Sipunculus nudus Coelomic Sıvı için yerinde Hibridizasyon

ISH, ilgi belirli DNA veya RNA dizisi tespit etmek için etiketli bir nükleik asit probu kullanarak, morfolojik olarak korunmuş dokularda hedef genlerin mekansal ifade deseni tanımlamak için yararlı bir yöntemdir^1,2,3. Normalde, hedef sırası polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından oluşturulur ve daha sonra antisense / sense RNA probu digoksigenin uridine-5'-trifosfat ile etiketlenmiş sentezlemek için şablon olarak kullanılır. Örnekler riboprob ile kuluçkadan önce sabitlenir ve permeabilize edilir. Aşırı sonda yıkadıktan sonra, hibridizasyon bir anti-digoksijenin antikor kullanılarak immünohistokimya ile görselleştirilmiş, hangi alkali fosfataz konjuge^3,4,5,6.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; sipariş Sipunculida: Sipunculidae) segmentsiz, coelomate ve çift taraflı simetrik deniz solucanı^7,8. Sipunculus nudus, tropikal ve ılıman kıyı sularında yaygın olarak dağılmış kozmopolit bir türdür. Aynı zamanda yüksek besin ve tıbbi değerleri nedeniyle güney Çin'de önemli bir deniz balıkçılık kaynağı^9,10. Ancak moleküler biyolojide Sipunculus nudus henüz emekleme aşamasındadır. Genlerin biyolojik rolünü tam olarak anlamak için, hücresel çözünürlükte genlerin ifade kalıplarının araştırılması büyük ilgi çekicidir. Model olmayan organizma Sipunculus nudus'tagenlerin ekspresyon kalıplarını tespit etmek için ideal bir yöntem olan ISH yöntemi henüz kurulmamıştır. Onun coelomic sıvı granülositler, vazo hücreleri, vesiküler hücreler, mikrop hücreleri, eritrositler, vb¹¹dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. Çift cinsiyet / mab-3 ilgili transkripsiyon faktörü-1(dmrt1),bu yöntemde temsili bir gen olarak kullanılan, omurgasızlar memeliler arasında değişen çoğu türde cinsiyet tayini ve farklılaşma son derece korunmuş transkripsiyon düzenleyici^12,13. Çeşitli türlerde (örn. siyah porgy, vb.) ¹⁴, dmrt1 Sertoli hücrelerinde ifade edildi, germinal hücreleri çevreleyen, olan fonksiyonu Sipunculus nudustrophoblast hücrelerine benzer . Bu nedenle Sipunculus nudus'un dmrt1'inin spermatozeugmatanın trofoblast hücrelerinde ifade edilm1ve ISH yönteminin sonucu hipotezi açıkça doğrulamıştır.

Bu protokol ilk kez ish açıklar, digoksigenin etiketli antisense / sense mRNA probları ile, onun coelomic sıvı yayma mRNA ifade desenleri belirlemek için. MRNA ifadesinin yüksek çözünürlükte çok hassas bir şekilde görüntülenmesiiçin en uygun tepki koşulları sağlanır. Geliştirilen ISH yöntemi sipunculus nudus dışında daha fazla Sipunculida türünde potansiyel olarak uygulanabilir.

Hayvan prosedürü Huaqiao Üniversitesi Hayvan Bakım ve Refah Komitesi tarafından onaylandı.

1. Riboprobe hazırlık

1. Astar tasarımı
   1. Programı Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) açın. Dmrt1 sırasını (GenBank: MK182259) sıra penceresine kopyalayın.
   2. Astar uzunluğu (23-25 bp), erime sıcaklığını (55-60 °C) ve G/C içeriğini (%40-60) ayarlayın. Astar Seç'itıklatın.
      NOT: RNA sondası için gereken minimum boyut yaklaşık 500 bp. Daha uzun probların normalde daha yüksek özgüllüğü vardır.
   3. Seçilen astarlardan birine T7 RNA polimeraz promotör sırasını (5^, -TAATACGACTTATAGGG-3) ekleyin.^, ISH için dmrt1 astar dizileri Tablo 1'degösterilmiştir.
      NOT: Duyu probları için T7 RNA polimeraz organizatörü ileri astarların 5' ucunda yer alır. Antisense problar için, T7 RNA polimeraz organizatörü ters astarların 5'ucunda yer alır.
2. PCR amplifikasyonu
   1. Mikrofuge tüplerini buzüzerine yerleştirin ve aşağıdaki reaksiyon karışımını (50 μL reaksiyon için): 1x Taq DNA polimeraz karışımı, 1 μg cDNA (100 μL coelomik sıvıdan hazırlanır), 1 μM ileri astar, 1 μM ters astar ve çekirdeksiz su hazırlayın.
   2. PcR reaksiyonu kısa bir süre pipetleme ve santrifüj ile karıştırın.
   3. Reaksiyon tüpünü bir termal döngüye yerleştirin ve PCR'yi aşağıdaki koşulları kullanarak çalıştırın: 95 °C'de 2 dk için ilk denatürasyon ve ardından 30 s için 95 °C'de 36 döngü denatürasyon, 30 s için 55-60 °C'de annealing, 30 s için 72 °C'de uzatma ve 72 °C'de 7 dk.'da son uzatma.
      NOT: Tavlama sıcaklığı astarlara göre optimize edilmelidir.
3. PCR ürün arınması ve doğrulaması
   1. 50 μL PCR karışımını doğrudan %1 agarose jelüzerine yükleyin. Agarose jeli 150-180 V'de 10 dk 0.5x TBE'de çalıştırın. Spesifik DNA parçalarını %1 agarose jelden ayırın.
      NOT: DNA yayma olarak değil, tek bir bant olarak görünmelidir.
   2. Üreticinin protokolüne göre jel çıkarma kiti kullanarak DNA parçalarını arındırın. Saflaştırılmış ürünleri spektrofotometri ile 260 nm dalga boyunda ölçün.
   3. Sıralayarak PCR ürünlerinin orijinalliğini doğrulayın.
      NOT: (Duraklatma noktası) Saflaştırılmış PCR ürünleri -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.
4. Ribozob sentezi
   1. RNase içermeyen mikrofuge tüplerini buzüzerine yerleştirin ve mikrofuge tüpüne (10 μL reaksiyon için): 1x Digoxygenin RNA Etiketleme Karışımı, 1x transkripsiyon tamponu, 0,5 μL RNase inhibitörleri, 1 μL T7 RNA polimeraz, 1 μg PCR ürünü ve RNase içermeyen su ekleyin. Kısa bir süre pipetleme ve santrifüj ile reaksiyon karıştırın. 37 °C'de 2 saat kuluçka.
   2. 2 μL RNase içermeyen DNase I. Pipetleme ve santrifüj ile reaksiyonu kısa bir süre karıştırın. 37 °C'de 15 dakika kuluçka.
   3. 2 μL 0,2 M EDTA (pH 8.0) ekleyin. Kısa bir süre pipetleme ve santrifüj ile reaksiyon karıştırın.
   4. Yukarıdaki reaksiyona 2,5 μL 4 M LiCl ve 75 μL önceden önceden gelen etanol ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın. -70 °C'de 30 dk bekletin.
   5. 4 °C'de 10 dk için 12.000 x g santrifüj. Etanolde dekant. Önceden soğutulmuş 1 mL ekleyin 70% etanol (v /v) ve yavaşça karıştırarak yağış yıkayın.
   6. 4 °C'de 5 dk için 12.000 x g santrifüj. %70 etanol decant ve bir alkol lambası yakınında kısa bir süre yağış kuru. 30 μL'lik RNase içermeyen su ekleyerek yağışı eritin ve hafifçe karıştırın.
   7. %1 agarose jel üzerine sentezlenmiş RNA'nın 2 μL'sini yükleyin. Agarose jeli 180 V'de 5-10 dk 0,5x TBE'de çalıştırın. 260 nm dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak etiketli RNA konsantrasyonu ölçün.
      1. RNase kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen mikrofuge tüpleri ve filtre uçlarını kullanın.
         NOT: (Duraklatma noktası) Digoksijenin etiketli problar -70 °C'de birkaç ay saklanabilir.

2. Coelomic sıvı toplama

1. Diseksiyon masasındaki S. nudus'u iğnelerle düzeltin. Küçük otoklavlı makas ile S. nudus gövdesini açın. Bir pipet ile coelomic sıvı izole.
2. 1 mL coelomik sıvıyı pipetle poli-D-lizin tedavi edilen mikroskop slaytlarına toplayın ve aktarın. Kokomik sıvıyı bir pipet ucuyla eşit olarak uygulayın. 37 °C'de 1 saat boyunca kaydırakları havakurutun.

3. In situ hibridizasyon

1. 1. Gün
   1. 100 mL 1x dietil pirokarbonat işlenmiş fosfat tamponlu salin (DEPC-PBS) içeren bir slayt boyama kavanozundaki slaytları yeniden nemlendirin. 1x DEPC-PBS ile 3 kez rehidrat, nazik ajitasyon ile yıkama başına 5 dk.
   2. 5 dk. Oda sıcaklığında 10 μg/mL proteinaz K ile sindirimi ile coelomik sıvının bulaşmasını permeabilize edin. Slaytları 1x DEPC-PBS'de 5 dk 3 kez hafif ajitasyonla yıkayın.
   3. Slaytlara duyu/antisense riboprob içeren 50 μL hibridizasyon karışımı (HM) ekleyin ve bir kapak fişi ekleyin.
   4. Islık kutu tamponu ısıt kutuya ekleyin. Islak kutuya slaytlar koyun ve parafin film ile iyi mühür. 60 °C'de bir gecede (en az 16 saat) melezleştirin.
2. 2. Gün
   1. Yıkama tamponu 65 °C'de önceden ısıtın. Kayağı yıkama tamponunu içeren slayt boyama kavanozuna batırın ve kapak kayması otomatik olarak kaydırılanana kadar bekletin. Yaklaşık 5 dakika sürer.
   2. 65 °C'de yıkama tamponu ile 2 kez yıkayın, yıkama başına 30 dk nazik ajitasyon ile. 65 °C'de 0,2 x tuzlu sodyum sitrat (SSC), yıkama başına 30 dk hafif ajitasyonla 2 kez yıkayın. Oda sıcaklığında Tween 20 (MABT) içeren maleik asit tamponu ile 2 kez yıkayın, nazik ajitasyon ile yıkama başına 30 dk.
   3. Slaytları oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca bloke tamponunda kuluçkaya yatırın. 1 mL anti-digoksigenin-AP Fab parçaları çözeltisi 1/5000 seyreltilmiş slaytlar inkübülasyon 4 ° C gecede engelleme tampon ile.
3. 3. Gün
   1. Antikor solüsyonunu çıkarın ve slaytları MABT'de kısa bir süre yıkayın. MABT ile 4 kez oda sıcaklığında, 25 dk'lık yıkama başına nazik ajitasyonla yıkayın.
   2. Oda sıcaklığında alkali fosfataz tampon ile slaytlar kuluçka 3 kez, yıkama başına 5 dakika. Alkali fosfataz tamponu çıkarın ve 5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (BCIP)/nitro mavi tetrazolyum (NBT) boyama çözeltisi 1 mL ekleyin. Slaytları karanlıkta tutun.
   3. Optik mikroskop altında renk reaksiyonu periyodik olarak gözlemleyin. Renk tamamen geliştirildiğinde (1-4 saat aralığında reaksiyon süresi), slaytları oda sıcaklığında MABT ile 2 kez yıkayın, nazik ajitasyon la yıkama başına 5 dk.
   4. Oda sıcaklığında stop çözeltisi ile 2 kez, yıkama başına 15 dk nazik ajitasyon ile yıkayın. 30 dakika oda sıcaklığında, aşırı leke kaldırmak için metanol slaytlar kuluçka. Arka plan rengine göre metanol yıkama 2 veya 3 kez yapılabilir ve renk değişikliği süresi uzatılabilir.
   5. MABT ile 2 kez oda sıcaklığında, 5 dk'lık yıkama başına nazik ajitasyonla yıkayın. Slaytları taze bir filtre kağıdına aktarın. Gliserol 50 μL ekleyin. Kapakları ekleyin ve mikroskobik gözlemleyin.
      NOT: Çözüm kompozisyonu Tablo 2'degösterilebilir.

ISH'de yer alan adımların bir özeti Şekil 1'degösterilmiştir. Dmrt1 için antisense ve buna karşılık gelen duyu riboprobları, coelomik sıvı CD'lerinden güçlendirilmiş PCR ürünlerinden sentezlenmiştir. PCR ürünlerinin orijinalliği doğrudan sıralama ile doğrulandı. Riboprobes üreticinin protokollerine göre T7 RNA polimerazlar kullanılarak sentezlenmiş ve bazı küçük değişiklikler ile önceki bir rapor4. ISH'nin temsili sinyalleri Şekil 2'degösterilmiştir. Sipunculus nudus coelomik sıvının dmrt1 hedefleyen antisense riboprobelu ISH'i spermatozeugmatanın trofoblast hücrelerinde yoğunlaşan mor boyamayı ortaya çıkarır(Şekil 2A, B, kırmızı oklar). Bir anlamda riboprobe negatif kontrol olarak kullanıldı ve dmrt1 için duyu riboprobu herhangi bir hibridizasyon sinyali tespit etmedi(Şekil 2C).

Şekil 1. ISH akış diyagramı. Mavi kutular riboprob sentezleme adımlarıdır. Açık yeşil kutular yerinde yordamlar için adımlardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Sipunculus nudus coelomic sıvısında dmrt1 ifadesi ISH tarafından saptanmıştır. (A, B) Dmrt1 antisense riboprobe ile hibridizasyon. (C) Dmrt1 duyu ribosonu ile hibridizasyon. Kırmızı oklar trofoblast hücrelerinde hibridizasyon sinyallerini temsil eder. sz, spermatozeugmata. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakam Li ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Dmrt1 astar dizileri.

Tablo 2. ISH protokolünde kullanılan çözümlerin bileşimi.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.