Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift
Bu makalede
Özet
Özet
Rahim elektroporasyonunda, memeli kortikogenezinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için yaygın olarak kullanılan in vivo DNA transfer tekniğidir. Bu prosedür ilgi DNA giriş sağlamak için beyin ventrikülleri yararlanır ve venörl astar hücrelere genetik malzemenin girişini yönlendirmek için elektrotlar bir çift kullanır, nöral kök hücreleri. Bu yöntem, araştırmacıların istenilen hücreleri etiketlemelerine ve/veya bu hücrelerdeki ilgi genlerinin ekspresyonunu manipüle etmesine olanak tanır. Nöronal göçü, soy takibini ve aksonal yol bulmayı hedefleyen tahliller de dahil olmak üzere birden fazla uygulaması vardır. Bu yöntemin önemli bir özelliği, embriyonik öldürücülük veya belirli CRE sürücü farelerin eksikliği ile ilgili potansiyel sorunların circumvention sağlayan, onun zamansal ve bölgesel kontrol. Bu tekniğin bir diğer ilgili yönü de, farklı gelişimsel yaşlarda beynin uzak bölgelerinde ortaya çıkan hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesinde özellikle önemli hale gelen yeni fare hatlarının oluşumunu içeren ekonomik ve zamansal sınırlamaların önemli ölçüde azaltılmasına yardımcı olmasıdır. Burada, mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının hedeflemesini sağlayan çift elektroporasyon stratejisini açıklıyoruz. Bu yaklaşımla farklı konumlardaki farklı hücre alt tiplerini, onları görselleştirmek için seçili floresan proteinlerle etiketleyebilir ve/veya bu farklı hücrelerin ifade ettiği ilgi genlerini uygun zamanlarda manipüle edebiliriz. Bu strateji rahim elektroporasyon potansiyelini artırır ve yakın temas kurmak için göç zamansal ve mekansal olarak ayrılmış hücre popülasyonlarının davranışını incelemek için güçlü bir araç sağlar, yanı sıra aksonal projeksiyonlar yoluyla uzun menzilli etkileşimler, zamansal ve ekonomik maliyetleri azaltarak.
Giriş
Serebral korteks çok karmaşık ve karmaşık organize bir yapıdır. Organizasyon böyle bir dereceye ulaşmak için, kortikal projeksiyon nöronlar kendi zamansal nesil gerektiren karmaşık gelişimsel süreçler geçmesi, kortikal plaka nihai hedefe göç, ve kısa ve uzun menzilli bağlantıların kurulması1,2. Uzun bir süre, kortikogenez çalışma için klasik yol ilgi genlerin nakavt veya knock-in murine modellerinin kullanımına dayanıyordu. Ancak, bu strateji, ve özellikle koşullu nakavt farelerin kullanımı, zaman alıcı ve pahalı, ve bazen diğer konular arasında, genetik fazlalık veya belirli CRE sürücülerin eksikliği varlığı ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan prosedür, deneyden sorumlu etik komite, Universidad de Valencia ve Conselleria de Agricultura'nın hayvan refahı, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Comunidad Valenciana'dan Transición Ecológica ve İspanyol mevzuatının 53/2013 tarihli Real Decreto'da ve Avrupa Parlamentosu ve Konsey Konseyi'nin 2010/63/AB direktifinde gözden geçirilen Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bilimi Konseyi 'nin (ICLAS) yönergelerine bağlıdır.
NOT: Bu protokol iki farklı amacı içerir: 1) ilk çalışma, "strateji A" olarak anılacaktır, Cajal-Retzius hücreleri (CR-hücreleri) ve aynı beyin yarımküreiçinde erken doğan kortikal projeksiyon nöronlar ara....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Komşu hücreler arasındaki etkileşimler distal yerlerde ve farklı zamanlarda ortaya çıkmıştır: Cajal-Retzius hücreleri (CR hücreleri) ve erken göç eden kortikal projeksiyon nöronlar (strateji A)
CR-hücrelerinin ve erken kortikal projeksiyon nöronların etkileşimi daha önce nektin ve kadherin adezyon molekülleri ile somal translokasyon düzenlemek için gerekli olarak tanımlanmıştır8 . CR-hücreleri pallium kenarlarında nöroepitel kaynaklanır ve korteksin en .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Serebral korteks gibi yüksek hücresel yoğunluğa sahip bölgelerde in vivo hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesi karmaşık bir iştir. Nöritleri etiketlemek için antikor kullanımını içeren geleneksel yaklaşımlar, farklı hücre popülasyonları için özel belirteçlerin olmaması nedeniyle uygun değildir. Belirli bir hücre tipinin floresan proteini ifade ettiği transgenik murine modellerinin kullanımı, nöronal süreçleri görselleştirmek için yararlıdır, ancak bu tür modellerin kullanılabilirliğine bağlıdır. Bu görev, iki özel hüc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar Cristina Andrés Carbonell ve Universidad de Valencia Hayvan Bakım tesisi üyeleri teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Isabel Fariñas ve Sacramento R. Ferrón'a reaktifler ve ekipmanlarının bizimle paylaşılması için teşekkür etmek istiyoruz. I.M.W, Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D tarafından ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) tarafından finanse edilmektedir. C.Gil-Sanz, İspanya Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades'ten (MICINN) Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) aldı. Bu çalışma RYC-2015-19058 ve SAF2017-82880-R (MICINN) tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ampisilin sodyum tuzu | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspiratör tüpü | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Bebek karıştırıcı hemostat (perfüzyon) | Güzel Bilim Araçları (FST) | 13013-14 | |
| Borosilikat cam kılcal | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorfin (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | ||
| CAG-BFP plazmidi | Lütfen U.Mü tarafından sağlanmıştır; ller Lab | ||
| CAG-EGFP plazmidi | Lütfen U.Mü tarafından sağlanmıştır; ller Lab | ||
| CAG-mCherry plazmidi | Lütfen U.Mü tarafından sağlanmıştır; ller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plazmidi | Lütfen U.Mü tarafından sağlanmıştır; ller Lab | ||
| Konfokal mikroskop | Olympus | FV10i | |
| Pamuklu Çubuklar | BFHCVDF | ||
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | B. Braun Cerrahi | 1050044 | |
| Diseksiyon kapsamı | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forseps #5 İnce Forseps | Güzel Bilim Araçları (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Kare Dalga Elektroporatörü | BTX | 45-0052 | |
| Elektrikli Tıraş Bıçağı | Oster | 76998 | |
| Endotoksin içermeyen TE tamponu | QIAGEN | 1018499 | |
| Etanol mendiller | BFHCVDF | ||
| Ekstra İnce Graefe Forseps | Güzel Bilim Araçları (FST) | 11150-10 | |
| Göz merhemi | Alcon | 682542.6 | |
| Hızlı Yeşil Boya | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| İnce Makas | Güzel Bilim Araçları (FST) | 14069-09 | |
| Floresan LED'ler | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plazmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Sivrisinek Hemostatları (sütür) | Güzel Bilim Araçları (FST) | 91308-12 | |
| Isıtma Yastığı | UFESA | AL5514 | |
| Ters epifloresan mikroskobu | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| İyot mendilleri | Lorsoul | ||
| İzofloran buharlaştırıcı | Akış Ölçer, | A15B5001 İzofluran | |
| , | Karizoo | 586259 | |
| Ketamin (Anastemin) | Fatro Ibé rica SL | 583889-2 | |
| Kimtech hassas mendil | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) suyu GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Düşük erime noktalı agaroz | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidin (Yatıştırıcı) | Dechra | 573749.2 | |
| Mikroskop lameller | Menel-Glä ser | 15747592 | |
| Mikroskop Slaytları | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Montaj ortamı Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 17984-25 | |
| Mutiwell plakaları (24) | SPL Yaşam Bilimleri | 32024 | |
| Mutiwell plakaları (48) | SPL Yaşam Bilimleri | 32048 | |
| NaCl (tuzlu çözelti için) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| İğne 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital inkübatör S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta İnkübatör | J. P. Selecta, s.a. | ||
| Paraformaldehit | PanReac Applied Chem | A3813 | |
| Penisilin-Streptomisin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltik perfüzyon pompası | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platin Cımbız, 5 mm Çap | Btx | 45-0489 | |
| Refleks Cilt Kapatma Sistemi - 7mm Klips, 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Refleks Cilt Kapatma Sistemi - Klips Uygulayıcı, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Halka Forseps | Güzel Bilim Araçları (FST) | 11103-09 | |
| Sodyum azid | PanReac Applied Chem | 122712-1608 | |
| Cerrahi emici ped (steril) | HK Cerrahi | PD-M | |
| Sütür (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Sütür Malzemeleri | ||
| Şırınga 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Doku Kültürü Kabı 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Dikey Mikropipet Çektirme | Sutter Aleti Co | P-30 | |
| Dikey mikroskop | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratom | Leica | VT1200S |
Kaynaklar
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During D....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
