Method Article

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

DOI:

10.3791/61031

⸱

May 9th, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kynurenine yolu ve kynurenines adı verilen triptofan katabolitleri, bağışıklık düzenlemesi ve kanser biyolojisinde rol almaları nedeniyle daha fazla ilgi gördü. Bir in vitro hücre kültürü testi genellikle farklı triptofan katabolitlerinin bir hastalık mekanizmasına katkısı hakkında bilgi edinmek ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılır. Salgılanan metabolitler ve sinyal molekülleri bakımından zengin olan hücre kültürü ortamı triptofan metabolizmasının ve diğer hücresel olayların durumunu yansıtır. Karmaşık hücre kültürü ortamında birden fazla kynureninin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için yeni protokoller, birden fazla numunenin güvenilir ve hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin vermek için arzu edilir. Bu, kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Bu güçlü teknik metabolitlerin nicelleştirilmesi için birçok klinik ve araştırma laboratuvarında kullanılır ve kynurenines ölçümü için kullanılabilir.

Burada sunulan, in vitro kültürlü kanser hücrelerinden toplanan ortamda dört kynureninin, yani kynurenine, 3-hidroksisinurenin, 3-hidroksiranilik ve ksantrinik asidin eşzamanlı belirlenmesi için tek dörtlü kütle spektrometresi (LC-SQ) ile birleştirilmiş sıvı kromatografinin kullanımıdır. SQ dedektörünün kullanımı kolaydır ve diğer kütle spektrometrelerine kıyasla daha ucuzdur. SQ-MS analizinde, numuneden birden fazla iyon oluşturulur ve belirli kütle-şarj oranlarına(m/z)göre ayrılır ve ardından Tek İyon İzleme (SIM) modu kullanılarak tespit edilir.

Bu makale, bildirilen yöntemin avantajlarına dikkat çeker ve bazı zayıf noktaları gösterir. Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi ile birlikte numune hazırlama dahil olmak üzere LC-SQ analizinin kritik unsurlarına odaklanmıştır. Kalite kontrol, yöntem kalibrasyon koşulları ve matris etkisi konuları da tartışılmaktadır. 3-nitrotirozinin basit bir uygulamasını tüm hedef analitler için bir analog standart olarak tanımladık. İnsan yumurtalık ve meme kanseri hücreleri ile yapılan deneylerle doğrulanan LC-SQ yöntemi güvenilir sonuçlar üretir ve diğer in vitro hücresel modellere daha fazla uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kynurenine pathway (KP), insan hücrelerinde triptofan (Trp) katabolizmanın ana yoludur. Ekstrahepatik hücrelerde indoleamin-2,3-dioksijenaz (IDO-1) KP'nin ilk ve sınırlayıcı enzimidir ve Trp'yi N-formilkynurenine1'edönüştürür. KP içindeki diğer adımlar, diğer ikincil metabolitleri, yani çeşitli biyolojik özellikler gösteren kynureninleri oluşturur. Kynurenine (Kyn), aryl hidrokarbon reseptörüne (AhR) bağlandıktan sonra toksik özellikleri gösteren ve hücresel olayları düzenleyen ilk kararlı Trp katabolitidir2. Daha sonra, Kyn kendiliğinden veya enzim aracılı süreçlerde çeşitli moleküllere dönüştürülür ve 3-hidroksiynurenine (3HKyn), antranilik asit (AA), 3-hidroksiranilik asit (3-HAA), kynurenic asit (Kyna) ve ksantürenik asit (XA) gibi metabolitler üretir. Başka bir downstream metabolit, 2-amino-3-karboksimonik asit-6-semialdehit (ACMS), kinolinik asit (QA) veya pikolinik asit (PA)1için enzimatik olmayan siklizyon geçirir. Son olarak, QA ayrıca nikotinamid-adenin dinükleotid (NAD+)3, önemli bir enzim kofaktörü olan KP uç nokta metabolitine dönüştürülür. Bazı kynureninler Kyna ve PA gibi nöroprotektif özelliklere sahipken, diğerleri, yani 3HAA ve 3HKyn,toksiktir 4. 3HKyn'den oluşan ksanturenik asit antioksidan ve vasorelaksasyon özellikleri sunar5. XA yaşlanma lenslerinde birikir ve epitel hücrelerinin apoptozlanmasına yol açar6. 20. yüzyılın ortalarında tanımlanan KP, çeşitli bozukluklara katılımı gösterildiğinde daha fazla ilgi gördü. Bu metabolik rotanın artan aktivitesi ve bazı kynureninlerin birikmesi immün yanıtı modüle eder ve depresyon, şizofreni, ensefalopati, HIV, demans, amyotrofik lateral skleroz, sıtma, Alzheimer, Huntington hastalığı ve kanser4,7gibi farklı patolojik durumlarla ilişkilidir. Trp metabolizmasında bazı değişiklikler tümör mikroçevronmentlerinde ve kanser hücrelerinde gözlenir2,8. Ayrıca, kynurenines umut verici hastalık belirteçleri olarak kabul edilir9. Kanser araştırmalarında, in vitro hücre kültürü modelleri iyi kurulmuş ve antikanser ilaçlara verilen yanıtların klinik öncesi değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır10. Trp metabolitleri hücreler tarafından kültür ortamına salgılanır ve kynurenine yolunun durumunu değerlendirmek için ölçülebilir. Bu nedenle, kolay, esnek ve güvenilir bir protokole sahip çeşitli biyolojik örneklerde mümkün olduğunca çok sayıda KP metabolitinin aynı anda tespiti için uygun yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.

Bu yazıda, kanser hücrelerinden toplanan kültür sonrası bir ortamda LC-SQ tarafından Kyn, 3HKyn, 3HAA ve XA olmak üzere dört kynurenine yolu metabolitinin aynı anda belirlenmesi için bir protokol açıklıyoruz. Modern biranalitik yaklaşımda, Ehrlich reaktifi11,12kullanan biyokimyasal spesifik olmayan testlerin aksine, bireysel triptofan katabolitlerinin eşzamanlı tespiti ve niceliği için sıvı kromatografisi 13 , 14 , 15,16tercih edilir. Şu anda, insan örneklerinde kynurenines tayini için birçok yöntem mevcuttur, esas olarak ultraviyole veya floresan dedektörleri ile sıvı kromatografisine dayanmaktadır13,17,18,19. Sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi dedektörü (LC-MS) ile birleştiğinde, daha yüksek hassasiyetleri (daha düşük algılama sınırları), seçicilikleri ve tekrarlanabilirlikleri nedeniyle bu tür analizler için daha uygun görünmektedir.

Trp metabolitleri insan serumu, plazma ve idrar13,20,21,22,23'te zaten belirlenmiştir, ancak hücre kültürü ortamı gibi diğer biyolojik örnekler için yöntemler de istenmemektedir. Daha önce, LC-MS, interferon gama (IFN-γ) 24 ,25,26ile tedavi edilen insan glioma hücrelerinin, monositlerin, dendritik hücrelerin veya astrositlerin kültleştirilmesinden sonra toplanan bir ortamda Trp türevi bileşikler için kullanılmıştır. Şu anda, farklı kültür ortamlarında, hücrelerde ve kanser modellerinde kullanılan tedavilerde çeşitli metabolitlerin değerlendirilmesine izin verebilen yeni onaylanmış protokollere ihtiyaç vardır.

Geliştirilen yöntemin amacı, KP'deki anormallikleri gösterebilen dört ana kynurenines'i (bir analitik çalışma içinde) ölçmektir. Burada sunulan, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden toplanan ortamda bir iç standart (3-nitrotirozin, 3NT) kullanılarak seçilen anlamlı kynureninlerin nicel LC-SQ analizi için yakın zamanda yayınlanan protokolümüzün kritik adımları27. En iyi bilgimize göre, in vitro yetiştirilen hücrelerden elde edilen bir kültür ortamında 3HKyn, 3HAA, Kyn ve XA'nın eşzamanlı olarak ölçülmesi için ilk LC-SQ protokolüdür. Bazı değişikliklerde, yöntem trp metabolizmasındaki değişiklikleri daha geniş bir hücre kültürü model yelpazesinde incelemek için daha fazla uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Standart 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standart stok çözümlerinin hazırlanması

  1. Reaktifleri bir şişede en yüksek doğrulukta (her biri 0,3 mg) tartın. Daha iyi doğruluk için, çözücünün hacmini adım 1.2'ye göre ayarlayarak reaktifleri ölçeklendirin.
  2. 1 g/L stok çözeltisi elde etmek için çözücünün 300 μL'sinde reaktifleri çözün. Dimetil sülfitte (DMSO) Kyn, 3HAA ve XA; Hidroklorik asit (HCl) ile pH 2.5'e asitlenmiş suda 3HKyn.
    DİkKAT: 3HAA gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş eder. Solunduğunda, ciltle temas ettiğinde ve yutulduğunda zararlıdır. Eldiven ve maske gibi uygun korumayı takın.
  3. Şişeyi sıkıca kapatın ve çözünmeyi hızlandırmak için 1 dakika boyunca ultrasonik bir banyoya yerleştirin.
    NOT: Stok çözeltilerini -20 °C'de saklayın ve stok çözeltilerinin kararsızlığı nedeniyle donma/çözülmeyi (maksimum 3 döngü) en aza indirin.

2. Kömürle işlenmiş kültür ortamının hazırlanması

  1. Bir tüpte, 280 mg aktif kömür ağırlığında ve ilgi çekici hücreleri kültleme için hazırlanan sıvı ortamın 5 mL'sini ekleyin.
  2. Oda sıcaklığında (hızı 50 salınım / dk'ya ayarlayın) 2 saat boyunca bir testere sallayıcı üzerinde orta ve kömür ile tüpü sallayın. Ardından, tüpleri 15 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüj edin.
  3. Tüpü santrifüjden çıkarın ve tortuyu bozmadan süpernatantı dikkatlice toplayın. Tüm kömür kalıntılarını gidermek için gerekirse santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın.
  4. Süpernatantı 0,45 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.
  5. Adım 6.3.2'de açıklandığı gibi LC-MS'te bir pilot örnek çalıştırarak kömür önceden işlenmiş kültür ortamının kynurenines izlerinden yoksun olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 2.1-2.4 adımlarını yineleyin.
    NOT: Tam kültür ortamı başlangıçta kynurenines içermiyorsa, kömür kullanarak arınma adımı atlanabilir. Bu durumda, genellikle hücre kültleme için hazırlanan komple ortamı kullanarak kalibrasyon standartlarını ve kalite kontrol örneklerini hazırlayın.
  6. Hazırlanan ortamı analize kadar 4 °C'de saklayın.

3. Kalibrasyon çözümlerinin ve kalibrasyon eğrilerinin yapılması

  1. Kömür ön işlemli kültür ortamını 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözelti ile yükseltin ve kalibrasyon aralıklarını kapsayacak şekilde en az altı farklı konsantrasyonda dört standart (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ekleyin. Her numunenin son hacmini 150 μL'de tutun. Numune hazırlama için 1,5 mL santrifüj tüpleri kullanın.
    NOT: 3HKyn için önerilen kalibrasyon noktaları: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; Kyn için: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol / L; 3HAA için: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol / L; XA için: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol / L.
  2. Numune deproteinizasyonu için her tüpe %1 (v/v) formik asit içeren 150 μL soğuk metanol (-20 °C'de tutulur) ekleyin. Tüpleri ve girdabı sıkıca kapatın.
  3. Numuneleri 40 dakika boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. Numuneleri 14.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüj edin. Tüpleri santrifüjden çıkarın. Yeni tüplere süpernatants toplayın. Tortuyu bozmayın.
  5. Otomatik pipet kullanarak 270 μL'lik süpernatant'ı cam şişeye aktarın. Şişeleri evaporatöre koyun ve kuruyana kadar hafifçe buharlaşın. Uçucu bileşenleri buharlaşmak için su/metanol fraksiyonları için uygun programı kullanın. 40 °C'den yüksek sıcaklık uygulamayın ve aşırı kurumaya karşı kaçının.
    NOT: Düz alt cam şişeler, yani kromatografik şişeler, plastik konik tüplere kıyasla daha hızlı buharlaşmayı ve daha yüksek geri kazanımları kolaylaştırır.
  6. 30 dakika sonra buharlaşma durumunu kontrol edin. Gerekirse buharlaşmaya devam edin (örneğin, ekstra 10 dakika ekleyin). Aşırı kurumaktan kaçının.
  7. Şişeleri evaporatörden çıkarın. Her numuneyi sudaki %0,1 (v/v) formik asitin 60 μL'sinde yeniden inşa edin. Çözücüyü artık malzemeyi içeren şişeye ekleyin. Şişeleri ve girdabı sıkıca kapatın.
  8. Numuneyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve çökemiş proteini ayırmak için 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da döndürün.
  9. Protein peletini bozmadan, süpernatantları otomatik pipetli konik cam uçlu kromatografik şişelere aktarın. Şişeleri sıkıca kapatın.
  10. Kesici uç şişesinde hava kabarcıklarının olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse çıkarın (örneğin, girdapla).
  11. Örnekleri içeren kromatografik şişeleri LC otomatik örnekleyiciye aktarın. Otomatik örnekleme tepsisine yerleştirilen örneklerin konumunu kaydedin.

4. Kalite kontrol (QC) örneklerinin hazırlanması

  1. Kömür ön işlemli kültür ortamını (1,5 ml santrifüj tüpte hazırlanmış) 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözeltisi ve dört kynurenin (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) standartları ile kalibrasyon eğrilerinin doğrusal aralığından seçilen bir konsantrasyonda başaklandırın. Numunenin son hacmini 150 μL'de tutun.
    NOT: Varsa, kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığının altına düşen farklı konsantrasyonlarda birkaç QC numunesi hazırlayın.
  2. Bölüm 3'te açıklanan protokolü izleyin (adım 3.2-3.11).

5. LC-MS sisteminin kurulması

  1. Mobil faz çözücüleri hazırlayın: Solvent A: Ultra saf suda 20 mmol / L amonyum formatında (formik asitle ayarlanmış pH 4.3); Solvent B: %100 asetonitril.
    NOT: Sadece borosilikat cam şişeler kullanın. Şişeleri doldurmadan önce ultra saf suyla durulayın. Deterjanlarla temizlenmiş şişeler kullanmayın.
    DİkKAT: Asetonitril ciddi sağlık etkilerine veya ölüme neden olur. Isı ile kolayca tutuşur. Asetonitril sıvı ve buhar gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş edebilir.
    1. Bir cam şişede 50 mL ultra saf suda kristal reaktifi (15,77 g) eriterek 5 mol/L stok amonyum formatlı çözelti hazırlayın. Tüm artıklar çözülene kadar karıştırın. Kalan kalıntıları gidermek için 0,45 μm membran boyunca filtreleyin (örneğin, naylon şırıng filtresi kullanarak). Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
    2. Bir kehribar cam şişede 980 mL ultra saf suya suya 4 mL 5 mol/L amonyum format ekleyerek Solvent A'yı hazırlayın ve iyice karıştırın. Bir karıştırma çubuğunu batırın ve çözücü ile şişeyi manyetik bir karıştırıcıya koyun. Çözeltiye bir pH elektrot batırın ve karıştırma altında pH'ı kontrol edin. Formik asit stok çözeltisi ekleyin (%98-%100) pH 4.3 elde etmek için 0.2 mL uçlu otomatik pipet kullanarak damla yönünde, ultra saf su ile sesi 1 L'ye kadar ayarlayın ve iyice karıştırın.
      NOT: Herhangi bir mikrobiyal büyümeyi önlemek için çözücüleri haftada en az bir kez hazırlayın.
      DİkKAT: Formik asit (FA) solunduğunda toksiktir, cilt yanıklara ve göz hasarına neden olur. Duman kaputunun altında çalışın; koruyucu eldiven ve ceket giyin.
    3. Kalan kalıntıları gidermek için tüm çözeltileri 0,22 μm membrandan (örneğin naylon şırınna filtresi) filtreleyin. İsteğe bağlı olarak, sistemi gelen parçacıklardan korumak için LC çözücü rezervuarları için ayrılmış çözücü giriş filtrelerini kullanın.
  2. LC-MS kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın.
  3. Kabarcıkları gidermek ve tüm solvent kanallarını astarlamak için LC sistemini mobil fazla temizle.
  4. Analitik sütunun tıkanmasını korumak için bir koruma sütunu topluluk haline getirmek.
  5. Koruma ve analitik sütunu (C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 μm) yaklaşık 30 dakika boyunca% 100 asetonitril ile yıkayın ve ardından sütunda kararlı bir basınç gözlenene kadar% 100 çözücü A ile yıkayın. Kontrol yazılımını kullanarak sistem performansını kontrol edin.
  6. Veri toplama yazılımında uygun LC parametrelerini ayarlayın.
    1. Degrade programını kurun: 0-8 dk çözücü B% 0; 8-17 dk çözücü B 0-2%; 17-20 dk çözücü B% 2; 20-32 dk çözücü B 10-30%; 32-45 dk çözücü B% 0.
    2. Mobil faz akış hızını 0,15 mL/dak, toplam analiz çalışma süresini 45 dk, kolon sıcaklığını +40 °C ve enjeksiyon hacmini 10 μL olarak ayarlayın.
  7. Kütle spektrometresi dedektörünün alım parametrelerini ayarlayın.
    1. İyonizasyon parametrelerini uygulayın: tek iyon izleme (SIM), pozitif iyonlaşma, 50 psi'lik nebülizör basıncı, +350 °C kurutma gazı sıcaklığı, 12 L/dk kurutma gazı akışı ve 5500 V kılcal gerilim.
    2. Analit izleme iyonlarını seçin: 3HKyn m/z 225.0 için (tarama süresi: 2-6 dk, parçalayıcı voltajı: 100 V); Kyn m/z 209.0 için (tarama süresi: 6-12 dk, parçalayıcı voltaj: 80 V); 3HAA m/z 154.0 için (tarama süresi: 12-18 dk, parçalayıcı voltaj: 80 V); 3NT m/z 227.0 için (tarama süresi: 18-23 dk, parçalayıcı voltaj: 100 V); XA m/z 206.0 için (tarama süresi: 23-45 dk, parçalayıcı voltaj: 100 V).
  8. Bir çalışma listesi oluşturun ve örnekleri LC sisteminde çalıştırın.
  9. İlk başta, deneysel örneklerin analizinden önce, en azından üç taraflı olarak boş bir örnek (Solvent A) ve ardından bir QC örneği çalıştırın.
  10. Veri analizi yazılımını açın ve QC örneği için elde edilen sonuçları yükleyin.
  11. Analit tepelerinin kromatogramdaki konumunu kontrol edin. Sinyaller beklenen konumun ötesine geçtiğinde, uygun analit sinyallerinin toplanması için zaman kapılarını ayarlayın. Sinyal entegrasyonu hakkında talimat için yazılım kılavuzuna bakın.

6. Kalibrasyon eğrisinin inşası

  1. Veri toplama yazılımında, kalibrasyon standartlarını çalışma listesine ekleyin ve standartları üç taraflı olarak çalıştırın.
  2. Sırasıyla yaklaşık 4,4 dk, 10 dk, 16 dk, 21 dk ve 30 dk tutma süresinde 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT ve XA'ya karşılık gelen tepe alanını entegre edin ve ölçün.
  3. Bir elektronik tablo programı kullanarak her metabolit için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturun.
    1. Kalibrasyon grafiğini oluşturmak için, analit tepe alanının 3NT tepe alanı üzerindeki bir oranının değerini analit konsantrasyonuna göre çizin.
    2. Orta alanda çalışılan analizlerin iz kalmadığından emin olmak için boş numuneyi (kömür önceden işlem görmüş kültür ortamı sadece 3NT ile çivilenmiş) analiz edin. Aksi takdirde, elde edilen değeri her kalibrasyon noktasından çıkarın.
    3. Her kalibrasyon eğrisinin doğrusallığını kontrol edin.
      1. Ayrı ayrı, her analit için, bir eğim kesişim doğrusal denklemi (y = ax +b) oluşturun, burada y, analit tepe alanının 3NT tepe alanına karşı oranına karşılık gelir, a eğimdir, x analit konsantrasyonudur (μmol / L) ve b eğri kesişimini ifade eder. 'y' grafiğinin 'x'e karşı çizilmeleri kalibrasyon eğrisini oluşturur.
      2. Grafiğe doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin, kalibrasyon eğrisi denklemini ve regresyon katsayısını grafikte görüntüleyin. Regresyon katsayısının > 0,990 olduğundan emin olun. Eşleşmeyen kalibrasyon standartları durumunda bunları bir kez daha hazırlayın ve/veya analiz edin. İsteğe bağlı olarak, kalibrasyon eğrisinin konsantrasyon aralığını değiştirin.
    4. Deneysel örnekleri analiz etmeden önce sistem performansını kontrol etmek için QC örneklerini analiz edin. Uyumsuzluk durumunda (referans değerden %20 sapma ±), yeni kalibrasyon eğrilerini hazırlayın.

7. In vitro hücre kültürü ve analiz için örnek toplama

  1. Çalışılan kanser hücrelerini (MDA-MB-231 veya SK-OV-3) DMEM'de (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası) 4,5 g/L ᴅ-glikoz içeren plaka, %10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS), 2 mmol/L ʟ glutamin ve 1 U penisilin/streptomisinin ve kültürünün 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 deney için genişletilmesi. Hücreleri konfluenslerin %80'inden geç.
  2. Hücreleri tripin kullanarak kültür çanaktan ayırın, kuyu başına 0,3 × 106 hücre yoğunluğunda 12 kuyu plakası üzerinde deney için tohum ve bir gecede bir inkübatöre yerleştirin.
  3. Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin ve deneysel tasarıma bağlı olarak, çalışılan bileşiklerin eklenmesiyle veya eklenmeden taze DMEM ekleyin.
  4. 48 saat sonra, ortamı hücrelerin üstünden (yaklaşık 500 μL) 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın. Herhangi bir hücre kalıntılarını gidermek için 5 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj. Süpernatant toplayın ve analize kadar -80 °C'de saklayın.
  5. Hücresel peletin protein tahmini için adım 7.4'ten sakla. Numuneleri -20 °C'de dondurun.
    NOT: Farklı kuyulardan bir ortam için elde edilen sonuçlar, bireysel kuyulardaki hücre sayısındaki değişkenliği hesaba katmak için toplam protein içeriğine normalleştirilmelidir. Protein konsantrasyonu 9.

8. LC-MS analizi için numuneler hazırlayın

  1. Donmuş numuneyi oda sıcaklığında çözün ve iyice karıştırın. Kültür ortamının 149,25 μL'lik kısmını santrifüj tüpüne (1,5 mL) aktarın.
  2. 0,75 μL 0,1 g/L 3NT çözelti (dahili standart) ekleyin. Tüpleri ve girdabı iyi kapatın.
  3. Numune deproteinizasyonu için %1 (v/v) FA içeren -20 °C metanolde 150 μL soğutulmuş ekleyin. Tüpleri ve girdabı iyi kapatın.
  4. Bölüm 3'te açıklandığı gibi örnek hazırlamaya devam edin (adım 3.3-3.11).
    NOT: SK-OV-3 gibi bazı kanser hücreleri büyük miktarlarda Kyn'i bir kültür ortamına salgılar. Verileri kalibrasyon eğrisinin doğrusal bir aralığına sığdırmak için numunenin yaklaşık 100 kat seyreltilmesi gerekir. Bu durumda, numunenin bir kısmını suda% 0,1 (v/v) FA ile seyreltin ve seyreltilmemiş numuneye ek olarak analiz edin. Kalibrasyon eğrisi için standartların referans örnekleri 100 kat seyreltilmiş tam kültür ortamında hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, deneysel numunedeki Kyn konsantrasyon seviyesine ayarlamak için kalibrasyon eğrisine daha fazla nokta ekleyin (uygun çözünürlük ve doğrusallık elde edilirse).
  5. Örnekleri bölüm 5'te açıklandığı gibi LC-MS ile analiz edin. Bir çalışma listesi oluşturun ve her örneği üç taraflı olarak çalıştırın.
  6. Çalışma listesi tamamlandıktan sonra, analit tepe alanını ölçün.
  7. Kullanılabilir yazılımı ve elde edilen sayısal verileri kullanarak bir elektronik tablo oluşturun.
  8. Bir elektronik tablo sütununda, analit tepe alanının 3NT tepe alanı üzerindeki oranını hesaplayın.
  9. Deneysel örneklerde bulunan analiz konsantrasyonlarını hesaplamak için her bir analit için ayrılmış ayrı bir doğrusal kalibrasyon denklemi kullanın (adım 6.3.'den itibaren).

9. Protein içeriğinin ve veri normalleşmesini değerlendirme

  1. Hücresel peleti 1,5 mL tüpte 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 7,5 adımından yeniden tanımlayın.
    NOT: 950 mL ultra saf suda 8 g sodyum klorür, 0,2 g potasyum klorür, 1,44 g sodyum fosfat dibasik, potasyum dihidrojen fosfat eriterek PBS çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın. Hidroklorik asit (damla yönünde) ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Ultra saf su ile hacmi 1 L'ye kadar ayarlayın. Homojen olana kadar iyice karıştırın.
    DİkKAT: Hidroklorik asit oldukça aşındırıcıdır ve uygun güvenlik önlemleri ile ele alınmalıdır. İnsan derisi ile temas kızarıklığa, ağrıya, cilt yanıklığına neden olabilir. Duman kaputunun altında çalışın; koruyucu eldiven ve ceket giyin.
  2. Numuneleri -20 °C'de dondurun ve buz üzerinde çözün. Bu adımı 3x tekrarlayın.
  3. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantları yeni tüplere toplayın. Peletin rahatsız etmeyin.
  4. Pbs ile süpernatantları 10x seyreltin.
  5. Kuyu aralığı başına proteinin 0 ila 2 μg arasında bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
    1. Kalibrasyon için sığır serum albümini (BSA) standart soluyu hazırlayın. 1,23 μg BSA'yı 1 mL ultra saf su ve girdap kuyusunda çözün.
    2. 96 kuyulu bir plakada, farklı miktarlarda BSA standart çözeltisi (1,23 μg/mL) yükleyin: 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
    3. Kuyuyu PBS ile 50 μL'lik son hacme kadar doldurun.
  6. Aynı 96 kuyu plakasına 9.4 adımından 10 - 15 μL hücre likatı yükleyin. 50 μL'lik son hacme ulaşmak için kuyuları PBS ile doldurun.
    NOT: Gerekirse, kalibrasyon eğrisinin doğrusal aralığına uyacak şekilde her kuyudaki hücre likır aliquotunun hacmini ayarlayın. Son hacmi kuyu başına numunenin 50 μL'sine kadar tutun.
  7. Her kuyuya 200 μL Bradford reaktifi (ultra saf su ile 5 kez seyreltilmiş) ekleyin.
  8. 96 kuyulu pate'yi oda sıcaklığında en az 5 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı bir mikro plaka okuyucusuna yerleştirin. Absorbansı φ = 595 nm'de ölçün.
  9. Elektronik tablo programı kullanarak kalibrasyon eğrisi oluşturun. Emiciliğe karşı BSA miktarını (μg) çizin. Doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin, kalibrasyon eğrisi denklemini ve regresyon katsayısını grafikte görüntüleyin.
  10. Örnekteki protein miktarını hesaplamak için doğrusal denklemi (y = balta +b, burada y φ = 595 nm'deki absorbansa karşılık gelir, a eğimdir, x bir protein içeriğidir (μg) ve b eğri kesişimini ifade eder) kullanın.
    NOT: Hesaplamalarda örnek bir seyreltme faktörü düşünün.
  11. Numunedeki kynurenine miktarını 1 mg protein başına normalleştirmek için tahmini protein içeriğini kullanın. Bunu yapmak için, adım 8.9'da belirlenen kynurenin konsantrasyonu ile toplam protein içeriğini adım 9.10'dan bölün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MS, karmaşık örneklerin bazı bileşenleri matris etkilerine neden olsa ve analitlerin iyonlaşmasını tehlikeye atsa da, biyolojik olarak aktif moleküllerin ölçülmesinde tartışılmaz avantajlar sunar. İyon bastırmaya veya iyon geliştirmesine yol açar, doğruluğu güçlü bir şekilde azaltır ve yöntemin ''zayıf' bir noktası olarak kabul edilen LC-MS'in tespit / nicelifikasyon sınırını etkiler. Protokolümüzde, iyonlar, Trp metabolitleri belirleme13ile ilgili diğer çalışmalarda da kullanılan pozitif modda...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden bir ortamda ölçülen dört ana Trp metabolitinin (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) eşzamanlı nicelemesi için ayrıntılı bir LC-SQ protokolü sunun. Analizdeki en önemli noktalar olan numune hazırlama, kromatografik/kütle spektrometresi prosedürü ve veri yorumlamaya özel önem verilir.

Genel olarak, LC-MS analizi, yüksek hassasiyet nedeniyle, kullanılan malzemelerin protokol katılığı ve saflığının en yüksek standartlarını gerektirir. Standart pro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Doğu Polonya Operasyonel Programı Geliştirme 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-09-00) kapsamında Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'ndan Avrupa Birliği tarafından, Lublin John Paul II Katolik Üniversitesi Biyoteknoloji ve Çevre Bilimleri Fakültesi (Ilona Sadok için Genç Bilim adamları hibesi), Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından desteklendi. OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 Magdalena Staniszewska, İlke Araştırmacısı).  Yazarlar, hücre kültleme ve protein nicelleştirme ekipmanlarını paylaştığı için Oksidatif Stres Laboratuvarı, Disiplinlerarası Araştırma Merkezi, JPII CUL'dan Prof. Agnieszka Ścibior'a teşekkür ediyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-hidroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-hidroksiantranilik asitSigma-Aldrich148776% 97
3-nitro-L-tirozinSigma-AldrichN7389
AsetonitrilSupelco1.00029LC-MS LiChrosolv
için hipergrade Aktif kömürSupelco05105tozu
Analitik teraziOhaus
Analitik sütunAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 hızlı çözünürlük HT (2,1 x 100 mm, 1,8 & mikro; m)
amonyum formatSupelco7022eluent katkı maddesi; % 99,0
Sığır SerumuAlbümin Sigma1001887398
Kromatografik şişeler için kapaklarAgilent Technologies5185-5820mavi vidalı kapaklar, PTFE / kırmızı sil sepa
Hücre kültürü kabıYuva704004polistiren, pirojenik olmayan, steril
Hücre kültürü plakasıBiologix07-601212 kuyulu, pirojenik olmayan, toksik olmayan, steril
Hücre inkübatörüThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
SantrifüjEppendorfmodel 5415R
SantrifüjEppendorfmodel 5428
Santrifüj tüpleriBionovoB-2278Eppendorf tipi, 1,5 mL
Santrifüj tüpleriBionovoB-3693Falcon tipi, 50 mL, PP
Kromatografik veriler satın alma ve analiz yazılımıAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Kromatografik kesici uç şişeleriAgilent Technologies9301-1387100 & mikro; L
Kromatografik şişelerAgilent Technologies5182-07142 mL, şeffaf cam
Dimetil sülfoksitSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)PANBiotech P04-41450
Çift metre pH/iletkenlikMettler ToledoSevenMulti
EvaporatörGenevacmodeli EZ-2.3 Elite
Fetal sığır serumuSigma-AldrichF9665
LC-MS LiChropur içinformik asitSupelco5.33002
Reaktiflerin depolanmasıiçin cam şişeBionovoS-207050 mL, şeffaf cam
Koruma kolonuAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Dar Delikli Koruma Kolonu (2,1 x 12,5 mm, 5 &mikro; m)
Hidroklorik asitMerck1.00317.1000
L-kinüreninSigma-AldrichK8625& ge; %98 (HPLC)
Manyetik karıştırıcıWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledomodel XP6
Milli-Q sistemiMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV Pompalı
Dört kutuplu kütle spektrometresiAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penisilin-StreptomisinSigma-Adrich048M4874V
Plaka okuyucuBio TekSynergy 2, Gen5
Potasyum klorürMerck1.04936.1000
Potasyum dihidrojen fosfatMerck1.05108.0500
Protein Testi Boya Reaktif KonsantresiBioRad500-0006
Tahterevalli külbütörStuartSSL4
Serolojik pipetYuva3260015 mL, polistiren, pirojenik olmayan, steril
Sodyum klorürSigma-Aldrich7647-14-5
Sodyum fosfat dibazikMerck1.06346.1000
Solvent giriş filtresiAgilent Technologies5041-2168cam filtre, 20 & mu; m gözenek boyutu
Solvent haznesi (LC-MS için)Agilent Technologies9301-65241 L, şeffaf cam
Solvent haznesi (LC-MS için)Agilent Technologies9301-65261 L, amber
cam Elektronik tablo programıMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
Karıştırma çubuğuBionovo6-2003teflon kaplı
Kültür için şırınga filtreleri orta filtrasyonBionovo7-8803rejenere selüloz, Ø 30 mm, 0,45 &mikro; m
Mobil faz bileşenleri filtrasyonu için şırınga filtreleriBionovo6-0018naylon, Ø 30 mm, 0,22 &mikro; m
Doku kültürü plakalarıVWR10062-90096 kuyulu, steril
Tripsin-EDTA ÇözeltisiSigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sistemiAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity sistemi, otomatik numune alma cihazı (G1367D), gaz giderici (G1379B), ikili pompa (G1312B), kolon termostatından (G1316C)
oluşuyorduUltrason banyosuPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 artı
Ksantorenik asitSigma-AldrichD120804% 96
LC-MS, LiChropur, vb. için tarafından işletilir

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kynurenine QuantificationLiquid ChromatographyMass SpectrometryCancer Cell CultureSample PreparationCalibration CurveSingle Ion MonitoringProtein NormalizationQuality ControlInternal Standard

Related Articles