünme (HAM) sistein tiyol grupları ortaya çıkarmak için;
3. Bir tiyol-reaktif resin ile lipideli sistein yakalama;
4. Tampon azaltarak elüsyondan sonra S-asitli proteinlerin seçici zenginleşmesi.

Yakalanan proteinler daha sonra immünoblotting veya kütle spektrometresi (MS) tabanlı proteomik türler ve dokuların çeşitli sitifom değerlendirmek için tabi analiz edilebilir^22,24,25. Bireysel S-aylasyon siteleri de yakalanan proteinlerin tripsin sindirim ve LC-MS/MS²²ile ortaya çıkan peptidlerin analizi ile tespit edilebilir. Burada, hem hücre hattında hem de doku örneğinde birden fazla proteinin S-amilasyonunun eşzamanlı olarak saptanmasında nasıl asil-RAC kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Bu protokolde kullanılan fareler NIH kurallarına göre ötenazi yedirildi. Houston Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Refahı Komitesi tüm hayvan çalışmaları onayladı.

1. Hücre lisatlarının hazırlanması

1. Tablo 1'deaçıklandığı gibi lysis arabelleği hazırlayın. 10 mL PBS'ye 0,1 g n-dodeyl β-D-maltoside deterjan (DDM) ekleyin ve çözülecek şekilde döndürün. 100 μL fosfataz inhibitörü kokteyl 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) ve proteaz inhibitörü kokteyli (1x) ekleyin ve kullanmadan önce tamponu buz üzerinde soğutun.
2. Herhangi bir hücre enkazından kurtulmak için 350 x g'de 350 x g'de kuvözden hücreleri içeren ortamların 15 mL veya 50 mL konik tüplere ve dönüş hücrelerine aktarılması gerekmektedir.
   NOT: Yapılacak her asil-RAC reaksiyonu için 1 x 10⁷ hücre kullandık.
3. Peleti 5 mL PBS'de yeniden sulayarak ve 5 dk boyunca 350 x g'da döndürerek yıkayın.
   NOT: PBS'de uzun süreli kuluçka nedeniyle hücre lisi önlemek için adım 1.3'ü hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
4. 1.1 adımda hazırlanan 600 μL likli lisis tamponu peletin üzerine ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca bir termal çalkalayıcıda 1500 rpm'de sallayarak lyse.
5. 4 °C'de 20.000 x g'de 30 dk pelet deterjansız malzemeleriçin santrifüj ile temizler. Önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrofuge tüplerde temizlenmiş lysate toplayın ve buzüzerinde tutun.
6. Protein konsantrasyonu tahmin etmek için Bradford/BCA tayini yapın. Deneyi gerçekleştirmeden önce farklı numuneler arasında aynı miktarda proteinin sağlanması çok önemlidir. Reaksiyon başına en az 500 μg protein kullanmanızı öneririz.
   NOT: Açıklanan deneylerde fare dokusundan kültürlü (Jurkat) hücreleri ve primer splenositler kullandık. Yukarıda açıklanan lysis yöntemi diğer hücre tiplerine de benimsenebilir. Yukarıda bahsedilen hücre tipleri için elde edilen ortalama protein konsantrasyonu 1 x 10⁷ hücre başına yaklaşık 500 μg'dir. Jurkat hücreleri RPMI-1640 orta 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pirüuvat, 4.500 mg/L glukoz ve 1.500 mg/L sodyum bikarbonat içeren modifiye edilmiş ve %5 CO₂ile 37 °C'de %10 FBS ile desteklenmiştir. Reaksiyon başına 1 x 10⁷ Jurkat hücreleri kullandık. Primer splenositler fare dalak dokusundan izole edildi²⁶. Kısaca, dalak dokusu buz üzerinde maceralı, hipotonik çözelti de eritrositlerin lysis ve santrifüj ile lenfositler ayrılması izledi. Reaksiyon başına 1 x 10⁷ primer hücre kullandık.

2. Acyl-RAC: Serbest tiyol gruplarının engellenmesi

NOT: Sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) yapılabilir.

1. Taze 1,5 mL mikrofuge tüpe lysate aktarın ve aşağıda açıklandığı gibi kloroform-metanol (CM) yağış gerçekleştirin.
   1. Lysate'nin son oranında lysate'ye metanol (MeOH) ve kloroform (CHCl₃₎ekleyin: MeOH: CHCl₃ 2:2:1 ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için şiddetle çalkalayın.
   2. Sulu ve organik fazlar arasındaki interfazda bir pelet ("gözleme") oluşturmak için 5 dk için 10.000 x g spin.
   3. Bir iğne veya jel yükleme ucu kullanarak tüpü yatırın ve mümkün olduğunca çok çözücü aspire edin.
   4. Protein peletini birkaç dakika havayla kurutun ve 600 μL MeOH ekleyerek ve peletin kırılmasını önlemek için hafifçe karıştırarak hafifçe yıkayın.
   5. Dikkatle kalan MeOH çıkarın ve yaklaşık 5 dakika boyunca bir tezgah üzerinde protein pelet kuru.
   6. (İsteğe bağlı) Örnek kaybını önlemek için MeOH yıkamadan sonra herhangi bir kırık pelet aşağı spin için ek bir santrifüj adım gerçekleştirin.
      NOT: Cm yağış adımından sonra deney durdurulabilir. Pelet elde edildikten sonra -20 °C'de 500 μL MeOH'da bir haftaya kadar saklanabilir.
      1. 2SHB tamponunun 200 μL'si halinde protein peletini bir termal çalkalayıcıda 42 °C/1500 rpm'de girdaplayarak pelet eriyene kadar çözün.
   7. (İsteğe bağlı) Pelet eritmek için bir sonicating su banyosu ek bir 5-10 dakika kuluçka.
      NOT: Sonication uzunluğu malzemenin çözünürlüğüne bağlı olarak değişir. Ancak, uzun süreli sonication protein bozulmasına neden olabilir.
2. 2SHB'de %0,2 metil metil metanosiosulfonat (MMTS) (v/v) 2SHB'ye 298 μL 2SHB tamponuna 2 μL MMTS ekleyerek hazırlayın.
   NOT: Her deney için taze hazırlanmış %0,2 MMTS kullanın.
3. Her tüpe 2SHB'de %0,2 MMTS'lik 200 μL'lik MMTS'yi %0,1 MMTS'lik son konsantrasyona ekleyin. 42 °C'de 15 dakika boyunca tüplü çalkalayıcıda 1500 rpm'de titreyerek inkübedin.

3. Asil-RAC: Hidroksilin (HAM) dekoltesi ve S-asilated proteinlerin yakalanması

1. MMTS kaldırmak için yukarıda açıklandığı gibi 3-4x CM yağışları tekrarlayın. MMTS'nin çıkarılması, MMTS'nin belirgin kokusu ndan tahmin edilebilir. Her yağıştan sonra, pelet içözünceye kadar bir termal çalkalayıcıda 42 °C/1500 rpm girdap ile 2SHB tampon 100 μL pelet eritin ve sonra 300 μL Tampon A ile seyreltin.
2. Son çökeltiden sonra, yukarıda açıklandığı gibi 2SHB tamponunun 200 μL'sinde numuneleri çözün ve 240 μL Tampon A ile seyreltin.
3. Çeşitli tedavi koşullarına yanıt olarak S-aylasyondeğişiklikleri karşılaştırma durumunda, tekrar protein konsantrasyonu ölçmek ve her durum için protein eşit miktarda devam.
4. Giriş kontrolü olarak her örnekten 40 μL tutun.
5. Örnekleri 200 μL'lik iki eşit parçaya bölün ve tüpleri "+ HAM" ve "- HAM" olarak işaretleyin. Negatif kontrol olarak kullanılacak tüplerden birine (+ HAM) 400 mM ve ikinci tüpe (- HAM) 50°L nötr 2 M HAM (pH 7.0-7.5) ilave edin. Tiyopropil-Sepharose (TS) boncuk ilavesine devam edin.
   NOT: Cm yağış adımlarından herhangi biri sonra deney durdurulabilir. Pelet elde edildikten sonra -20 °C'de 500 μL MeOH'da bir haftaya kadar saklanabilir. 2 M HAM'lık nötr pH, asil-sistein tiyoester bağı için seçiciliğini sağlar ve dikkatlice ayarlanmalıdır. Aşırı köpük nedeniyle numune kaybını önlemek için 2SHB tampon numuneleri kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Aşağıdaki tüm adımlar - HAM ve + HAM örnekleri için aynıdır.
6. Her tüpe 30 μL TS boncuk-bulamaç ekleyin ve tüpleri RT'de 1-2 saat döndürün.
7. Artık HAM'ı temizlemek için TS boncukları Tampon A'da %1 SDS ile 4 kat yıkayın.
   1. Yavaşça 1 dakika için bir mikrofuge kullanarak tüm boncuk örnekleri aşağı spin ve dikkatle supernatant aspire.
   2. Tampon A'da boncukları %1 SDS'nin 500 μL'inde yeniden askıya alın.
   3. Adımı 3.7.1-3.7.2'yi üç kez tekrarlayın.
      NOT: Aktif tiyopropil-Sepharoz (TS), kaplinden önce nötr pH'da yıkanması gereken katkı maddeleri varlığında dondurularak kurutulur. Distile su şişme ve yıkama için tavsiye edilir. Tartılan boncuk 0.1 g ve distile su 1 mL resuspend ve RT 30 dakika-1 saat dönerken şişmesine izin verin. Şişmiş TS nötr pH'da 4 °C'de %20 etanol varlığında bir haftaya kadar saklanabilir. Azit iyonları 2-piril disülfit grupları ile reaksiyona girer beri bir bakteriyostatik ajan olarak sodyum azit kullanmayın. Daha yüksek verimlilik için taze boncuklar hazırlayın. Boncukları kullanırken, P200 pipet ucunun ucu herhangi bir hasarı önlemek için hafifçe kesilebilir.
      NOT: Deney CM yağışından sonra herhangi bir aşamada durdurulabilir. Pelet 500 μL MeOH'da -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.

4. S-asilated proteinlerin elüsyonu ve tespiti

1. Son yıkamadan sonra, yukarıda açıklandığı gibi boncukları hafifçe aşağı doğru çevirin ve boncukları rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok süpernatant aspire edin.
2. DTT ile 4x SDS örnek tampon ile boncuklardan proteinleri kurtarın.
   1. Boncuklara 50 μL 4x SDS örnek tampon ekleyin ve 80 °C'de 1500 rpm'de bir termal çalkalayıcıda 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpler soğumaya bırakın.
   2. Boncukları 3 dk için 5.000 x g'de santrifüj edin ve eluted proteinleri jel yükleme ucu kullanarak taze 1,5 mL tüpe aktarın.
3. SDS-PAGE çalıştırın ve batı blotting tarafından ilgi protein(ler) S-acylation analiz.

Yukarıda açıklanan protokolü takiben, ilk olarak jurkat hücrelerinde çeşitli proteinlerin S-aylayasyon tespit etmek için ilk acyl-RAC kullanılan, bir ölümsüzleştirilmiş T hücre hattı aslında bir T hücreli lösemi hastasının periferik kan türetilmiştir27. Düzenleyici T hücre proteinleri daha önce S-acylatedolaraktanımlanan 9,28,29 bu yöntemin yarar göstermek için seçildi. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, sistein kalıntıları ile yağ asidi moiety (+ HAM şeritli) arasındaki tiyoester bağını cleave nötr 2 M hidroksilin ile tedavi lizatlarda tirozin kinaz Lck saptanabilir. 2 M NaCl (-HAM şeritli) ile işlem gören numune, tiyoester bağlarının tespiti için tahkikatın seçiciliğini gösteren önemli bir negatif kontrolü temsil eder. Giriş şeridi sinyalin özgüllüğünü daha da doğrular ve ilgi proteini S-acylated değilse pozitif kontrol olarak hizmet verebilir. Membran daha sonra soyulmuş ve aynı anda birden fazla proteinin S-amilasyon analiz etmek için kullanılabilir acyl-RAC tsay göstermek için proteinler Emil ve LAT karşı antikorlar ile reprobed(Şekil 2A).

Doku örneklerinde protein S-aylasyonunu saptamak için bu yöntemin faydasını göstermek için fare dalağını asil-RAC protokolü uyguladık. Şekil 2B'degösterildiği gibi, Lck, Fyn ve LAT'nin S-aylaasyonu birincil fare splenositlerinde bu modifikasyonun iki tür arasında korunduğunu gösteren kolayca saptanabilir.

Şekil 1. acyl-RAC şematik temsili. Yöntem 4 ana adımdan oluşmaktadır: (1) metil metanthiosulfonat (MMTS) ile serbest tiyol gruplarının bloke sistein-acyl tiyoester bağının nötr hidroksilin (HAM) ile selektif bölünmesi, (3) bir tiyol-reaktif reçine ile doğrudan konjugasyon ile yeni maruz sistein tiyol ile proteinlerin yakalanması ve (4) yakalanan proteinlerin bir azaltıcı elüsyon tampon kullanarak kurtarma, immünoblot veya MS analizi takip. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. S-acylated proteinlerin tespiti. Jurkat T hücrelerinde (A) ve murine dalak dokusunda(B)T hücre sinyalproteinlerinin S-aylayasyonunu saptamak için bir asil-RAC testi kullanılmıştır. Lck-, Fyn ve LAT spesifik antikorlarla immünoblot, hidroksilin tedavi edilen numunede (+ HAM şeritli) bu proteinlerin S-aylakyasyonuna neden olur. Sodyum klorür (-HAM şeritli) ile tedavi edilen bir numune negatif kontrol görevi görüyor. İşlenmemiş lysates giriş şeridinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Protokolde sık kullanılan arabelleklerin arabellek bileşimi. 2SHB arabellek ve Tampon A önceden hazırlanabilir ancak pH'ları düzenli olarak kontrol edilmelidir. Lysis tampon ve HAM deney günü hazırlanmalıdır.

Çıkar çatışması bildirilmemiş.