Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

Summary

Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Abstract

Kynurenine yolu ve kynurenines adı verilen triptofan katabolitleri, bağışıklık düzenlemesi ve kanser biyolojisinde rol almaları nedeniyle daha fazla ilgi gördü. Bir in vitro hücre kültürü testi genellikle farklı triptofan katabolitlerinin bir hastalık mekanizmasına katkısı hakkında bilgi edinmek ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılır. Salgılanan metabolitler ve sinyal molekülleri bakımından zengin olan hücre kültürü ortamı triptofan metabolizmasının ve diğer hücresel olayların durumunu yansıtır. Karmaşık hücre kültürü ortamında birden fazla kynureninin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için yeni protokoller, birden fazla numunenin güvenilir ve hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin vermek için arzu edilir. Bu, kütle spektrometresi ile birleştiğinde sıvı kromatografisi ile gerçekleştirilebilir. Bu güçlü teknik metabolitlerin nicelleştirilmesi için birçok klinik ve araştırma laboratuvarında kullanılır ve kynurenines ölçümü için kullanılabilir.

Burada sunulan, in vitro kültürlü kanser hücrelerinden toplanan ortamda dört kynureninin, yani kynurenine, 3-hidroksisinurenin, 3-hidroksiranilik ve ksantrinik asidin eşzamanlı belirlenmesi için tek dörtlü kütle spektrometresi (LC-SQ) ile birleştirilmiş sıvı kromatografinin kullanımıdır. SQ dedektörünün kullanımı kolaydır ve diğer kütle spektrometrelerine kıyasla daha ucuzdur. SQ-MS analizinde, numuneden birden fazla iyon oluşturulur ve belirli kütle-şarj oranlarına(m/z)göre ayrılır ve ardından Tek İyon İzleme (SIM) modu kullanılarak tespit edilir.

Bu makale, bildirilen yöntemin avantajlarına dikkat çeker ve bazı zayıf noktaları gösterir. Kromatografi ve kütle spektrometresi analizi ile birlikte numune hazırlama dahil olmak üzere LC-SQ analizinin kritik unsurlarına odaklanmıştır. Kalite kontrol, yöntem kalibrasyon koşulları ve matris etkisi konuları da tartışılmaktadır. 3-nitrotirozinin basit bir uygulamasını tüm hedef analitler için bir analog standart olarak tanımladık. İnsan yumurtalık ve meme kanseri hücreleri ile yapılan deneylerle doğrulanan LC-SQ yöntemi güvenilir sonuçlar üretir ve diğer in vitro hücresel modellere daha fazla uygulanabilir.

Introduction

Kynurenine pathway (KP), insan hücrelerinde triptofan (Trp) katabolizmanın ana yoludur. Ekstrahepatik hücrelerde indoleamin-2,3-dioksijenaz (IDO-1) KP'nin ilk ve sınırlayıcı enzimidir ve Trp'yi N-formilkynurenine^1'edönüştürür. KP içindeki diğer adımlar, diğer ikincil metabolitleri, yani çeşitli biyolojik özellikler gösteren kynureninleri oluşturur. Kynurenine (Kyn), aryl hidrokarbon reseptörüne (AhR) bağlandıktan sonra toksik özellikleri gösteren ve hücresel olayları düzenleyen ilk kararlı Trp katabolitidir². Daha sonra, Kyn kendiliğinden veya enzim aracılı süreçlerde çeşitli moleküllere dönüştürülür ve 3-hidroksiynureni....

Protocol

1. Standart 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standart stok çözümlerinin hazırlanması

1. Reaktifleri bir şişede en yüksek doğrulukta (her biri 0,3 mg) tartın. Daha iyi doğruluk için, çözücünün hacmini adım 1.2'ye göre ayarlayarak reaktifleri ölçeklendirin.
2. 1 g/L stok çözeltisi elde etmek için çözücünün 300 μL'sinde reaktifleri çözün. Dimetil sülfitte (DMSO) Kyn, 3HAA ve XA; Hidroklorik asit (HCl) ile pH 2.5'e asitlenmiş suda 3HKyn.
   DİkKAT: 3HAA gözleri, burnu, boğazı ve akciğerleri tahriş eder. Solunduğunda, ciltle temas ettiğinde ve yutulduğunda zararlıdır. Eldiven ve maske gibi uygun korumayı takın.
3. Şişeyi sıkıca kapatın ve çözünmeyi hızlandırm....

Results

LC-MS, karmaşık örneklerin bazı bileşenleri matris etkilerine neden olsa ve analitlerin iyonlaşmasını tehlikeye atsa da, biyolojik olarak aktif moleküllerin ölçülmesinde tartışılmaz avantajlar sunar. İyon bastırmaya veya iyon geliştirmesine yol açar, doğruluğu güçlü bir şekilde azaltır ve yöntemin ''zayıf' bir noktası olarak kabul edilen LC-MS'in tespit / nicelifikasyon sınırını etkiler. Protokolümüzde, iyonlar, Trp metabolitleri belirleme¹³ile ilgili diğer çalışmalarda da kullanılan pozitif modda.......

Discussion

Bu makale, in vitro kültürlü insan kanser hücrelerinden bir ortamda ölçülen dört ana Trp metabolitinin (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) eşzamanlı nicelemesi için ayrıntılı bir LC-SQ protokolü sunun. Analizdeki en önemli noktalar olan numune hazırlama, kromatografik/kütle spektrometresi prosedürü ve veri yorumlamaya özel önem verilir.

Genel olarak, LC-MS analizi, yüksek hassasiyet nedeniyle, kullanılan malzemelerin protokol katılığı ve saflığının en yüksek standartlarını gerektirir. Standart pro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hidroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
3-hidroksiantranilik asit	Sigma-Aldrich	148776	% 97
3-nitro-L-tirozin	Sigma-Aldrich	N7389
Asetonitril	Supelco	1.00029	LC-MS LiChrosolv
için hipergrade Aktif kömür	Supelco	05105	tozu
Analitik terazi	Ohaus
Analitik sütun	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 hızlı çözünürlük HT (2,1 x 100 mm, 1,8 & mikro; m)
amonyum format	Supelco	7022	eluent katkı maddesi; % 99,0
Sığır Serumu	Albümin Sigma	1001887398
Kromatografik şişeler için kapaklar	Agilent Technologies	5185-5820	mavi vidalı kapaklar, PTFE / kırmızı sil sepa
Hücre kültürü kabı	Yuva	704004	polistiren, pirojenik olmayan, steril
Hücre kültürü plakası	Biologix	07-6012	12 kuyulu, pirojenik olmayan, toksik olmayan, steril
Hücre inkübatörü	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
Santrifüj	Eppendorf		model 5415R
Santrifüj	Eppendorf		model 5428
Santrifüj tüpleri	Bionovo	B-2278	Eppendorf tipi, 1,5 mL
Santrifüj tüpleri	Bionovo	B-3693	Falcon tipi, 50 mL, PP
Kromatografik veriler satın alma ve analiz yazılımı	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Kromatografik kesici uç şişeleri	Agilent Technologies	9301-1387	100 & mikro; L
Kromatografik şişeler	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, şeffaf cam
Dimetil sülfoksit	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)	PAN	Biotech P04-41450
Çift metre pH/iletkenlik	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporatör	Genevac		modeli EZ-2.3 Elite
Fetal sığır serumu	Sigma-Aldrich	F9665
LC-MS LiChropur için	formik asit	Supelco	5.33002
Reaktiflerin depolanması	için cam şişeBionovo	S-2070	50 mL, şeffaf cam
Koruma kolonu	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Dar Delikli Koruma Kolonu (2,1 x 12,5 mm, 5 &mikro; m)
Hidroklorik asit	Merck	1.00317.1000
L-kinürenin	Sigma-Aldrich	K8625	& ge; %98 (HPLC)
Manyetik karıştırıcı	Wigo		ES 21 H
Microbalance	Mettler Toledo		model XP6
Milli-Q sistemi	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV Pompalı
Dört kutuplu kütle spektrometresi	Agilent Technologies	G1948B	model 6120
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Adrich	048M4874V
Plaka okuyucu	Bio Tek		Synergy 2, Gen5
Potasyum klorür	Merck	1.04936.1000
Potasyum dihidrojen fosfat	Merck	1.05108.0500
Protein Testi Boya Reaktif Konsantresi	BioRad	500-0006
Tahterevalli külbütör	Stuart	SSL4
Serolojik pipet	Yuva	326001	5 mL, polistiren, pirojenik olmayan, steril
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodyum fosfat dibazik	Merck	1.06346.1000
Solvent giriş filtresi	Agilent Technologies	5041-2168	cam filtre, 20 & mu; m gözenek boyutu
Solvent haznesi (LC-MS için)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, şeffaf cam
Solvent haznesi (LC-MS için)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, amber
cam Elektronik tablo programı	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Karıştırma çubuğu	Bionovo	6-2003	teflon kaplı
Kültür için şırınga filtreleri orta filtrasyon	Bionovo	7-8803	rejenere selüloz, Ø 30 mm, 0,45 &mikro; m
Mobil faz bileşenleri filtrasyonu için şırınga filtreleri	Bionovo	6-0018	naylon, Ø 30 mm, 0,22 &mikro; m
Doku kültürü plakaları	VWR	10062-900	96 kuyulu, steril
Tripsin-EDTA Çözeltisi	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sistemi	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity sistemi, otomatik numune alma cihazı (G1367D), gaz giderici (G1379B), ikili pompa (G1312B), kolon termostatından (G1316C)
oluşuyorduUltrason banyosu	Polsonic	104533	model 6D
Vortex	Biosan		model V-1 artı
Ksantorenik asit	Sigma-Aldrich	D120804	% 96