Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Jasmine  L. Madrigal; Melissa  K. Jones

doi:10.3791/61048

Yöntem makalesi

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

DOI:

10.3791/61048

⸱

29 Nisan 2020

Jasmine L. Madrigal¹ , Melissa K. Jones¹

¹Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kommensal bakteriler ökaryotik virüslerin enfeksiyonunu etkilemek için iyi kurulmuştur. Patojen ve konak mikrobiyom arasında doğrudan bağlanma bu virüslerin çoğu için enfeksiyon değiştirme sorumludur. Bu nedenle, virüs-bakteri bağlanmasının doğası nın karakterize ilerlediği, bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirdiği mekanizmanın (lar) aydınlatılabilmek için gerekli temel bir adımdır. Insan norovirüs için, kommensal bakteriler B hücre enfeksiyonu geliştirmek. Virüs doğrudan bu bakterilere bağlanır, bu doğrudan etkileşim enfeksiyon geliştirme mekanizması nda yer aldığını gösteren. Radyoetiketli virüslerin sinilasyon sayımı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bakteri ve virüsler arasındaki etkileşimleri ölçmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Her iki yöntem de laboratuvarda oluşturulması gerekebilir canlı virüs, kullanımını gerektirir. Şu anda, insan norovirüs için mevcut kurulan in vitro kültür sistemlerinin hiçbiri son derece konsantre viral stokların üretimi için izin vermek için yeterince sağlam. Canlı virüs yerine, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılmıştır. Burada bir akış sitometri yöntemi gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere VLP bağlayıcı ölçmek için virüs özgü antikorlar kullanır ile açıklanmıştır. Sadece bakterilerin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi, arka plan antikor bağlanmasını ve TEST EDILEN bakterilere VLP ekinin doğru nicelemeyi azaltmak için tahminin optimizasyonuna izin ver. Yüksek VLP:bakteri oranları VLP'lerin bakteri popülasyonunun büyük yüzdelerine bağlanmasına neden olur. Ancak, VLP miktarları azaldığında, bakterilerin yüzde bağlı da azalır. Sonuç olarak, bu yöntem norovirüs düzenleyen belirli koşulları ve yapısal bileşenleri açıklığa kavuşturan gelecekteki deneylerde kullanılabilir: bakteri etkileşimleri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan norovirüsler (HuNoVs) gastrointestinal hastalığın dünya çapında önde gelen nedeni, 685 milyon enfeksiyonlar ve 200.000 üzerinde ölümher yıl¹sorumlu. Diğer enterik virüsler gibi, kommensal bakterilerin varlığı bu patojen enfeksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir yanı sıra onun vekil virüs, murine norovirus²^,³. Ayrıca bakterilerin insan norovirüs^4,^5,⁵^,⁶tarafından enfeksiyonu inhibe edebilir çelişkili raporlar vardır. Çeşitli virüsler için, virüs ve bakteriler arasındaki doğrudan etkileşim....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Protokolde belirtilen bakteriyel büyüme koşulları Enterobacter cloacae ve Lactobacillus gasseriiçin standart kültür koşullarıdır. Virüsün diğer bakteri türleri ile bakteri eki testi gerçekleştirmek için, seçilen bakteriler bakteri için uygun standart koşullar altında kültürlü olmalıdır.

1. Bakteriyel Büyüme Ortamının Hazırlanması

Enterobacter cloacae büyüme ortamı
1. 10 g tripton, 5 g maya ekstresi ve 10 g sodyum klorür (NaCl) 1 L'lik de-iyonize (DI) suda eriterek sıvı ortamı hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu). Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayar....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'yi ölçmek için kullanılan gating stratejileri Şekil 1'degösterilmiştir. Temsili yoğunluk nokta, hücresel enkaz ve hücre kümelerini ortadan kaldırmak için numunelerin nasıl geçitlendiğine genel bir bakış sağlar, böylece VLP eki tekli popülasyonlarda belirlenir(Şekil 1A). Temsili histogramlar, sadece norovirüs VLP'si olmayan bakterilerde düşük anti-norovirüs antiko.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enterik virüslerin bakterilere bağlanmasını ölçebilme yeteneği, bu bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirme mekanizmalarını açıklamak için kritik bir ilk adımdır. Burada açıklanan yöntemler hem E. cloacae (gram-negatif bakteri) hem de L. gasseri (gram-pozitif bakteri) ile insan norovirüs VLP etkileşimlerini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak herhangi bir memeli virüsü ve ilgi bakterisi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. VLPs ek tahlillerde kullanılmak üzere virüs .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sutonuka Bhar ve Chanel Mosby-Haundrup'a yazılı el yazmasının eleştirel incelemesi için teşekkür etmek istiyoruz, ayrıca Alfonso Carrillo'ya bakteriyel standart eğriler üretme konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (R21AI140012) bir hibesi ve Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü'nden bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre Süzgeç Kapaklı 5ml Polistren Yuvarlak Tabanlı Tüpler	Corning	352235	Antikor boyamadan sonra, numune akış sitometrisi analizi için tüplere aktarılır.
Agar	Sigma	A7002	Ortam hazırlama için kullanılır
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	Lactobacillus gasseri kültürü için kullanılan anaerobik gaz paketi
BD FacsDiva yazılımı
BD LSR Fortessa akış sitometresi
Sığır Serumu Albümin	Fisher Biyoreaktifleri	BP1605	Akış sitometrisi için kullanılır
Akış Sitometrisi Leke Tamponu (FCSB)	BD Biosciences	554657	Akış sitometrisi
Fare, IgG2b, kappa İzotip Kontrolü (eBMG2b), PE, eBioscience,	Thermo Fisher, Scientific	12473281	İzotip kontrolü için kullanılır. Bu antikor, üreticiden konjuge formda satın alınır.
MRS Powder	BD Biosciences	288130	Besiyeri hazırlama ve Lactobacillus gasseri'yi kültürlemek için kullanılır.
Norovirüs kapsid G2 Monoklonal Antikor (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Norovirüs GII antikoru. Bu antikor sadece konjuge olmayan formda mevcuttur ve bu nedenle belirtilen akış sitometrisi tahlillerinde kullanılmadan önce floresan olarak konjuge edilmelidir. Bu protokolde, PE seçilen flordu, ancak diğer floresan molekülleri, araştırmacı tarafından kullanılan akış sitometresine en uygun şekilde seçilebilir.
Norovirüs GII.4 VLP	Yaratıcı Biyoyapı	CBS-V700	insan norovirüs virüsü benzeri parçacık, VLP'ler bakulovirüs sistemi kullanılarak üretildi ve %10 gliserol ile fosfat tamponlu salin içinde yeniden süspanse edildi. Yazarlar, VLP'lerin parçacık konsantrasyonunu belirlemek için bağımsız nanosight izleme analizi gerçekleştirdiler. Konsantrasyon, mililitre başına yaklaşık 10^{11< / sup> VLP'dir. VLP'lerin protein konsantrasyonuna bağlı olarak, VLP bağlanma deneylerinde bakteri başına yaklaşık 200 parçacık eklenir.}
PBS 10X	Fisher Biyoreaktifleri	BP665	Kullanmadan önce 1X'e kadar seyreltin.
SiteClick R-PE Antikor Etiketleme Kiti	Thermo Fisher Scientific	S10467	Konjuge olmayan antikorun lablenasyonu için kullanılan konjugasyon kiti.
Sodyum Klorür	Fisher Scientific	S271	Ortam hazırlama için kullanılır
Tripton	Oksoit	LP0042	Ortam hazırlama için kullanılır
Tüp Revolver	ThermoFisher Scientific	88881001	Virüs: bakteri bağlanma tahlilinde kullanılır. Maksimum hıza (40 rpm) ayarlayın.
Maya Özü	BD Biosciences	212750	Ortam hazırlama için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norov....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Norovir s VLP leri Vir s Bakteri Ba lanmas Bakteriyel Y zey Yap lar Antikor Boyama Seri Dil syon Koloni Olu turan Birimler Gram Negatif Bakteriler

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler